CN110343621A - 一种棘孢木霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种棘孢木霉菌株，所述棘孢木霉菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW‑6ml，保藏编号为CCTCC NO：M 2018918，还提供了应用，用于促进植物幼苗生长，用于防治草莓炭疽病和甘蓝黑腐病。本发明的棘孢木霉菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW‑6ml，能够促进植物幼苗生长，并且能够防治草莓炭疽病和甘蓝黑腐病，对环境友好，安全、无害、无污染，通过灌根接种的方式，不仅防治了草莓炭疽病和甘蓝黑腐病，而且还具有促进幼苗生长的作用，株高、根长、根鲜重、茎叶鲜重和总鲜重均得到了提高，提高了产量。

Description

一种棘孢木霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害及微生物农业技术领域，具体涉及一种 棘孢木霉菌株及其应用。
背景技术
草莓炭疽病strawberry anthracnose是制约我国草莓生产的三大真菌性 病害之一(魏彩燕等，2010)，主要危害地上部分的叶片和果实，叶片发 病病斑黑褐色，浆果发病产生近圆形淡褐至暗褐色病斑，软腐状并凹陷(何 永梅和徐红辉，2015)，草莓炭疽病属高温高湿型病害，7～9月间在高温 高湿条件下，病菌传播蔓延迅速，一般可造成草莓减产25％～30％，严重 可达到80％(Denoyes and Baudry，1995；胡德玉等，2014)。草莓炭疽病 属于系统性病害，病原菌能够通过根向上侵染传播(赵玳琳等，2016)。近 年来，由于连作年限的延长，该病害也日趋加重，防治难度加大，严重制 约草莓种植业可持续发展。
甘蓝黑腐病是由黄单胞杆菌属(Xanthommonas Campestris pv. Campeslris(Xcc))(Mguni,1996；Liu et al.,2016)引起的甘蓝的一种毁 灭性病害，主要危害甘蓝外围叶片，幼苗和成株，幼苗染病，子叶呈水浸 状，逐渐枯死，成株发病多从叶缘开始，形成“V”字形黄褐色病斑，边 缘有黄色晕环，病斑扩大后常出现叶斑和叶脉变黑，直接影响植株光合作 用，也能侵害叶球或球茎，叶球发病时病斑淡黑色，局部的叶脉变紫黑色 并逐渐扩大，但不会软化腐败，该病在田间发病严重时可造成植株大量死 亡，直接影响生产效益(陈茂春,2015；梁元凯等,2016)。
抗病品种和化学农药防治通常是植物病害综合防治中常用的方法。然 而，目前还很少有成功的多抗品种，化学药剂由于内吸性差、农药残留、 环境污染、抗药性、对人体有害等方面的原因也不是防治植物病害的最佳 选择。生物防治将提供一条防治植物病害的新的途径，弥补化学农药在病 害防治上的不足。
木霉菌(Trichodrema spp.)是一种丝状真菌，属半知菌亚门、从梗孢 目、从梗孢科，是一种分布广泛的土壤习居菌，具有生长繁殖速度快、环 境适应能力强、能够与致病菌形成拮抗作用，促进植物生长和提高植物抗 性等优势，是目前研究和应用最多的植物病害生防真菌之一。木霉是自然 界普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物。木霉菌可以通过营养竞争、重寄 生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等作用机制，达到抑制病害的目 的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种 棘孢木霉菌株及其应用，该棘孢木霉菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml，能够促进植物幼苗生长，并且能够防治草莓炭疽 病和甘蓝黑腐病，对环境友好，安全、无害、无污染，通过灌根接种的方 式，不仅防治了草莓炭疽病和甘蓝黑腐病，而且还具有促进幼苗生长的作 用，株高、根长、根鲜重、茎叶鲜重和总鲜重均得到了提高，提高了产量。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种棘孢木霉菌株， 所述棘孢木霉菌株命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml， 保藏编号为CCTCC NO：M2018918，保藏单位为中国典型培养物保藏中 心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路珞珈山，保藏日期为2018年12月 24日。
优选地，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了上述的棘孢木霉菌株的应用，所述棘孢木霉菌株用于 促进植物幼苗生长。
优选地，所述植物为黄瓜、甘蓝、万寿菊或草莓。
本发明还提供了上述的棘孢木霉菌株的应用，所述棘孢木霉菌株用于 防治草莓炭疽病。
本发明还提供了上述的棘孢木霉菌株的应用，所述棘孢木霉菌株用于 防治甘蓝黑腐病。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明提供了一种棘孢木霉菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml，能够促进植物幼苗生长，并且能够防治草莓炭疽病和甘蓝黑 腐病，对环境友好，安全、无害、无污染，通过灌根接种的方式，不仅防 治了草莓炭疽病和甘蓝黑腐病，而且还具有促进幼苗生长的作用，株高、 根长、根鲜重、茎叶鲜重和总鲜重均得到了提高，提高了产量。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
