CN106010987B - 一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用 - Google Patents

一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用，所述对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株为球孢白僵菌Bb‑YMM菌株，已于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11464，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对突背蔗犀金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于突背蔗犀金龟的防治。

Description

一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术防治领域，涉及一种白僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用。
背景技术
突背蔗犀金龟(Alissonotum impressicolle Arrow)又名突背犀金龟、突背蔗龟、黑色蔗龟，属鞘翅目，犀金龟科，蔗犀金龟属，是我国最重要的糖料作物——甘蔗的主要地下害虫之一，在我国的广西、广东、云南、贵州、台湾等甘蔗产区严重发生。该虫1年发生1代，幼虫和成虫均为害甘蔗，成虫在甘蔗苗期咬食蔗芽及蔗苗基部，造成蔗苗枯心死亡且不能再分蘖，严重时蔗苗受害率达40％以上，缺苗断垄严重；幼虫取食蔗根，将蔗头蛀食成洞穴状，影响甘蔗后期生长及宿根年限，引起严重倒伏，一般减产15％-25％，严重者达50％以上，甚至绝收，甘蔗产业面临严重威胁。2013-2015年连续三年调查发现，在广西平果县发现突背蔗犀金龟发生严重地区达2万多头/亩，甘蔗产业面临严重威胁。
目前，生产上仍以化学农药为主来防治突背蔗犀金龟。但由于该虫生存环境较为隐蔽，化学防治效果相对较差，且大量化学农药的使用，高残留、抗药性、污染环境等一系列问题越来越突出。随着环境污染的加重、人类环保意识的增强以及绿色农业发展的需求，生物防治显得尤为重要。因此，探寻突背蔗犀金龟高效、环保、无公害的生物防治途径是目前生产上的迫切需求。
白僵菌作为农作物害虫的一类重要致病菌，以其对人畜及作物安全性高、无环境污染及残留、害虫不易产生抗性、显著的流行潜力等优点，在害虫生物防治中占有重要的地位和良好的应用前景，而其对突背蔗犀金龟幼虫的侵染还未见报道。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株及其应用，其分生孢子对突背蔗犀金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于突背蔗犀金龟的防治。
对此，本发明的技术方案为：
一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株，所述对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM菌株，已于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11464，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其分类命名为球孢白僵菌。
该球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM具有以下特征：
该菌株从广西壮族自治区农业科学院武鸣里建基地玉米地中采集的玉米螟幼虫僵虫虫体上分离得到。保存方式为低温斜面保存。在PDA培养基上27±1℃下生长5天，菌落直径22.92mm，10天达70.75mm。
菌落白色至乳白色，初期为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层。菌丝分枝，有隔，无色光滑，宽2.7μm～3.6μm，分生孢子梗单生或分枝，长形、圆柱状或长瓶状，长度变化大，顶生或侧生多个产孢细胞。产孢细胞呈球形，有时圆柱状或瓶形，直或略弯，呈麦穗轴状屈曲；分生孢子无色，单胞，球形至卵圆形，大小为1.8～2.2μm×1.9～2.5μm。最佳生长温度范围为24～28℃。
进一步的，所述球孢白僵菌Bb-YMM的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明公开了如上所述的对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株的应用，其应用在突背蔗犀金龟的防治中。
本发明公开了一种杀虫菌剂，其包括如上所述的对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株。
本发明具有以下有益效果：
本发明是初次分离到对突背蔗犀金龟幼虫具有致病力的白僵菌菌株，培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对突背蔗犀金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于突背蔗犀金龟的防治。
附图说明
图1为球孢白僵菌Bb-YMM菌株在PDA培养基上27±1℃下培养15天的菌落形态图。
图2为突背蔗犀金龟幼虫图。
图3为突背蔗犀金龟幼虫被球孢白僵菌Bb-YMM感染症状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
病原菌的分离、鉴定。
将采集到的自然感染的玉米螟僵虫先用75％酒精浸没3～5s，再用0.1％升汞表面消毒3min，灭菌水冲洗3次，在无菌条件下，用灭菌刀具将感染虫体切3mm见方小块接种于PDA平板上，放入28℃培养箱中培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养获得纯的球孢白僵菌菌株Bb-YMM，转移到PDA斜面上培养7天，在4℃冰箱保藏。
形态学鉴定：
