CN103103152B

CN103103152B - 一种珊瑚球菌及其应用

Info

Publication number: CN103103152B
Application number: CN201310028459.8A
Authority: CN
Inventors: 崔中利; 李周坤; 黄彦
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-01-25
Also published as: CN103103152A

Abstract

本发明属于应用微生物学领域，涉及一种珊瑚球菌及其应用。一株珊瑚球菌（Corallococcus coralloides）EGB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。该菌在生长的过程中对以水稻稻曲病、棉花枯萎病以及黄瓜黄枯枯萎病植物病原真菌的生长具有良好的抑制作用，该菌株的发酵上清液对这几种病原真菌的菌丝具有明显的裂解作用。同时该菌株所产生丰富的次级代谢产物也是潜在的研究价值所在。

Description

一种珊瑚球菌及其应用

技术领域

本发明属于应用微生物学领域，涉及一株珊瑚球菌及其在病原真菌防治方面的应用。

背景技术

水稻是我国乃至世界部分产区的主要粮食作物，水稻稻曲病是我国主要稻作区水稻生产后期普遍发生的一种真菌性病害，该病主要危害穗部，减产严重的达到10%-20%，给广大稻产区带来巨大的经济损失。近年来，由于气候条件的变化以及不合理的施肥和耕作，导致稻曲病危害日益严重。

棉花是我国重要的经济作物，大部分省区都有种植。据报道，全世界有棉花病害120多种，我国已发现了40余种，其中严重危害的有15种。苗期发生较重的是立枯病、疫病和炭疽病；成株期危害较重的是黄萎病和枯萎病；铃期危害较重的是疫病、红粉病、红腐病和炭疽病等，这些病害常常给棉花生产造成极其严重的经济损失。

黄瓜，又名胡瓜，属葫芦科甜瓜属中幼果具刺的栽培种，一年生攀缘性草本植物，全国各地均有栽培。黄瓜枯萎病一般在结果期才表现症状，即植株下部叶片叶肉部分出现黄色斑痕，叶脉仍保持绿色，再由下向上逐渐萎蔫，后期整叶变黄。切开病株茎秆可见维管束呈褐色，导致植株死亡。

尽管轮作的栽培方式可以有效降低发病程度，但是不能根本上解决病害，化学农药虽然能根本去除病害，但是也给环境带来巨大的污染和破坏，同时通过生物链富集也会对人体健康造成威胁。因此，通过寻求新型的防病﹑治病手段，达到有效的控制病原菌病害，已成为生产实践中迫切需要解决的课题。基于生物防治的高效、安全、环保等优点以及人们对粮食以及生食蔬菜的需求，采取生物防治法已经成为人们关注的焦点问题。

粘细菌是一类具有复杂的多细胞行为和形态的原核生物，属于革兰氏阴性菌，在固体表面能够滑行运动，并广泛存在于土壤以及食草动物粪便之中，其复杂的生活周期，近年来已成为科研工作者研究菌株生理遗传的模式型菌株。粘细菌作为一种高等的原核生物，因其菌株的特异性和特殊的次级代谢产物及其酶类，越来越受到研究者的青睐。这些丰富的次级代谢产物之中包括种类繁多的抗真菌活性物质以及高活性酶类，目前从粘细菌的次级代谢产物中发现具有活性的物质大约近400中，占微生物来源总数的4%左右。近年来，以粘细菌作为目的菌株的研究已经涉及到分子生物学，发育生物学，生物技术以及生物活性物质等多个领域。堆囊菌属和珊瑚状珊瑚球菌属作为粘细菌众多属之中的两大类，被筛选出来的菌株越来越多，其中堆囊菌株研究的更为广泛，而珊瑚状珊瑚球菌，因其很难筛选与培养，目前筛选出来并研究的模式菌株少之又少。

目前重要粮食作物病虫害日益严重，依靠农药防治在防治病虫害的同时，也带来了新的环境污染，因此迫切的需要发现具有高效、绿色无污染的生物防治手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一株新的具有生物防治功能的微生物菌株。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一株珊瑚球菌EGB（Corallococcus coralloides EGB），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。

