CN110819574B

CN110819574B - 一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法

Info

Publication number: CN110819574B
Application number: CN201911250990.3A
Authority: CN
Inventors: 陈治国; 刘臻; 张晓粤; 宋学文
Original assignee: Changsha University
Current assignee: Changsha University
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110819574A

Abstract

本发明公开了一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，该方法包括以下步骤：通过将灭活红球藻滴加在Wax固体培养基上，在灭活红球藻周围加入经预处理的淤泥进行培养，形成子实体；对子实体进行纯化培养，得到裂解红球藻的粘细菌。本发明从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法具有工艺简单、操作方便、成本低廉等优点，筛选得到的粘细菌能够裂解红球藻，为研究裂解红球藻的方法提供新的思路，为优化裂解红球藻、从中提虾青素的方法奠定基础，拓宽了粘细菌的应用范围；同时，本发明中采用淤泥来源分布广泛，从淤泥中筛选粘细菌，有利于丰富粘细菌资源。

Description

一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物的筛选方法，尤其涉及一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法。

背景技术

粘细菌(Myxobacteria)是于一种革兰氏阴性菌，主要存在于各种土壤、腐烂的树木、树木的表皮和动物的食物残渣排泄物中。粘细菌被分类归属于变形细菌纲中的δ分枝，现今被已发现的粘细菌被分门别类为3个亚目，并且有21个属，其中还包括大约50个种，粘细菌可以产生组成结构各有不同、类别丰富的代谢产物，具有很高的研究价值，是一种重要的微生物资源。粘细菌生长发育过程一般包括营养细胞生长期和细胞发育期。在营养贫瘠条件下，粘细菌细胞会发生聚集运动，大部分细胞会发生自溶，而存活下来的细胞有序堆积形成多细胞结构，最后形成肉眼可见的子实体，进入休眠状态。而当营养状况良好时，粘孢子又可以重新萌发，呈营养阶段生长，重新开始一轮新的发育。但粘细菌的孕育需要的时间比较长，同时还因为它对生长的密度有依赖性，所以在子实体还没有形成前就很容易被生长比它迅速的杂菌污染，如：霉菌及阿米巴、线虫污染，不仅如此，它的胞外基质较复杂也很容易被染上杂菌。因此，由于这种生长特性，粘细菌的分离和纯化一直是粘细菌资源利用过程中的重点和难点。

现有技术中有多种关于分离粘细菌的研究，通过多种不同的筛选方法得到不同的粘细菌，例如有研究利用微包埋的方法分离了纤维堆囊菌，有研究利用分子法和HPLC结合的方法分离出能够产生埃博霉素的粘细菌菌株，有研究利用溶纤维素粘细菌经低能氮离子诱变得到埃博霉素高产菌株，有研究利用分子生物学技术来分析海底粘细菌的多样性，建立基因库等等。可见，探究不同的分离筛选粘细菌的方法，能够扩大研究粘细菌的分布多样性，丰富的粘细菌资源，拓宽粘细菌的应用范围，具有十分重大的意义。

雨生红球藻可以在体内合成和累积虾青素，是生产虾青素的重要来源。破坏雨生红球藻的细胞将虾青素释放出来从而被提取是现有技术中生产虾青素的主要方法，但是雨生红球藻的细胞壁厚且还存在胶质，因此裂解雨生红球藻的方法是利用雨生红球藻生产虾青素的难点和关键所在。为了使雨生红球藻裂解，现有技术中所采用的方法有匀浆法、冻融温差法、超声波法、直接研磨法及低温研磨法等方法。但匀浆法和超声波法破壁过程中使用的溶剂或介质，对后续的虾青素提取及分离有影响。而直接研磨法因为产生高温，使虾青素的活性有所下降。加液氮低温研磨法虽然没有运用化学试剂，但不适于工厂大规模生产。因此，寻求新的雨生红球藻的裂解方法，对于从红球藻中提取虾青素的工艺具有十分重要的影响，有很大的发展前景。

