CN109749953A

CN109749953A - 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109749953A
Application number: CN201811469013.8A
Authority: CN
Inventors: 咸洪泉; 赵洪海; 李雅华; 杨亚楠; 张启航
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109749953B

Abstract

本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌BCCY22，其保藏编号是：CGMCC No.16672，还公开了该菌株的培养方法、形成的菌剂、菌剂的制备方法及应用。所述蜡样芽孢杆菌菌落为乳白色、近似圆形、微隆、边缘不整齐、质地均匀、不透明，蜡样芽孢杆菌BCCY22为杆状，其长度为2.86um～4.44um、宽度为0.80um～1.21um，呈链状排布或者单独存在；产芽孢、芽孢中生、椭圆形、孢囊不膨大，革兰氏染色反应阳性；所述蜡样芽孢杆菌能利用葡萄糖和蔗糖，其不能利用乳糖。本发明提供的蜡样芽孢杆菌为广谱线虫拮抗菌株，制备的菌剂对植物线虫病具有高效防治效果，还具有一定的促进作物生长和增产作用，有利于保护环境。

Description

蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

植物寄生线虫是引起植物侵染性病害的重要病原之一，已成为农业生产中的第二大类病害，造成严重的经济损失。例如花生根结线虫病是发生普遍、危害最严重的一类线虫，受害花生一般减产20％～30％，严重的可达70％以上；小麦孢囊线虫病造成的谷物损失在15％～96％；根结线虫导致蔬菜作物减产，一般损失10％－20％，易感蔬菜损失30％－50％，重病地块损失75％以上，少数特别严重的地块甚至绝收或无法进行蔬菜再生产，我国蔬菜根结线虫每年造成的损失约50亿元。

目前防治线虫的方法基本分为四大类，包括农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。轮作和选育种植抗线虫品种是两种有效的农业防治线虫病害方法，由于线虫寄主范围广、耕地资源和耕作条件等方面制约，轮作受到较大限制；目前生产上尚缺乏农艺性状良好的抗线虫病品种。热力处理是有效的杀线虫方法，但成本高、无差别杀死土壤中有益微生物，破坏土壤的微生态环境难以大面积推广应用。化学杀线剂高效、使用方便，是线虫防治的主要方法，随着长期使用化学杀线剂暴露出的毒性强、残留高、严重污染环境等问题日趋突出，已不适用于绿色、有效的防治线虫病害要求，一些生产上曾广泛使用的杀线剂如涕灭威、甲基异柳磷、涕灭威、灭线磷、克百威等相继被禁用或限制使用，因此迫切的需要寻找一种新的绿色防治线虫病害途径来代替传统的防治方法。

生物防治线虫病害是一种有效、环保、快速、安全的防治新途径，开发生防制剂以作为化学农药的补充或替代品，利用拮抗微生物来防治线虫病害的研究倍受关注,具有十分巨大的社会、经济效益与环境效益。

已发现可用于线虫防治的生物包括真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫、螨和一部分无脊椎动物，其中研究较多的有真菌和细菌两大类。大部分生防真菌在室内及盆栽试验中有较好的防治效果，但在大田防治试验中往往会受定殖能力、温度、湿度等多种因素的限制而无法发挥出理想的效果。细菌一般具有易培养、繁殖快、定殖能力强等特点，是重要的线虫生防菌资源，但是自然界中现有和未发现的细菌种类繁多，而不同细菌菌株生防效果差异极大，具有菌株特异性，如何筛选高效、广谱线虫拮抗细菌菌株及其培养技术是线虫病害生物防治研究应用需要解决的重要问题。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种可有效防治多种植物线虫病害的蜡样芽孢杆菌、培养方法、菌剂及其制备方法和应用，以解决现有植物线虫病害防治中化学农药高毒、成本高、实施应用困难、破坏土壤生态环境等不足的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供的蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌BCCY22，保藏编号是：CGMCCNo.16672，该菌种是从小麦孢囊线虫病田土壤中分离得到。结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株BCCY22鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。并将筛选到的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCCY22于2018年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