本实施例为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的分离、 纯化、鉴定、筛选和保藏：
(一)分离、纯化的步骤为：
S1、取5g贵州省贵阳市花溪区贵州省农业科学院森林根际表皮土壤、 50mL的无菌水和10g直径为3mm的玻璃珠加入到灭菌三角瓶中，在转速 为160转/min的摇床上振荡30min，得到土悬液a；
S2、将5mL的S1中得到的土悬液a用45mL的无菌水稀释，得到土 悬液b；
S3、取1mL的土悬液b用9mL无菌水稀释，得到土悬液c、取1mL 的土悬液c用9mL无菌水稀释，得到土悬液d，取1mL的土悬液d用9mL 无菌水稀释，得到土悬液e；
S4、将S3中得到的土悬液c、土悬液d和土悬液e各100μL，分别 在木霉选择性培养基PDAm(所述木霉选择性培养基PDAm由以下重量份 的原料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂20份、氯霉素0.3份、 玫瑰红和蒸馏水1000份)上均匀涂布，超净工作台内吹至略干，每个浓 度的土悬液进行3个重复，置于温度为28℃的恒温箱中培养，待出现菌落 后挑取菌落边缘菌丝块于马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA(所述马铃薯葡萄 糖琼脂培养基PDA由以下重量份的原料制成：马铃薯200份、葡萄糖20 份、琼脂20份和蒸馏水1000份)上纯化培养，获得纯培养木霉菌菌株， 并分别编号保存。
(二)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的筛选
(1)采用对峙培养法，将S4中得到的木霉菌菌株的直径为5mm的 木霉菌菌饼和直径为5mm的菌株号为LC0220的草莓炭疽病病原菌 (Colletotrichumfragariae)菌饼接于直径为90mm的培养皿(含马铃薯葡 萄糖琼脂培养基PDA)边缘，两菌饼相距5cm，将直径为5mm的草莓炭 疽病病原菌菌块接于培养皿(含马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA)边缘纯培 养作为对照，于温度为28℃的培养箱中培养，分别于培养3、5和7天后 观察木霉菌菌菌落对草莓炭疽病病原菌菌落的覆盖情况并测量对照生长 量(菌落半径)和处理生长量(接种木霉菌后的抑制生长半径)，确定覆 盖指数和计算抑菌率。覆盖指数分级标准如下：
Ⅰ级：木霉菌菌菌落与草莓炭疽病病原菌菌落不接触，木霉菌菌菌丝 不能覆盖草莓炭疽病原菌菌落；
Ⅱ级：木霉菌菌菌丝覆盖草莓炭疽病病原菌菌落1/2以下，草莓炭疽 病病原菌菌落健康，颜色无变化；
Ⅲ级：木霉菌菌菌丝覆盖草莓炭疽病病原菌菌落1/2以上，并在草莓 炭疽病病原菌菌落上大量产孢，草莓炭疽病病原菌菌落萎缩，颜色变暗。
抑制率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100
经筛选得到对草莓炭疽病病原菌抑制作用最强的木霉菌菌菌株，命名 为木霉菌a。
(2)对筛选得到的木霉菌菌菌株a进行复筛:
①木霉菌a产生挥发性抑制物观察：采用対扣法培养，上下两皿之间 用灭菌玻璃纸隔开并封口，试验设置两个处理，上下两皿同时接种木霉菌 a和草莓炭疽病病原菌对扣作为第二个处理；接种木霉菌a 3d后接种草莓 炭疽病病原菌对扣作为第二个处理，分别于接种草莓炭疽病病原菌的3、5 和7天后观察木霉菌a是否有气味产生，测量草莓炭疽病病原菌菌落大小 计算其抑菌率，同时在普通光学显微镜下观察草莓炭疽病菌病原菌菌丝体 是否消解或者发生其他变异情况。
②木霉菌a对草莓炭疽病病原菌菌菌丝的融菌和寄生作用观察：于 PDA培养基中间放置一块20mm×20mm的灭菌盖玻片，于灭菌盖玻片两 侧且距盖灭菌盖玻片10mm处分别接种木霉菌a菌饼和草莓炭疽病病原菌 菌饼，于温度为28℃的培养箱中培养，分别于接种后12h、24h、36h、48h、 60h挑取带菌盖玻片(盖玻片上有菌丝)，于普通光学显微镜下观察木霉 菌a和草莓炭疽病病原菌菌丝间的作用方式，观察木霉菌菌丝是否通过接 触、缠绕和穿透草莓炭疽病病原菌的菌丝体，引起草莓炭疽病病原菌菌丝 体崩解，并拍照。
③木霉菌a对草莓炭疽病病原菌的抗生作用研究：将木霉菌a接种到 马铃薯葡萄糖培养基PDB(所述马铃薯葡萄糖培养基PDB由以下重量份 的原料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份和蒸馏水1000份)中，在温度 为25℃、摇速为160r/min的条件培养10d后用0.45μm微孔滤膜过滤得 无菌发酵滤液，将得到的无菌发酵滤液与温度为50℃～60℃的灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA按体积比为1：9混匀制备无菌发酵滤液平皿， 无菌发酵滤液平皿冷凝后，将直径为5mm的草莓炭疽病病原菌菌饼置于 无菌发酵滤液平皿的中央，作为处理组，以直径为5mm的草莓炭疽病病 原菌菌饼接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA为对照组，于25℃暗培养， 于接种后第3、5和7天计算发酵液对病原菌的相对抑菌率，并通过普通 光学显微镜观察木霉菌a发酵液处理后草莓炭疽病菌病原菌菌丝体是否有 消解现象。
重复进行复筛，通过大量筛选工作得到一株具有高效拮抗草莓炭疽病 病原菌的木霉菌，命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml， 且棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GYSW-6ml对草莓炭疽病病原菌生 物防机制主要是：竞争作用、融菌作用、寄生作用和抗生作用，草莓炭疽 病病原菌具有较强的寄生作用；
棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml对草莓炭疽病菌(Colletotrichumfragariae)具有较强的抗生作用，能够通过产生次生代谢 产物融化草莓炭疽病菌病原菌菌丝，使草莓炭疽病菌病原菌菌丝体消解； 棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GYSW-6ml菌丝通过接触、缠绕和穿 透草莓炭疽病病原菌的菌丝体，引起草莓炭疽病病原菌菌丝体崩解。
(二)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的鉴定：
(1)形态学鉴定：在PDA培养基平板上，菌落正面分生孢子密集， 不产生色素，无明显气味；分生孢子梗上的瓶梗对称分布；分生孢子亚球 形。
(2)分子生物学鉴定：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml 的DNA的提取方法采用CTAB法提取真菌基因组，PCR扩增DNA的ITS 序列，得到扩增产物，将扩增产物经纯化后直接进行双向测序，扩增的ITS 基因序列提交NCBI上的BLAST程序分析，鉴定为棘孢木霉菌 (Trichoderma asperellum)，命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml；
PCR扩增引物序列为ITS1引物和ITS4引物，所述ITS1引物的核苷 酸序列为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，所述ITS4引物的核苷酸 序列为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
PCR扩增的反应体系为：2×PCR反应预混液10μL，浓度为10μmol/L 的引物ITS1引物1μL、浓度为10μmol/L的ITS4引物1μL，DNA模板 1μL，以重蒸去离子水补充体积至25μL；
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火 30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃终止；
所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的16S rDNA序 列如SEQ IDNO:1所示。
(三)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml的保藏：
将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml保藏于中国典型培 养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路珞珈山，保藏编号为 CCTCCM2018918GYSW-6ml，保藏日期为2018年12月24日。
实施例2
本实施例为实施例1所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml的应用，用于植物幼苗生长，所述植物幼苗为黄瓜幼苗、甘蓝 幼苗、万寿菊幼苗和草莓幼苗。
试验植物为黄瓜、甘蓝、万寿菊和草莓，所述黄瓜得的品种为新泰密 刺，所述甘蓝的品种为中甘21号，所述万寿菊的品种为非洲万寿菊，所 述草莓的品种为红颜，试验在室内人工气候培养箱内进行，采用分生孢子 液盆栽灌根接种法。
(1)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml用于黄瓜幼苗 生长试验：
采用灌根接种法，将含1×106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液接种苗龄为1周的黄瓜幼苗(黄 瓜幼苗种植于装有育苗基质的72孔苗盘)，每株黄瓜幼苗接种1mL分生 孢子悬浮液，共接种3次，每间隔一周接种一次，作为处理组，处理组共 设置3个重复，每个重复有10株黄瓜幼苗，同时设置对照组，所述对照 组的黄瓜幼苗接种等量的灭菌蒸馏水。于25℃人工气候想内培养(喷水保 持湿润)30天后将植株整株完整挖出，测量植株株高和根长，并称量鲜重 (茎叶鲜重、根鲜重和总鲜重)，并计算接种了棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液的黄瓜幼苗与对照组比各指标的 增长率。
(2)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml用于甘蓝幼苗 生长试验：
采用灌根接种法，将含1×106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液接种苗龄为2周的甘蓝幼苗，每 株甘蓝幼苗接种1次5mL分生孢子悬浮液，作为处理组，处理组共设置3 个重复，每个重复有5株甘蓝幼苗，同时设置对照组，所述对照组的甘蓝 幼苗接种等量的灭菌蒸馏水。于25℃人工气候想内培养(喷水保持湿润) 30天后将植株整株完整挖出，测量植株株高和根长，并称量鲜重(茎叶鲜 重、根鲜重和总鲜重)，并计算接种了棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml的分生孢子悬浮液的甘蓝幼苗与对照组比各指标的增长率。