目前，尚未有关于筛选裂解红球藻的粘细菌的方法的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，筛选得到的粘细菌能够裂解红球藻，本发明提供了一种新的筛选粘细菌的方法，也为研究裂解红球藻的方法提供新的思路。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，包括以下步骤：

S1、将灭活红球藻滴加在Wax固体培养基上，在灭活红球藻周围加入经预处理的淤泥进行培养，形成子实体；

S2、对步骤S1中得到的子实体进行纯化培养，得到裂解红球藻的粘细菌。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S1中，所述灭活红球藻由以下方法获得：

(1)将红球藻藻种接种于BBM培养基中，得到原藻液；

(2)将步骤(1)得到的原藻液接入到BBM培养基中进行培养，直至达到对数生长期；

(3)采用200μmol/m²·s的强光对步骤(2)中培养得到的红球藻进行诱导，使红球藻由绿变红，去除培养基，所得红球藻用121℃高压蒸汽灭菌，得到灭活红球藻。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤(1)中，所述红球藻藻种的接种量为1％；

所述步骤(2)中，所述原藻液与BBM培养基的体积比为1∶2；所述培养的条件为：温度23±0.5℃，光照强度40μmol/m²·s，光周期12∶12，培养时间为6天；

所述步骤(3)中，所述诱导的时间为6天；所述灭菌的时间为30min。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S1中，所述淤泥的预处理方法为：将淤泥与抗生素混合液、放线菌酮溶液混合，所得混合物于55℃水浴下静置10min，在常温下放置12小时，完成对淤泥的预处理。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述淤泥与抗生素混合液、放线菌酮溶液的比例为1g∶3mL∶1mL；所述抗生素混合液是由卡那霉素和氨苄青霉素溶于水制得；所述抗生素混合液中，卡那霉素的浓度为8mg/mL，氨苄青霉素的浓度为30mg/mL；所述放线菌酮溶液由放线菌酮溶解于二甲基亚砜中制得；所述放线菌酮溶液中放线菌酮的浓度为15mg/mL。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S1中，所述培养在温度为30℃下进行；所述培养的时间为10天；所述Wax固体培养基中还含有放线菌酮，浓度为20μg/mL。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S2具体为：

S2-1、将子实体接入Wax固体培养基上进行培养；

S2-2、将经步骤S2-1中经Wax固体培养基培养后得到的细菌转接入Rich液体培养基中进行培养，得到裂解红球藻的粘细菌。

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S2-1中，所述培养至少进行转接培养两次；所述培养在温度为30℃下进行，单次培养的时间为5天；所述Wax固体培养基中还含有放线菌酮，浓度为20μg/mL.

上述的从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法中，进一步的，所述步骤S2-2中，所述Rich液体培养基置于恒温摇床上，恒温摇床的温度为30℃，恒温摇床的转速为150r/min；所述培养的时间为7天。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，通过将灭活红球藻滴加在Wax固体培养基上，在灭活红球藻周围加入经预处理的淤泥进行培养，形成子实体；对子实体进行纯化培养，得到裂解红球藻的粘细菌。本发明中，以灭活红球藻诱导淤泥产生子实体分离菌株，采用灭活红球藻可以避免可能存在的红球藻对抗粘细菌的裂解；进一步对子实体进行纯化培养，有利于获得单克隆菌株。本发明从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法具有工艺简单、操作方便、成本低廉等优点，筛选得到的粘细菌能够裂解红球藻，为研究裂解红球藻的方法提供新的思路，为优化裂解红球藻、从中提虾青素的方法奠定基础，拓宽了粘细菌的应用范围；同时，本发明中采用淤泥来源分布广泛，从淤泥中筛选粘细菌，有利于丰富粘细菌资源。

(2)本发明中，对淤泥进行预处理，具体为将淤泥与抗生素混合液、放线菌酮溶液混合，所得混合物于55℃水浴下10min，再于常温下放置12小时，可以有效杀灭对以上抗生素敏感的菌株，去除淤泥中的其他杂菌，有利于后续目标菌株的分离和提纯。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1中Wax固体培养基上的子实体形态图。