该珊瑚球菌EGB通过如下方法筛选纯化得到：

1.首先选择合适的土样采集地点，采用合适的采集方法采集土样，然后进行自然风干。因为兔粪是粘细菌的天然基质，并且为了使筛选过程有目的性，后续的粘细菌纯化方法采用粪粒诱导平板法和酵母诱导平板法两种方法，并将兔粪上是否有子实体产生作为筛选的标记。

2.将出现的子实体接种到YWCX固体培养基，反复画线纯化，并最终接种到CAS培养基中，通过浊度的变化情况观察所筛选出来的菌株的纯度。

3.通过生理生化分析与16SrDNA分析，结果与已报道菌株比较，综合分析该菌株的发育类型。

4.采用合适的方法对筛选到的菌株进行保存。

本发明所述的珊瑚球菌EGB在制备防治棉花枯萎病的药物中的应用。

本发明所述的珊瑚球菌EGB在制备防治黄瓜黄枯萎病的药物中的应用。

本发明所述的珊瑚球菌EGB在制备防治水稻稻曲病的药物中的应用。

有益效果

本发明采用兔粪子实体诱导法成功的从所采集的土样中筛选到一株粘细菌菌株，经鉴定为珊瑚球菌，该菌在生长过程中能够抑制多种植物病原真菌的生长，其发酵上清能够很好的裂解多种病原菌的菌丝体，具有较好的实际应用价值，可应用于制备防治花枯萎病、黄瓜黄枯萎病及水稻稻曲病的药物。

附图说明

图1菌株纯化流程图

图2发酵上清液对酵母细胞的裂解TEM图(1.0μm)

左图为去离子水处理酵母细胞，右图为发酵上清液处理酵母细胞。

图3菌株的特性图片

A图为EGB单菌光镜图（100×），B图为EGB单菌TEM图（500nm），C图为EGB菌落光镜图（10×）。

图4基于16S rDNA的菌株EGB系统进化树。

图5菌株生长过程中对植物病原真菌的生长抑制图。

A棉花枯萎病菌；B黄瓜黄枯萎病菌；C水稻稻曲病菌。每幅附图中左边的照片为处理组，右边的照片为对照组。

图6发酵上清液对菌丝体的裂解图

A：上清液处理水稻稻曲病原菌菌丝，B：上清液处理黄瓜枯萎病原菌菌丝，C：上清液处理棉花枯萎病原菌菌丝。每幅附图中左边的照片为对照组，右边的照片为处理组。

生物材料保藏信息

Corallococcus coralloldes EGB,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。

具体实施方式

实施例1.菌株的分离纯化

1.1样品采集后室温下自然风干（减少霉菌及杂菌的污染）。

从山东东营采集土样室温下自然风干。

1.2粘细菌子实体的诱导

1.2.1粪粒诱导平板法：将风干的土样盛大约20克于培养皿内，在土样表面半埋入3-4个灭过菌的兔粪，加入25μg/mL乙醚灭菌的放线菌酮(25mg/ml)或多菌灵(30mg/L)，浸泡6h后，倒去残液，30℃保温培养，48h后开始观察粪球上子实体的形成。

1.2.2酵母诱导平板法：以WCX（青霉素青霉素终浓度100mg/L）培养基作为基础培养基，倒入无菌平板，在培养基表面用酵母划十字线，在十字线中心放少量土样，28℃恒温培养，72h后开始观察子实体的形成。

1.3兔粪子实体的形成

1.3.1粘细菌的分离纯化

①用毛细管尖端挑取1.2.1诱导出的子实体，接种于YWCX（WCX培养基：0.1%CaCl₂·2H₂O；1.5%Agar；25μg/ml放线菌酮溶液；0.1%的结晶紫；pH值7.2）培养基上（用灭菌酵母交叉划线），30℃培养。

②如发现蠕虫，将初步分离纯化的菌落接种于VY/4（安琪酵母0.5%，CaCl₂·2H₂O0.1%，维生素B₁₂0.5μg/mL，琼脂粉1.5%，0.1%的结晶紫；pH7.2；）斜面培养基上，置-80℃冰箱冷冻48h，取出后立即再采用YWCX培养基反复转接法，直至得到纯菌株。

③用毛细管尖端及时挑取疑似菌落边缘的细菌，反复转接于含VY/4培养基的平板，30℃恒温保湿培养。如发现蠕虫，将初步分离纯化的菌落接种于VY/4斜面培养基上置-80℃冰箱冷冻48h。