(2)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml用于万寿菊幼 苗生长试验：
采用灌根接种法，将含1×106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液接种苗龄为2周的万寿菊幼苗， 每株万寿菊幼苗接种1次5mL分生孢子悬浮液，作为处理组，处理组共 设置3个重复，每个重复有5株万寿菊幼苗，同时设置对照组，所述对照 组的万寿菊幼苗接种等量的灭菌蒸馏水。于25℃人工气候想内培养(喷水保持湿润)45天后将植株整株完整挖出，测量植株株高和根长，并称量鲜 重(茎叶鲜重、根鲜重和总鲜重)，并计算接种了棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液的万寿菊与对照组比各指标的增 长率。
(3)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml用于草莓幼苗 生长试验：
采用灌根接种法，将含1×106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液接种苗龄为2周的草莓幼苗，每 株万寿菊幼苗接种1次5mL分生孢子悬浮液，作为处理组，处理组共设 置3个重复，每个重复有5株万寿菊幼苗，同时设置对照组，所述对照组 的万寿菊幼苗接种等量的灭菌蒸馏水。于25℃人工气候想内培养(喷水保持湿润)50天后将植株整株完整挖出，测量植株株高和根长，并称量鲜重 (茎叶鲜重、根鲜重和总鲜重)，并计算接种了棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液的草莓幼苗与对照组比各指标的 增长率。
增长率(％)＝100×(处理组生物量-对照组生物量)/对照组生物量
表1棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml促进植物幼苗生长的效果
作物名称 株高增长率(％) 根长增长率(％) 茎叶鲜重增长率(％) 根鲜重增长率(％) 总鲜重增长率(％)
黄瓜 21.89±4.65 64.79±7.41 44.90±9.71 122.86±26.66 57.61±10.09
甘蓝 29.66±8.34 139.75±32.18 229.53±43.63 107.15±27.66 219.11±29.12
万寿菊 58.64±14.24 37.84±10.98 311.93±107.31 431.05±157.97 383.69±110.31
草莓 7.96±7.51 10.42±8.72 32.31±19.29 3.42±2.35 22.54±15.23
由表1可知，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml能够促 进黄瓜幼苗、甘蓝幼苗、万寿菊幼苗和草莓幼苗的生长。
实施例3
本实施例为实施例1所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml的应用，用于防治草莓炭疽病。
(一)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml对盆栽草莓炭 疽病的防病效果：
将4℃条件下于PDA斜面上保存的LC0220(草莓炭疽病病原菌菌株) 转移至含PDA培养基的培养皿中，在温度为25℃的黑暗条件下培养5d， 将4℃条件下于PDA斜面上保存的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml转移至含木霉选择性培养基PDAm(所述木霉选择性培养基 PDAm由以下重量份的原料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂20 份、氯霉素0.3份、玫瑰红和蒸馏水1000份)的培养皿中，在温度为28 ℃的黑暗条件下培养5d，然后用灭菌打孔器分别在两个菌落边缘打取直径 为6mm的菌饼若干，将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml 菌饼转移至含PDA培养基的培养皿中，在温度为25℃的黑暗条件下培养 5d，将LC0220菌饼转移至含PDAm培养基的培养皿中，在温度为28℃的黑暗条件下培养5d，LC0220和棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml均在培养皿大量产孢，得到大量的分生孢子，然后在每个培养 皿中均加入无菌水，用灭菌玻璃棒刮取表面菌丝，经四层灭菌过滤纸过滤 得到分生孢子滤液，用血球计数板计算分生孢子液浓度，通过离心浓缩或 加入无菌水稀释的方法将分生孢子滤液调整成浓度为1×106个孢子/mL的 分生孢子悬浮液。
采用灌根接种法，接种于苗龄为2周的红颜草莓幼苗，共接种2次， 两次接种的间隔时间为7天，于第二次接种后60天，对叶片发病情况进 行分级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果。参照《农药田间药 效试验准则》制定分级标准，分级标准：0级，叶片无病斑；1级，叶片 病斑占整个叶片面积的5％以下；3级，叶片病斑占整个叶片面积的6％～10％；5级，叶片病斑占整个叶片面积的11％～25％；7级，叶片病斑占整 个叶片面积的26％～50％；9级，叶片病斑占整个叶片面积的50％以上。
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×病害级别数)/(调查总叶数×9)；
防治效果(％)＝100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区 病情指数；
试验设4个处理：