图2为本发明实施例1中体视显微镜下Wax培养基上菌落形态图。

图3为本发明实施例1中MD1液体培养基中菌落形态图。

图4为本发明实施例1中菌株的16S rDNA凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中，如无特别说明，所采用的材料和仪器均为市售，所采用工艺为常规工艺。

实施例1：

一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，将灭活红球藻滴加在Wax固体培养基上，在灭活红球藻周围加入经预处理的淤泥进行培养，形成子实体；对子实体进行纯化培养，得到裂解红球藻的粘细菌。具体方法如下：

1、藻种保藏及藻种扩大培养：

1.1配制BBM培养基：按表1称量BBM培养基各组分，并用500mL的水溶解，得到浓度放大100倍的BBM培养基。将配制好的培养基置于4℃冰箱保存。用时按照配置培养基加纯水稀释100倍，分装，再用处理过的纱布封好瓶口，121℃灭菌30min之后待用。

表1 BBM培养基组分

成分	质量(g)
		NaNO<sub>3</sub>	25
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	7.5
		NaCl	2.5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	7.5
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	17.5
CaCl<sub>2</sub>	2.5
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.88
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O	0.14
		MoO<sub>3</sub>	0.07
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.16
		Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.49
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	1.14
		EDTA	5
KOH	3.1
		FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.5

1.2藻种扩大培养：以BBM培养基作为基础培养基，按接种量为1％，将红球藻的藻种接入装有100mL BBM培养基的锥形瓶(250mL)中，于4℃冰箱保藏，得到原藻液。按体积比为1∶2，将50mL红球藻原藻液接入装有100mL BBM培养基的锥形瓶(250mL)中，放到光照培养箱培养，培养条件为：温度23±0.5℃，光照强度40μmol/m²·s，光周期12∶12。每天摇瓶3～4次，以防藻种粘壁，培养至对数生长期(6天)。

1.3将培养至对数期的红球藻用光强度为200μmol/m²·s的强光诱导6天，使其由绿变红，再进行抽滤，用121℃高压蒸汽灭菌30min，得到灭活的红球藻，于4℃冰箱保藏备用。

2、淤泥样品采集及预处理：

2.1从长沙学院附近月湖获得的淤泥样品(水草附近黑色淤泥)，取1g淤泥样品于烧杯中。

2.2配制抗生素混合溶液：称取24mg卡那霉素、90mg氨苄青霉素于3mL水中(卡那霉素8mg/mL，氨苄青霉素30mg/mL)，注意无菌操作，用已灭菌的滤头和注射器将抗生素混合液拿去过滤除菌。

2.3在装有淤泥的烧杯中加入1mL已过滤除菌的抗生素混合液，再加入用DMSO溶解后的放线菌酮1mL(浓度15mg/mL)，在55℃水浴下静置10min，然后在常温下放置12小时，以去除样品的杂菌。

3、菌株分离：

3.1配制Wax固体培养基(Wax固体培养基组分见表2)：用电子天平称量酵母提取物1g，蛋白胨10g，MgSO₄·7H₂O 1g，CaCl₂·2H₂O 1g，HEPES 10g，超纯水1000mL于大烧杯中，使用玻璃棒搅匀，调节pH至7.2，按每个锥形瓶50mL将所得溶液分装到250mL的锥形瓶中，每个锥形瓶分别加入0.75g琼脂，121℃高压灭菌30min。在Wax固体培养基倒平板前，向其中加入放线菌酮溶液，放线菌酮的终浓度为20μg/mL。倒平板，全程无菌。

表2 Wax固体培养基组分(pH＝7.2)

成分	质量
		酵母提取物	1g
蛋白胨	10g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	1g
HEPES	10g
		琼脂(凝胶强度>1200/cm<sup>2</sup>)	15g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	1g
		超纯水	1000mL

3.2诱导产生子实体：将抽滤且灭菌过的红球藻加些许水使其成酸奶状(太稀的话红球藻会散，太稠又难被侵蚀)，将红球藻滴加在Wax固体培养基上，加少许淤泥于此红球藻滴周围，倒置培养基平板，在生化培养箱30℃培养，观察子实体形成。细菌子实体从有灭活的红球藻的Wax固体培养基上长出花费大约十天，红球藻滴有侵蚀痕迹，表明菌株能够裂解红球藻。Wax固体培养基上的子实体形态如图1所示，图1中白色虚线圈内白圆点即为子实体。