进一步地，所述蜡样芽孢杆菌菌落为乳白色、近似圆形、微隆、边缘不整齐、质地均匀、不透明，蜡样芽孢杆菌为杆状，其长度为2.86um～4.44um、宽度为0.80um～1.21um，呈链状排布或者单独存在；产芽孢、芽孢中生、椭圆形、孢囊不膨大，革兰氏染色反应阳性；所述蜡样芽孢杆菌能利用葡萄糖和蔗糖，甲基红试验、伏普试验、淀粉水解试验、明胶水解、酪氨酸水解、接触酶试验反应都为阳性，其不能利用乳糖，吲哚试验和柠檬酸盐试验反应都为阴性。

本发明还提供了一种如上所述的蜡样芽孢杆菌的培养方法，所述培养方法为：利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对蜡样芽孢杆菌进行接种培养，其中，培养条件为：培养基的初始pH值为5.5～9.5，蜡样芽孢杆菌的接种量1％～9％，培养温度为23.5℃～41.5℃，培养基的装瓶量为10％～50％。上述培养条件下，蜡样芽孢杆菌BCCY22能大量繁殖，生长状态良好。

优选地培养条件为，加富牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值为6.5、蜡样芽孢杆菌的接种量为3％、培养基的装瓶量为20％，在32.5℃条件下振荡培养。上述优选条件最适宜蜡样芽孢杆菌BCCY22的快速生长，该条件下的菌体生长速率最快，迟滞期最短，在48h时菌体密度最大，并且培养得到的菌体量最多。实验证明，优选条件下，细菌生长迅速，在36h时活菌数量最大，是常规培养活菌数量的1.47倍，极大地缩短了发酵时间，缩短了菌体培养周期。

本发明还提供了一种如上所述的蜡样芽孢杆菌的菌剂，所述菌剂采用蜡样芽孢杆菌BCCY22发酵培养制备得到，菌剂为液体或者固体。

本发明还提供了一种如上所述的蜡样芽孢杆菌菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)向发酵罐中加入牛肉膏蛋白胨液体培养基，装料系数为50-80％， 121℃灭菌20-40min；

(2)按1％～9％的接种量接入培养16～18h的蜡样芽孢杆菌种子液，200～ 300r/min，23.5℃～41.5℃条件下发酵，加入消泡剂消泡；

(3)发酵过程中通气量(V/V·min)1:1～2，控制pH为5.5～9.5，发酵 30～40h，得到发酵液；

(4)用无菌水将上述发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得蜡样芽孢杆菌的液体菌剂；将所述液体菌剂按1:1(V:W)加入灭菌的麸皮吸附，干燥后即得蜡样芽孢杆菌固体菌剂。

其中牛肉膏蛋白胨液体培养基包括普通牛肉膏蛋白胨液体培养基和加富牛肉膏蛋白胨液体培养基。为了提高蜡样芽孢杆菌的产率，所述培养基优选为加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，但是菌种培养成本有所提高。

本发明还提供所述蜡样芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其中，所述植物线虫病害包括小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜和黄瓜等葫芦科瓜果类作物根结线虫病、番茄等茄科蔬菜根结线虫病、甘薯茎线虫、葡萄根结线虫。其中，蜡样芽孢杆菌菌剂对小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病和番茄根结线虫病的防治效果更突出。

进一步地，用于防治网纹瓜根结线虫病或番茄根结线虫病时，有效活菌为 1×10⁹cfu/g的蜡样芽孢杆菌菌剂，于移栽前穴施蜡样芽孢杆菌的液体菌剂，施用剂量为60-70mL/穴。

进一步地，用于防治小麦孢囊线虫病或花生根结线虫病时，有效活菌为 1×10⁹cfu/g的蜡样芽孢杆菌菌剂，混土施用蜡样芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/667m²～7kg/667m²。

本发明实施例具有以下有益效果：

1、本发明提供的蜡样芽孢杆菌具有广谱拮抗植物病原线虫活性，制备的菌剂对植物线虫病具有高效防治效果，尤其是对小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病和番茄根结线虫病的防治效果显著。

2、所述蜡样芽孢杆菌的繁殖速度快，易培养，其菌剂的制备方法简单、制备周期短，其菌剂还具有一定的促进作物生长和增产作用，有利于保护环境，具有十分巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为蜡样芽孢杆菌BCCY22菌落形态；

图2为蜡样芽孢杆菌BCCY22革兰氏染色结果；

图3为菌株BCCY22在常规和优化培养条件下的生长情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1：蜡样芽孢杆菌的分离筛选