将分离纯化的球孢白僵菌菌株在直径为90mm的平板PDA培养基上于27±1℃条件下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征，如图1所示，菌落白色至乳白色，初期为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层。菌丝分枝，有隔，无色光滑，宽2.7μm～3.6μm，分生孢子梗单生或分枝，长形、圆柱状或长瓶状，长度变化大，顶生或侧生多个产孢细胞；产孢细胞呈球形，有时圆柱状或瓶形，直或略弯，呈麦穗轴状屈曲；分生孢子无色，单胞，球形至卵圆形，大小为1.8～2.2μm×1.9～2.5μm。最佳生长温度范围为24～28℃。
菌株的ITS序列测定及分子鉴定：
利用Bb-YMM菌株的菌丝体提取总DNA，以提取的DNA为模板，以真菌ITS5区通用引物进行PCR扩增、测序，经中国农业微生物菌种保藏管理中心鉴定为球孢白僵菌Beauveriabassiana，所述球孢白僵菌Bb-YMM的序列如下：(如序列表中SEQ ID NO:1所示)
GACCTATGCGACGCGGAGGGACATTACCGAGTTTTCACTCCCCAACCCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
实施例2
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM的生物学特性。
菌落生长速率和产孢量的测定：用点滴法将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb-YMM接种于PDA平板培养基中央，置于27±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15d。同时记录开始产孢时间，用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含20mL的0.1％吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。
孢子萌发率的测定：将菌株培养10天，用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持100％湿度，培养24h后镜检萌发率，每个处理重复3次。菌落直径的生长速率、产孢量测定结果、24h分生孢子萌发率的结果分别如表1、表2和表3所示。
由表1可知，球孢白僵菌Bb-YMM在PDA培养基上于27±1℃条件下生长良好，生长较快，培养1-2d时，其菌落平均直径增加速度较低，培养至第5d时，其菌落平均直径增加速度为0.94cm/d，培养至第7d时，其菌落平均直径增加速度1.02cm/d。由表2可看出，从第6天开始产孢量就可以达到1×108孢子/cm2，产孢速度快，产孢量较高。由表3可看出，24小时孢子的萌发率可达91.75％，表明该菌株的生物学特性好，生长情况好。
表1 菌落直径的生长速率
表2 产孢量测定结果
表3 24h分生孢子萌发率
实施例3
采用浸渍法测定球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM对突背蔗犀金龟幼虫的致病力。
从PDA平板上刮取一定量的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM孢子置于灭菌的0.1％吐温-80溶液中，配制成107孢子/mL的孢子悬浮液；将健康活泼的突背蔗犀金龟3龄幼虫浸渍，其中，突背蔗犀金龟幼虫图如图2所示，同时轻轻翻转虫体，10s后取出置于灭菌的罐头瓶中(内径6cm，高11cm)，放入一小段蔗茎供其取食，再将瓶子装满土壤(土壤经烘箱高温灭菌，湿度20％左右)。每处理20头幼虫，单头饲养，重复4次，以浸渍0.1％土温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后置于黑暗的26±1℃恒温培养箱中，每天观察记录死亡虫数，并将死亡的幼虫继续保留在罐头瓶中保湿观察，确认是否为供试菌株感染死亡，统计死亡率及僵虫率，突背蔗犀金龟幼虫被球孢白僵菌Bb-YMM感染症状图如图3所示。数据用DPS7.05软件进行线性回归统计分析。
实验结果表明：球孢白僵菌Bb-YMM菌株对突背蔗犀金龟3龄幼虫具有较高的毒力，接种处理后第20天时累积校正死亡率达88.16％，毒力回归方程为Y＝0.45+4.51X(r＝0.95)，LT50＝10.21天。球孢白僵菌Bb-YMM菌株具有开发为控制突背蔗犀金龟的微生物农药的潜力。
实施例4
采用孢子拌土法测定球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM对突背蔗犀金龟幼虫的致病力。
取球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM孢子粉与采集于蔗田灭过菌的土壤混合均匀，配制成浓度为107孢子/g土的带菌土壤置于养虫盒中，将健康的突背蔗犀金龟幼虫小心置于带菌土壤中，并埋置蔗茎供其取食，然后将养虫盒置于黑暗的26±1℃恒温培养箱中，每天观察记载突背蔗犀金龟幼虫死亡情况，虫尸处理方法同浸渍法。每盒放置20头幼虫，每处理做3个重复，结果如表4所示。
由表4可见，采用107孢子/g土的带菌土壤处理突背蔗犀金龟幼虫15天后，突背蔗犀金龟幼虫死亡率达69.64％，感染率为27.69％；对照组死亡率为6.67％，未出现感染。实验处理30天后，突背蔗犀金龟幼虫死亡率达88.68％，感染率为33.29％；对照组死亡率为11.67％，未出现感染。
表4 球孢白僵菌Bb-YMM孢子拌土法对突背蔗犀金龟幼虫的致病力
实施例2、3、4的结果表明，菌株Bb-YMM，CGMCC No.11464是我们首次分离到的对突背蔗犀金龟幼虫具有较强致病力的球孢白僵菌菌株，该菌株在PDA培养基上，温度为27±1℃条件下生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高，杀虫效果好，是一株在突背蔗犀金龟的防治上具有潜在意义的生防菌株。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株，其特征在于：所述对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb-YMM菌株，已于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11464，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株的应用，其特征在于：应用在突背蔗犀金龟的防治中。
3.一种杀虫菌剂，其特征在于：其包括权利要求1所述的对突背蔗犀金龟具有致病力的白僵菌菌株。
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