从图1中可以看出，Wax固体培养基上有子实体长出，子实体颜色为白色圆形，光滑不透明，并有小的透明菌膜展开，其菌落长得密集、粘稠难挑取。

4、菌株纯化：

4.1将注射器灭菌，将长出的子实体挑出来放到新鲜的Wax培养基上进行平板划线(用三区划线的方法)，30℃培养5天，再进行两次转接培养，转接前用2.2配制用抗生素溶液洗涤子实体。

4.2配制Rich液体培养基，配方见表3：称量蛋白胨10g，酵母提取物1g，葡萄糖1g，MgSO₄·7H₂O 1g，CaCl₂·2H₂O 1g，HEPES 10g，水1000mL混匀，调pH至6.8，分装，每瓶50mL，包扎好后115℃灭菌30分钟。

将经4.1培养得到的细菌转接入Rich液体培养基中，在恒温摇床中设置30℃，150r/min，培养7天，在Rich液体培养基中，培养基呈淡黄色、较澄清，菌落呈白色球状，大小在3mm左右，有部分菌贴着锥形瓶的壁生长。

表3 Rich液体培养基组分(pH＝6.8)

成分	质量
		蛋白胨	10g
酵母提取物	1g
		葡萄糖	1g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	1g
		CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	1g
HEPES	10g
		超纯水	1000mL

5、菌株保存：

制备60％甘油：量取60mL甘油、40mL水，混匀，121℃高压灭菌30min。无菌环境下，用移液枪取适量纯化后的菌液和甘油吸打混匀(甘油的终浓度在25％)，经计算：取500μL甘油与700μL菌液混匀，-80℃冷冻保藏。

6、菌株鉴定：

6.1将分离得到的菌株接种到Wax培养基上的灭活红球藻旁边，30℃培养箱倒置培养7天，并用体视显微镜观察菌落的形态。体视显微镜下Wax培养基上菌落形态如图2所示：菌落呈白色圆形，由中心向四周辐射状展开，周围有透明的菌膜。

6.2配制MD1液体培养基(MD1液体培养基组分如表4所示)：称量胰蛋白胨6g，可溶性淀粉2g，MgSO₄·7H₂O 2g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，加入超纯水1000mL混合均匀，调节pH至7.2，分别装取，每瓶20mL，121℃30min的条件下灭菌。

表4 MD1液体培养基组分(pH＝7.2)

成分	质量
		胰蛋白胨	6g
可溶性淀粉	2g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.4g
		水	1000mL

将分离得到的菌株接种到MD1液体培养基中，恒温摇床中30℃，150r/min，培养7天。MD1液体培养基中细菌形态如图3所示。由图3可知，MD1液体培养基中，培养基呈无色澄清，菌落呈白色球状，大小在2mm左右，且部分贴壁生长。

6.3革兰氏染色：

从MD1培养基取1mL菌液进行革兰氏染色处理，并通过油镜观察细菌的染色情况。革兰氏染色结果显示，菌液经革兰氏染色为红色，是革兰氏阴性菌，细胞呈细长杆状，与粘细菌革兰氏染色结果相一致。

6.4菌株的16S rDNA扩增及测序：

(1)提取菌株的DNA：采用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)对菌株DNA进行提取，具体提取方法参见该试剂盒的使用说明。将提取到的细菌DNA于﹣20℃保存备用。

(2)以所得细菌DNA为模板，以基因通用引物对细菌16S rDNA进行PCR扩增。

扩增引物为：

上游引物16S BF：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物16S BR：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.2)。

扩增体系为：

5μL 10×buffer，2μL上游引物，2μL下游引物，4μL dNTP，2μL细菌DNA，1μL Taq酶和34μL ddH₂O，总体积50μL。

扩增程序为：94℃4min，94℃45s，52℃45s，72℃2min，30个循环。

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。由图4可知，在1500bp左右具有特异性条带的扩增产物，符合目的条带。