处理1为在草莓幼苗根际同时灌根接种20mL的浓度为1×106个孢子 /mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液和 20mL的浓度为1×106个孢子/mL的LC0220分生孢子悬浮液；
处理2为在草莓幼苗根际接种20mL的浓度为1×106个孢子/mL的 LC0220分生孢子悬浮液；
处理3为在草莓幼苗根际接种20mL的浓度为1×106个孢子/mL的棘 孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml分生孢子悬浮液；
处理4为接种清水为空白对照；
每处理4个重复，每个重复的接种量均为20mL，接种后置于26℃、 12h光照/12h黑暗的温室内培养。
结果如表2所示，未接种草莓炭疽病病原菌的处理3和处理4均未发 病。接种了草莓炭疽病病原菌的处理1与处理2相比，接种棘孢木霉 GYSW-6m1对盆栽草莓炭疽病的防治效果能够达到87.23％，说明棘孢木 霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml对盆栽草莓炭疽病的具有较好的 防病效果。
表2各处理对盆栽草莓炭疽病的防治效果
处理 病情指数 防治效果(％)
处理1 11.73cd 87.23
处理2 91.85a -
处理3 0.00d -
处理4 0.00d -
注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。
(二)棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6ml对田间草莓炭 疽病的防病效果：
选取长势一致的红颜草莓幼苗，移栽至田间大棚试验小区(大棚为草 莓炭疽病连作障碍严重病床)，按照正常的农事操作进行管理，移栽1周 后定量施复合肥一次，移栽2周后进行施药处理，第一次施药后7d进行 第二次施药，共施药2次。
试验设3个处理组:
处理a组为每次施药均在每株草莓根际灌根接种50mL的浓度为1× 106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分生孢 子悬浮液；
处理b组为在草莓幼苗植株上喷施800倍液的80％多菌灵可湿性粉剂 作为农药对照；所述800倍液的80％多菌灵可湿性粉剂的每次的喷施量等 于处理a组中的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分生孢子 悬浮液的每次的总接种量；所述80％多菌灵可湿性粉剂为防治草莓炭疽病 的常规农药；
处理c组为在草莓幼苗植株上喷施清水作为空白对照；所述清水的每 次的喷施量等于处理a组中的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6m1分生孢子悬浮液的每次的总接种量；
每个处理组分别设置3个重复的小区，每小区44株草莓幼苗，每小 区的面积为6m2。
在自然发病情况下，于草莓炭疽病发病高峰期对叶片发病情况进行分 级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果，每个小区调查100片叶 片，每个处理调查300片，参照《农药田间药效试验准则》制定分级标准， 对发病情况进行分级，分级标准如下：
0级，叶片无病斑；
1级，叶片病斑占整个叶片面积的5％以下；
3级，叶片病斑占整个叶片面积的6％～10％；
5级，叶片病斑占整个叶片面积的11％～25％；
7级，叶片病斑占整个叶片面积的26％～50％；
9级，叶片病斑占整个叶片面积的50％以上。
叶片发病率(％)＝100％×发病叶片数/总调查叶片数；
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×病害级别数)/(调查总叶数×9)；
防治效果(％)＝100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区 病情指数。
调查结果如表3，在田间大棚中，使用棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分生孢子悬浮液灌根于田间大棚种植的草莓，可 有效防治草莓炭疽病，防治效果能达到71.38％，且防治效果显著高于喷施 80％多菌灵可湿性粉剂的防治效果。
表3各处理对田间大棚试验草莓炭疽病的防治效果
注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。
实施例4
本实施例为实施例1所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GYSW-6ml的应用，用于防治甘蓝黑腐病。
供试甘蓝品种为中甘21号，于田间种植，在甘蓝黑腐病发病初期进 行第一次施药，在第一次施药后7-10天进行第二次施药，共施药2次。
试验设3个处理组:
处理A组为每次施药每株甘蓝植株根际接种20mL的浓度为1×106个孢子/mL的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分生孢子悬 浮液；
处理B组为在甘蓝植株上喷施浓度为800倍液的39％甲霜·噁霉灵可 湿性粉剂(配比为20:19)作为农药对照，所述800倍液的39％甲霜·噁 霉灵可湿性粉剂的每次的喷施量等于处理A组中的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分生孢子悬浮液的每次的总接种量；所述39％甲 霜·噁霉灵可湿性粉剂为防治甘蓝黑腐病病的常规农药；