1.培养基的制备

普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方为：牛肉膏5g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂粉20g；蒸馏水，1L。pH调制7.2，121℃高温灭菌20 min。

加富牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏10g；蛋白胨20g；氯化钠 5g；蒸馏水，1L；121℃高温灭菌20min。

2.蜡样芽孢杆菌的分离筛选

称取500g小麦孢囊线虫病田土壤土样放于盆中，用自来水冲洗，搅拌，将上层水倒入套筛(上层40目筛，下层60目筛)，操作重复五次。将60目筛截留的土样冲洗至装有少量水的烧杯中。混匀后倒入放有滤纸的多孔塑料皿中，在体视镜下挑取褐色柠檬形的孢囊，置于小培养皿中。将收集的孢囊用1％的次氯酸钠灭菌3min后，然后用无菌水洗三遍。在体视镜下利用灭菌挑针扎破孢囊，转移至牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下培养2～3d后，待细菌长出，分区划线，进行细菌的纯化，保存于斜面。

分别挑取活化的供试细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃、140rpm/min、摇床振荡培养3d，发酵液8000rpm/min离心10min，分别收集菌体和上清液(发酵产物)备用。

发酵产物对二龄幼虫的致死作用：将24孔细胞培养板每个孔加入30条新孵化的二龄幼虫，并分别加入2mL不同细菌菌株不同浓度的发酵上清液，以无菌水为对照，每处理3次重复。于15℃培养箱中观察记录J2死亡情况。观察时取处理的二龄幼虫，滴加4mol/L NaOH，如幼虫身体僵直、不再扭动则判定为幼虫已经死亡。死亡率的计算公式如下：

发酵产物对孢囊孵化的抑制作用：分离4℃冰箱中预处理30天后的土样中的孢囊，用1％的次氯酸钠表面消毒后用无菌水冲洗3遍。分别取不同供试细菌菌株不同浓度的发酵上清液2mL于24孔细胞培养板中，细胞培养板每个孔中随机加入5个饱满的孢囊，以无菌水作对照，每处理3次重复。于15℃培养箱中孵育，观察记录孵化出的J2线虫条数，研究不同浓度不同细菌菌株发酵产物对小麦孢囊线虫孢囊孵化的抑制作用。采用DPS v7.5(DataProcessing System)软件进行Duncan氏新复极差法统计分析。

从分离506株细菌中筛选出1株对小麦孢囊线虫的孢囊孵化和二龄幼虫的致死作用最强的菌株，编号BCCY22，其发酵产物对二龄幼虫的致死作用结果见表1和表2。BCCY22发酵产物稀释2倍后，对二龄幼虫的校正致死率为 94.60％；稀释4倍后对二龄幼虫的致死率达到78.67％，稀释16倍后对二龄幼虫致死率达到26.67％，说明BCCY22的发酵产物对二龄幼虫的致死作用存在剂量效应，发酵产物浓度越高对小麦孢囊线虫二龄幼虫致死作用越强。

表1不同浓度BCCY22发酵产物处理24h对二龄幼虫的致死作用

注：P<0.05

表2 BCCY22发酵产物不同处理时间对二龄幼虫的致死作用

BCCY22不同浓度的发酵产物对孢囊孵化抑制作用结果见表3，在第5d 的时候，BCCY22的原液，2倍稀释液以及4倍稀释液对孢囊孵化的抑制率达到 100％，发酵上清液稀释8倍后对孢囊孵化抑制率为80.78％。在第10d，第15 d时孢囊不再孵化，抑制率没有发生变化。说明BCCY22的发酵产物对抑制孢囊的孵化上存在剂量效应，发酵产物浓度越高对孢囊孵化的抑制作用越强。

表3 BCCY22不同浓度的发酵产物对孢囊孵化抑制作用(孢囊孵化抑制率％)

蜡样芽孢杆菌BCCY22的鉴定

1、形态学鉴定和生理生化特性检测

将分离到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨平板上，28℃恒温培养18～48h，观察菌落生长情况，挑取菌体制备涂片，进行革兰氏染色，显微观察菌体形态和芽孢形成情况，进行形态学鉴定。采用常规方法进行糖(醇)类发酵试验、 Voges-Proskauer试验(伏-普试验，V.P.试验)、甲基红试验(M.R试验)、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶水解试验，接触酶试验、酪氨酸水解试验(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册，第一版.北京,科学出版社,2001)。