1.4CAS培养基验证纯度

将纯化后的粘细菌EGB接种于CAS培养基(Casitone1%,MgSO₄.7H₂O0.1%,pH7.2)中，30℃振荡培养2d后培养液澄清即表明该粘细菌为纯菌株。

1.5菌种菌株的功能验证与菌种保藏

1.5.1将纯化的菌株EGB接种到VY/4固体平板培养基上，查看透明圈的形成情况。

1.5.2采用食草兔粪真空干燥保藏法。将纯化的菌种接种到经高温灭菌消毒的食草兔粪，30℃培养5–8d，当子实体出现的时候，将长有子实体的兔粪放入到真空干燥器中保存。

1.6菌株发酵上清液的制备及其对酵母细胞的裂解

将菌株EGB（CCTCC NO：M2012528）接种到VY/4液体培养基（安琪酵母0.5%，CaCl₂·2H₂O0.1%pH7.0）中，30℃培养3-4天，6000rpm离心20min，收集上清液。活性安琪酵母细胞经过热处理之后，用制备的发酵上清液50℃处理2h，并以去离子水处理作为对照。之后通过透射电镜观察酵母细胞的变化情况（图2）。

实施例2．菌株的鉴定

2.1形态学特征（图3）

分离筛选得到的粘细菌EGB经革兰氏染色显示阴性，通过结晶紫染色在100×油镜下观察该菌株单菌的形态，发现该菌株单菌呈杆状，无鞭毛，两端呈透明状，透射电镜下观察单菌周围有一层粘液层；通过光镜10×观察发现该菌株在生长的过程具有群体效应，生长后期单菌聚集在一起形成子实体。

2.2鉴定

通过对该菌株16S rDNA的PCR扩增，得到该菌的16S rDNA基因序列，登录NCBI(www.ncbi.nlm.nih.govPblastP)，将所得测序结果与数据库中已知序列利用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对，获取与实验菌株相似的典型菌株的16S rDNA序列。进一步将该菌株与同源性较高的23个菌株的16S rDNA进行序列比对，利用ClustalX(Version1.83)和MEGA4.1软件进行多序列比对及系统发育树构建，用Neighbor-Join法得到系统进化发育树，结果显示，该菌株与珊瑚球菌(Corallococcus coralloides strainDSM 51548)的16S rDNA碱基序列相似性达100%，即将所分离到的菌株鉴定为珊瑚球菌（Corallococcus coralloides）（图4）。将该菌株送交位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。

实施例3．菌株（Corallococcus sp.EGB）对几种植物病原真菌抗性的研究

3.1选取一种合适的培养基(安琪酵母0.5%，CaCl₂·2H₂O0.1%，马铃薯30%，葡萄糖2%，琼脂1.5%)使菌株EGB（CCTCC NO：M2012528）和几种植物病原真菌：棉花枯萎病菌、黄瓜黄枯萎病菌及水稻稻曲病菌都能够在其上生长，并且营养成分不相互干扰。首先挑取几种植物病原真菌菌丝至平板中央，待病原菌长出健壮菌丝后，在其两侧接上所分离到的粘细菌EGB（CCTCC NO：M2012528），30℃培养4-7天，发现所选取的几种植物病原菌周边菌丝逐渐枯萎，生长明显受到抑制（图5）。

3.2将菌株EGB（CCTCC NO：M2012528）接种到VY/4液体培养基（安琪酵母0.5%，CaCl₂·2H₂O0.1%pH7.0）中，30℃培养3-4天，6000rpm离心20min，收集上清液，备用。

3.3挑取棉花枯萎病菌、黄瓜黄枯萎病菌及水稻稻曲病菌的健壮菌丝，用3.2中制备的发酵上清液30℃处理1-2h，并以去离子水处理作为对照。之后用棉兰染色法对菌丝进行染色，相比于对照组，处理组中的几种植物病原菌的菌丝体着色明显下降，说明菌株的发酵上清液对几种植物病原菌的菌丝结构造成了破坏，使在棉兰染色之后棉兰无法着色（图6）。

Claims

1.珊瑚球菌EGB（Corallococcus coralloides EGB）在制备防治水稻稻曲病的药物中的应用，所述的珊瑚球菌EGB保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。