处理C组为在甘蓝植株上喷施清水作为空白对照；所述清水的每次的 喷施量等于处理A组中的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1 分生孢子悬浮液的每次的总接种量；
每个处理组分别设置3个重复的小区，每小区40株草甘蓝，每小区 的面积为6.5m2。
在自然发病情况下，于甘蓝黑腐病发病高峰期对叶片发病情况进行分 级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果，每个小区随机调查10 株(每株叶片全部调查)，参照《农药田间药效试验准则》制定分级标准， 对发病情况进行分级，分级标准如下：
0级，叶片无病斑；
1级，叶片病斑占整个叶片面积的5％以下；
3级，叶片病斑占整个叶片面积的6％～10％；
5级，叶片病斑占整个叶片面积的11％～25％；
7级，叶片病斑占整个叶片面积的26％～50％；
9级，叶片病斑占整个叶片面积的50％以上。
叶片发病率(％)＝100％×发病叶片数/总调查叶片数；
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×病害级别数)/(调查总叶数×9)；
防治效果(％)＝100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区 病情指数。
结果如表4，使用棘孢木霉(Trichoderma asperellum)GYSW-6m1分 生孢子悬浮液灌根于甘蓝，可有效防治甘蓝黑腐病，防治效果能达到 72.93％，且防治效果显著高于喷施39％甲霜·噁霉灵可湿性粉剂的防治效 果。
表4各处理对甘蓝黑腐病的防治效果
处理组 发病率(％) 病情指数 防治效果(％)
处理A组 80.00±10.00b 1.67±0.00c 72.93±3.87a
处理B组 95.00±5.00a 3.39±0.50b 45.06±2.58b
处理C组 100.00±0.00a 6.17±0.61a -
注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡 是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变 化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州省植物保护研究所
<120> 一种棘孢木霉菌株及其应用
<130> 2019.07.04
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 573
<212> 16S rDNA
<213> 棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）
<400> 1
tggggatcgg gctaactcaa cccaatgtga acgttaccaa actgttgcct cggcggggtc 60
acgccccggg tgcgtcgcag ccccggaacc aggcgcccgc cggaggaacc aaccaaactc 120
tttctgtagt cccctcgcgg acgtatttct tacagctctg agcaaaaatt caaaatgaat 180
caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240
ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc 300
cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga acccctccgg 360
gggatcggcg ttggggatcg ggacccctca cacgggtgcc ggccccgaaa tacagtggcg 420
gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt ttgcacaact cgcaccggga gcgcggcgcg 480
tccacgtccg taaaacaccc aactttctga aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc 540
cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 573

Claims (6)

1.一种棘孢木霉菌株，其特征在于，所述棘孢木霉菌株命名为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GYSW-6ml，保藏编号为CCTCC NO：M 2018918，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路珞珈山，保藏日期为2018年12月24日。
2.根据权利要求1所述的一种棘孢木霉菌株，其特征在于，所述棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GYSW-6ml的16S rDNA如SEQ ID NO:1所示。
3.一种如权利要求1所述的棘孢木霉菌株的应用，其特征在于，所述棘孢木霉菌株用于促进植物幼苗生长。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜、甘蓝、万寿菊或草莓。
5.一种如权利要求1所述的棘孢木霉菌株的应用，其特征在于，所述棘孢木霉菌株用于防治草莓炭疽病。
6.一种如权利要求1所述的棘孢木霉菌株的应用，其特征在于，所述棘孢木霉菌株用于防治甘蓝黑腐病。
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