(3)纯化回收扩增产物：采用碧云天的PCR纯化试剂盒D0033对扩增产物进行纯化回收，具体方法参见该试剂盒的使用说明。将纯化回收后的扩增产物，送去铂尚生物技术(上海)有限公司-长沙测序部测序。

测序结果表明，菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为1495bp。用BLAST程序将所得的测序结果与Gen Bank中的序列进行相似性分析，结果表明该菌株与多囊菌属的Polyangium sp.strain 16S rDNA序列同源性最高，为99％，是粘细菌。

菌株16S rDNA序列(SEQ ID NO.3)：

GCTGCCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACGCGGGGCAACCTGGCGACGAGTGCGAACGGGTGAGTAATGCATCGGAACGTACCCAGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCGGGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTATTGGAGCGGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTCAGGGAAGAAACGCGCTGGGCTAATACCTCGGCGTAATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTACACGGCTAGAGTACGGCAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGTCCCCTGGGCCCGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGACGGCTTGCTGTTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCCGGAATCCTGTAGAGATGTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAAACCGGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 长沙学院

<120> 一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为扩增粘细菌16S rDNA的上游引物16S BF

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为扩增粘细菌16S rDNA的下游引物16S BR

<400> 2

acggctacct tgttacgact t 21

<210> 3

<211> 1495

<212> DNA

<213> 粘细菌(Myxobacteria)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1495)

<223> 粘细菌16S rDNA

<400> 3

gctgccctta gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgctg gcggcatgcc ttacacatgc 60

aagtcgaacg gtaacgcggg gcaacctggc gacgagtgcg aacgggtgag taatgcatcg 120

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gggatggaat tccgcgtgta gcagtgaaat gcgtagatat gcggaggaac accgatggcg 720

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ttcagtaacg aagctaacgc gtgaagttga ccgcctgggg agtacggccg caaggttgaa 900

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tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaggtcct catggccctt 1200

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agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc ttgccgcggt gaatacgttc ccgggtcttg 1380

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg gttctgccag aagtagttag cctaaccgca 1440

aggagggcga ttaccacggc agggttcgtg actggggtga agtcgtaaca aggta 1495

Claims

1.一种从淤泥中筛选裂解红球藻的粘细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将灭活红球藻滴加在Wax固体培养基上，在灭活红球藻周围加入经预处理的淤泥进行培养，形成子实体；所述淤泥的预处理方法为：将淤泥与抗生素混合液、放线菌酮溶液混合，所得混合物于55℃水浴下静置10min，在常温条件下放置12小时，完成对淤泥的预处理；所述淤泥与抗生素混合液、放线菌酮溶液的比例为1g∶3mL∶1mL；所述抗生素混合液是由卡那霉素和氨苄青霉素溶于水制得；所述抗生素混合液中，卡那霉素的浓度为8mg/mL，氨苄青霉素的浓度为30mg/mL；所述放线菌酮溶液由放线菌酮溶解于二甲基亚砜中制得；所述放线菌酮溶液中放线菌酮的浓度为15mg/mL；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述灭活红球藻由以下方法获得：

(1)将红球藻藻种接种于BBM培养基中，得到原藻液；

(3)采用200μmol/m²·s的强光对步骤(2)中培养得到的红球藻进行诱导，使红球藻由绿变红，去除培养基，所得红球藻用121℃的高压蒸汽灭菌，得到灭活红球藻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述红球藻藻种的接种量为1％；

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述培养在温度为30℃下进行；所述培养的时间为10天；所述Wax固体培养基中还含有放线菌酮，浓度为20μg/mL。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：

S2-1、将子实体接入Wax固体培养基上进行培养；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2-1中，所述培养至少进行转接培养两次；所述培养在温度为30℃下进行，单次培养的时间为5天；所述Wax固体培养基中还含有放线菌酮，浓度为20μg/mL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2-2中，所述Rich液体培养基置于恒温摇床上，恒温摇床的温度为30℃，恒温摇床的转速为150r/min；所述培养的时间为7天。