结果表明：菌株菌落形态如图1所示：BCCY22菌落乳白色、近似圆形、微隆、边缘不整齐、质地均匀、不透明，杆状、长度为2.86um～4.44um、宽度为0.80um～1.21um，呈链状排布或者单独存在；产芽孢、芽孢中生、椭圆形、孢囊不膨大，革兰氏染色反应阳性如图2所示。

BCCY22能利用葡萄糖和蔗糖，甲基红试验、伏普试验、淀粉水解试验、明胶水解、酪氨酸水解、接触酶试验反应阳性，不能利用乳糖，吲哚试验、柠檬酸盐试验反应阴性。

2、分子生物学鉴定

挑取菌株单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中28℃、200rpm振荡培养18h，采用DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组。

2.1 16S rRNA基因序列的测定

利用细菌16S rRNA基因通用引物27f和1492r，进行16S rRNA基因的 PCR扩增，引物序列如下：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:1)

1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)

PCR反应体系(50μL)：

细菌基因组DNA	2.0μL
		TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL
dNTPs(2mmol/L)	4μL
		引物27F(10μM)	2μL
引物1492R(10μM)	2μL
		10×PCR buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	34.5μL

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性0.5min、51℃退火0.5 min、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，测序由北京擎科生物技术有限公司完成，序列利用RDP数据库和NCBI数据库进行BLAST分析。

16S rDNA扩增产物为1500bp左右，测序获得菌株BCCY22的16S rRNA基因序列(1359bp)如SEQ ID NO:3所示(具体见序列表)。

基因比对结果显示，菌株BCCY22的16S rRNA基因序列与Bacillus cereus strainATCC 14579的16S rRNA基因(AE016877)序列相似性为 99.93％，Bacillus cereus strain10 16S rRNA基因(MH910114)序列相似性为100.00％。

2.2gyrB基因序列的测定

由于16srDNA的高度保守性，对相似率高的近缘种无法做到进一步区分，而编码促旋酶的gyrB基因能区分大部分细菌的近缘种，成为鉴定近缘种的重要有效靶标。本发明采用gyrB基因序列的测定对菌株BCCY22做进一步地鉴定。

设计并合成以下促旋酶亚基B基因(gyrase subunit B gene，gyrB)扩增引物为：

gyrB1F：5'-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'(SEQ ID NO:4)

gyrB2R：5'-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'(SEQ ID NO:5)

其中，Y为C或者T，N为A、T、C或者G，R为A或者G。

PCR反应体系(50μL)如下：

细菌基因组DNA	2.0μL
		TaqDNA聚合酶	0.5μL
dNTPs(2mmol/L)	4μL
		引物gyrB1F(10μM)	2μL
引物gyrB2R(10μM)	2μL
		10×PCR buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	34.5μL

PCR扩增条件为：95℃4min；94℃30s，48℃0.5min，72℃2min，35 个循环；72℃10min。扩增结束后，取5μL PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，测序由北京擎科生物技术有限公司完成，序列利用NCBI数据库进行BLAST分析。

gyrB基因扩增产物为1200bp左右，测序获得菌株BCCY22的gyrB基因序列(1072bp)，如SEQ ID NO:6所示(具体见序列表)。

将测序所获得的菌株BCCY22的gyrB基因序列与GenBank数据库中的已有序列进行BLAST比对分析，发现该序列与该序列与Bacillus cereus strain CS-17gyrB gene序列(KX346713)相似性为99.35％,与Bacillus cereus strain H6的gyrB基因序列(AF136389)相似性为95.90％，与Bacillus cereus strain ATCC 14579的gyrB基因序列(AB190226)相似性为91.42％。

结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株 BCCY22鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。将筛选到的蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)BCCY22于2018年11月1日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:16672，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例3蜡样芽孢杆菌BCCY22的培养

设优化培养条件和常规培养条件2个实验组，优化培养条件为加富牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值调节为6.5，接种量为3％，温度为32.5℃；常规培养条件为牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值调节为7.2，接种量为 1％，温度为28℃；试验采用250mL三角瓶，装瓶量均为20％，140rpm/min培养3d。不同处理分别在6h、12h、24h、36h、48h、60h、66h、72h 取出3瓶作为待检样品，4℃保存。取样完成后将待检样品用灭菌水按10倍梯度系列稀释至10^-7、10^-8、10^-9，分别取0.1mL待检样品稀释液涂布牛肉膏蛋白胨琼脂平板，28℃恒温培养48h，进行菌落计数，3次重复。

试验结果表明，发酵条件优化前细菌生长较慢；优化发酵条件后细菌生长迅速，在36h时活菌数量最大，是常规培养活菌数量的1.47倍(见图3)。并且在优化的培养条件下，发酵时间以36h为宜。

实施例4蜡样芽孢杆菌BCCY22菌剂的制备

将加富牛肉膏蛋白胨液体培养基加入全自动机械搅拌通风发酵罐中，装料系数65％，121℃灭菌30min，按3％的接种量接入培养16～18h的种子液， 250r/min，32.5℃发酵，以豆油为消泡剂自动控制消泡；发酵过程中通气量 (V/V·min)1:1.2，控制pH为6.5，发酵36h。发酵结束采用稀释涂布法进行活菌计数，发酵液中BCCY22数量为5.3～7.5×10¹⁰CFU/mL。

用无菌水将BCCY22发酵液调整到1×10⁹CFU/mL即得BCCY22液体菌剂，将 BCCY22液体菌剂按1:1(V:W)加入灭菌的麸皮吸附，干燥后即得BCCY22固体菌剂。

实施例5：蜡样芽孢杆菌BCCY22防治小麦孢囊线虫

潍麦8号小麦种子用1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗，25℃保湿催芽。将小麦孢囊线虫病田土壤去除大土块混匀装盆，每盆3kg，播种催芽的小麦种子，每盆15粒。处理为每盆浇50mL BCCY22液体菌剂；药剂对照为每盆病土均匀拌入0.06g噻唑磷，然后播种；空白对照每盆浇入50mL水；5 次重复。10月中旬播种，置于室外环境中，肥水管理同常规生产，第二年六月初调查小麦的发病及生长情况，统计孢囊减退率。采用DPS v7.5(DataProcessing System)软件进行Duncan氏新复极差法统计分析。

试验结果见表4，BCCY22处理能显著地增加小麦的茎叶鲜重、株高、根鲜重，促进小麦的生长；有效降低土壤中胞囊的数量，孢囊减退率达到77.6％，防病效果显著优于化学杀线剂噻唑磷。

表4 BCCY22对小麦孢囊线虫和小麦生长的影响

实施例6：蜡样芽孢杆菌BCCY22防治花生根结线虫

试验设A(BCCY22固体菌剂5kg/667m²)、B(BCCY22固体菌剂7kg/667 m²)和CK(对照)3个处理，采用田间大区对比试验，试验地点选择山东海阳的花生根结线虫重病花生连作田，春播大垄双行覆膜，花生品种为花育36， 220m²/区；处理区A、B于花生播种前沟施BCCY22固体菌剂，对照区于花生播种前沟施灭菌的麸皮7kg/667m²，5月上旬播种，常规田间管理，收获前调查线虫危害情况。采用对角线五点取样，每点调查6穴，分级标准采用国家标准 GB/T 17980.38-2000。采用DPS v7.5(Data Processing System)软件进行Duncan氏新复极差法统计分析。

试验结果表明，BCCY22菌剂可有效降低花生根结线虫病的病情指数，防效大50％以上，增加菌剂用量可提高防病效果；同时具有良好的增产作用(表5)。

表5 BCCY22菌剂对花生根结线虫病的防治效果和增产作用

实施例7：BCCY22防治网纹瓜根结线虫

试验在山东即墨移风店蔬菜根结线虫危害严重的温室大棚中进行，供试作物为网纹瓜，品种为阿姆斯，小区试验，试验设A(BCCY22液体菌剂)、B (10％噻唑磷颗粒剂)和CK(对照)3个处理，A处理于网纹瓜移栽前穴施 1×10⁹CFU/mL BCCY22液体菌剂60mL、B处理于网纹瓜移栽前混土撒施 2kg/666.7m²的10％噻唑磷颗粒剂，对照区移栽前不处理。4月5日移栽，大垄双行，垄距90cm，株距50cm，12.6m²/区；3次重复。滴灌，常规田间管理，移栽后1个月取样调查网纹瓜生长情况、根结线虫根结指数，评价防治效果，收获前根据植株地上部生长情况调查统计病死株率。根结严重度分0～10级，采用DPS v7.5(Data ProcessingSystem)软件进行Duncan氏新复极差法统计分析。

相对防治效果(％)＝(对照区根结指数-处理区根结指数)/对照区根结指数×100

或相对防治效果(％)＝(对照区病死株率-处理区病死株率)/对照区病死株率×100

试验结果见表6，BCCY22处理株高和植株鲜重显著高于对照，能促进网纹瓜生长；BCCY22处理根结指数显著低于对照，防病效果显著，防效与化学药剂差异不显著；BCCY22处理收获前病死株率明显低于化学药剂和对照，说明 BCCY22处理不仅防效好，而且持效期比化学药剂更长和持久。

表6 BCCY22菌剂对网纹瓜生长影响和根结线虫病的防治效果

实施例8：BCCY22防治番茄根结线虫

试验在山东即墨移风店蔬菜根结线虫危害严重的温室大棚中进行，供试作物为番茄，番茄品种为齐大力，试验设A(BCCY22液体菌剂)、B(10％噻唑磷颗粒剂)和CK(对照)3个处理，A处理于番茄移栽前穴施1×10⁹CFU/mL BCCY22液体菌剂60mL、B处理于番茄移栽前混土撒施2kg/666.7m²的10％噻唑磷颗粒剂，对照区移栽前不处理。9月11日移栽，大垄双行，垄距90cm，垄内行距60cm、株距40cm，25.2m²/区；3次重复。滴灌，常规田间管理，移栽后1个月取样调查番茄生长情况、根结线虫根结指数，评价防治效果，根结严重度分0～10级，统计分析参见实施例7。

试验结果见表7，BCCY22处理株高、植株鲜重和对照比差异不显著； BCCY22处理根结指数显著低于对照、与化学药剂差异不显著，说明BCCY22处理防病效果显著、与化学药剂差异不显著，对番茄生长无不良影响。

表7 BCCY22菌剂对番茄生长影响和根结线虫病的防治效果

综上所述，BCCY22菌剂对小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病和番茄根结线虫病的防治效果显著，并且防治效果优于化学药剂或者与化学药剂的效果差异不显著，并且BCCY22菌剂的防治持效期比化学药剂更持久，不污染环境，此外，还具有一定的促进作物生长和增产作用，具有广阔的发展和应用前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1359

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌 BCCY22的16S rDNA 基因(16S rDNA of Bacillus cereusBCCY22)

<400> 3

gaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccataaga ctgggataac 60

tccgggaaac cggggctaat accggataac attttgaact gcatggttcg aaattgaaag 120

gcggcttcgg ctgtcactta tggatggacc cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac 180

ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 240

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 300

tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta 360

gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 420

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta 480

ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac 540

cgtggagggt cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg 600

tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt 660

ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 720

tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt 780

taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg 840

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 900

accaggtctt gacatcctct gaaaacccta gagatagggc ttctccttcg ggagcagagt 960

gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020

cgagcgcaac ccttgatctt agttgccatc attaagttgg gcactctaag gtgactgccg 1080

gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1140

tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag agctgcaaga ccgcgaggtg gagctaatct 1200

cataaaaccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gctggaatcg 1260

ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320

cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgg 1359

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> y is c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a,t,c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a,t,c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a,t,c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> r is a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> y is c or t

<400> 4

caygcnggng gnaarttyga 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> r is a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a,t,c or g

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<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> r is a or g

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<222> (12)..(12)

<223> n is a,t,c or g

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<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> r is a or g

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<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a,t,c or g

<400> 5

ccrtcnacrt cngcrtcngt cat 23

<210> 6

<211> 1072

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌 BCCY22 的gyrB基因( gyrB gene of Bacillus cereusBCCY22)

<400> 6

ctctatcaac agaactagag gtatttgtac atcgtgaagg taaaatccat taccaaaaat 60

acgaaagagg tattcctgtt gcagatttaa aagtcattgg tgacacagat caaacaggaa 120

cgataactcg atttaaacca gatccagaaa tttttcagga aacaacagta tacgaatttg 180

atacactagc aagtcgtatg cgtgaattag catttttaaa tcgtaatatt aaattgacga 240

ttgaagataa acgtgaacat aagcaaaaga aagaattcca ttacgaaggt ggaattaaat 300

catatgttga gcatttaaac cgctcaaaac aaccaatcca tgaagaacct gtatatgtag 360

aaggatcaaa agatggtatt caagttgagg tttccttaca gtataacgaa ggatatacaa 420

ataatattta ctcatttacg aataacattc atacgtatga aggtggaaca catgaagtag 480

gttttaaaac agctttaact cgtgtgatta acgattacgg tcgtaaaaat agtattttaa 540

aagatgcaga cagtaactta actggcgagg atgttcgtga aggtttaact gcaatcgtat 600

caattaaaca tccaaatcca caatttgaag gacaaacgaa gacgaaactt gggaatagtg 660

aagcgagaac gattacagag tctgtgtttt cagaggcatt tgaaaagttc ttactagaaa 720

acccaaacgt tgcacgaaaa attgtggaaa aaggtacgat ggcagcacgt gcgcgtgttg 780

cagcgaaaaa agcacgtgaa ttaacacgcc gtaagagtgc gttagaagtt tcaagcttac 840

ctggtaaatt agcagattgc tcttcaaaag atccagcaat tagcgaaatt tatattgtag 900

agggtgattc tgccggcgga tcagcaaagc aaggtcgtga ccgtcacttc caggcgattt 960

taccactaaa gggtaaaatt attaacgttg aaaaagcaag attagataaa attttatcta 1020

acgatgaagt acgtacaatt attactgcaa ttggtacaaa cattggcgga ga 1072

Claims

1.蜡样芽孢杆菌，其特征在于，为蜡样芽孢杆菌BCCY22，其保藏编号是：CGMCCNo.16672。

2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌菌落为乳白色、近似圆形、微隆、边缘不整齐、质地均匀、不透明，蜡样芽孢杆菌为杆状，其长度为2.86um～4.44um、宽度为0.80um～1.21um，呈链状排布或者单独存在；产芽孢、芽孢中生、椭圆形、孢囊不膨大，革兰氏染色反应阳性；所述蜡样芽孢杆菌能利用葡萄糖和蔗糖，甲基红试验、伏普试验、淀粉水解试验、明胶水解、酪氨酸水解、接触酶试验反应都为阳性；其不能利用乳糖，吲哚试验和柠檬酸盐试验反应都为阴性。

3.一种如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法为：利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对蜡样芽孢杆菌进行接种并培养，其中，培养条件为：培养基的初始pH值为5.5～9.5，蜡样芽孢杆菌的接种量1％～9％，培养温度为23.5℃～41.5℃，培养基的装瓶量为10％～50％。

4.根据权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，采用加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，初始pH值为6.5，蜡样芽孢杆菌的接种量为3％、培养基的装瓶量为20％，在32.5℃条件下振荡培养。

5.一种如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂采用蜡样芽孢杆菌BCCY22发酵培养制备得到，菌剂为液体或者固体。

6.一种如权利要求5所述的蜡样芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向发酵罐中加入牛肉膏蛋白胨液体培养基，装料系数为50-80％，121℃灭菌20-40min；

(2)按1％～9％的接种量接入培养16～18h的蜡样芽孢杆菌种子液，200～300r/min，23.5℃～41.5℃条件下发酵，加入消泡剂控制消泡；

(3)发酵过程中通气量(V/V·min)1:1～2，控制pH为5.5～9.5，发酵30～40h，得到发酵液；

7.如权利要求5所述的蜡样芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用。

8.根据权利要求7所述的蜡样芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，所述植物线虫病害包括小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病和番茄根结线虫病。

9.根据权利要求7或者8所述的蜡样芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，用于防治网纹瓜根结线虫病或番茄根结线虫病时，于移栽前穴施蜡样芽孢杆菌的液体菌剂，施用剂量为60-70mL/穴。

10.根据权利要求7或者8所述的蜡样芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，用于防治小麦孢囊线虫病、花生根结线虫病时，混土施用蜡样芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/667m²～7kg/667m²。