CN112522115B - 副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法 - Google Patents

副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法。本发明所述方法包括副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备；少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的孢子悬液的制备；将副氧化微杆菌发酵液的上清液与制备得到的孢子悬液混匀，培养即得。本发明首次发现副氧化微杆菌的发酵液可有效诱导少孢节丛孢产生捕食器官，本发明采用副氧化微杆菌的发酵液诱导少孢节丛孢产生捕食器官的方法更有利于推广应用，为生物防治线虫的有效实施提供可能。

Description

副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及 方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法。
背景技术
寄生线虫每年给全球造成巨大的经济损失，化学防治由于破坏生态环境，容易造成寄生线虫的抗药性，并在农产品和畜产品中残留，因此生物防治线虫受到关注。捕食线虫真菌通过营养菌丝特化形成粘性菌网、粘性球、粘性分枝、粘性菌丝、冠囊体、收缩环等捕食器官捕杀线虫，是线虫生防的重要来源之一。捕食器官是捕食线虫真菌捕食线虫的重要武器，其形成与否以及形成多少都将影响捕食线虫真菌的捕食效果，在线虫生防上有重要的应用价值。
少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是捕食线虫真菌的模式种，其产生粘性菌网来捕捉线虫，目前有报道氨基酸、多肽等能诱导少孢节丛孢(A.oligospora)产生三维菌网，氨基酸、多肽等有的价格较高，有的不易获取，不利于大规模推广应用。因而，寻找一种可有效诱导少孢节丛孢产生捕食器官并可广泛推广应用的方法，对于生物防治线虫的有效实施具有重要的意义。
发明内容
本发明主要目的是提供副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法。本发明首次发现副氧化微杆菌的发酵液可有效诱导少孢节丛孢产生捕食器官，并且副氧化微杆菌的发酵液易于获得且可大规模生产，因而本发明采用副氧化微杆菌的发酵液诱导少孢节丛孢产生捕食器官的方法更有利于推广应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)在诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官中的应用。
进一步地，所述捕食器官为三维菌网。
本发明还提供一种诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官的方法，所述方法包括以下步骤：
副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备；
少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的孢子悬液的制备；
将副氧化微杆菌发酵液的上清液与制备得到的孢子悬液混匀，培养即得。
进一步地，副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备：取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株进行活化，将活化后菌株进行种子培养；将种子液接种到发酵培养基进行发酵，发酵完成后将发酵液进行离心，取上清液即得。
进一步地，所用副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株，已于2019年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.19121。
进一步地，副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)所用活化培养基、种子培养基及发酵培养基分别为LB培养基。
进一步地，种子液接种量按0.5％-2％v/v接入到发酵培养基中。
进一步地，将接种后的发酵培养基置于20℃～30℃恒温摇床培养36-96小时。
进一步地，少孢节丛孢(A.oligospora)孢子悬浮液制备方法：将少孢节丛孢菌株切块接种在PDA固体培养基中，20-30℃培养5-8天活化菌株，活化了的菌株切块转接到CMA固体培养基中，20-30℃培养8-12天，待长出大量孢子，用无菌水洗下孢子，配成孢子悬浮液。
进一步地，将副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液与少孢节丛孢(A.oligospora)的孢子悬液按体积比1:1-10混合。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明首次发现副氧化微杆菌的发酵液可有效诱导少孢节丛孢产生捕食器官。副氧化微杆菌的发酵液易于获得且可大规模生产，成本低廉，因而本发明采用副氧化微杆菌的发酵液诱导少孢节丛孢产生捕食器官的方法更有利于推广应用。本发明为生物防治线虫的有效实施提供可能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1所述方法及对照组诱导少孢节丛孢产生捕食器官对比图：图1A为对照组少孢节丛孢产生捕食器官观察图；图1B为实施例1所述方法诱导少孢节丛孢产生捕食器官观察图；
图2为本发明实施例2所述方法及对照组诱导少孢节丛孢产生捕食器官对比图：图2a为对照组少孢节丛孢产生捕食器官观察图；图2b为实施例2所述方法诱导少孢节丛孢产生捕食器官观察图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官的方法
所述方法包括：
(1)副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备：
取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株接种到LB固体培养基上进行活化，将活化后菌株接种到LB液体培养基中进行种子培养；在装有120mL LB液体培养基的三角瓶中接种100μL M.paraoxydans，32℃恒温摇床内培养72小时。发酵液用高速离心机在10000rpm下离心5min分离菌液和菌体，得到发酵上清液。
所用副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株保藏号为：CGMCCNo.19121，2019年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
(2)少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的孢子悬液的制备：
将少孢节丛孢菌株切块接种在PDA固体培养基中，26℃培养8天活化菌株，活化了的菌株切块转接到CMA固体培养基中，26℃恒温培养箱中培养8-12天待长出大量孢子，用无菌水洗下孢子，配成孢子悬浮液。
(3)将步骤(1)所得发酵上清液200μL与步骤(2)所得孢子悬液200μL混合，均匀涂布在WA固体培养上，28℃恒温培养。
在WA固体培养基上加入LB液体培养基200μL和孢子悬液200μL(1:1，v/v)混匀涂布置于28℃恒温培养箱内培养，以此作为对照。
在培养36h用显微镜观察，实施例组的少孢节丛孢产生大量的捕食器官三维菌网，而对照组基本没有捕食器官三维菌网形成。如图1所示。
实施例2诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官的方法
所述方法包括：
(1)副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备：
取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株接种到LB固体培养基上进行活化，将活化后菌株接种到LB液体培养基中进行种子培养；将种子液按1％v/v接种量接种到LB液体培养基中进行发酵，32℃恒温摇床培养72小时，发酵完成后将发酵液10000rpm下离心5min，得发酵上清夜。
所用副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株保藏号为：CGMCCNo.19121，2019年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
(2)少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的孢子悬液的制备：
将少孢节丛孢菌株切块接种在PDA固体培养基中，26℃培养8天活化菌株，活化了的菌株切块转接到CMA固体培养基中，26℃培养12天，待长出大量孢子，用无菌水洗下孢子，配成孢子悬浮液。
(3)将步骤(1)所得发酵上清液与步骤(2)所得孢子悬液按体积比1:1.5混合，均匀涂布在WA固体培养上，28℃恒温培养。
在WA固体培养基上加入LB液体培养基100μL和孢子悬液150μL(1:1.5，v/v)混匀涂布置于28℃恒温培养箱内培养，以此作为对照。
在培养36h内用显微镜观察，实施例组的少孢节丛孢产生较多的捕食器官三维菌网，而对照组基本没有捕食器官三维菌网形成。如图2所示。
实施例3诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官的方法
所述方法包括：
(1)副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)发酵上清液的制备：
取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株接种到LB固体培养基上进行活化，将活化后菌株接种到LB液体培养基中进行种子培养；将种子液按2％v/v接种量接种到LB液体培养基中进行发酵，35℃恒温摇床培养36小时，发酵完成后将发酵液10000rpm下离心5min，得发酵上清夜。
所用副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株保藏号为：CGMCCNo.19121，2019年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
(2)少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的孢子悬液的制备：
将少孢节丛孢菌株切块接种在PDA固体培养基中，30℃培养5天活化菌株，活化了的菌株切块转接到CMA固体培养基中，30℃培养8天，待长出大量孢子，用无菌水洗下孢子，配成孢子悬浮液。
(3)将步骤(1)所得发酵上清液与步骤(2)所得孢子悬液按体积比1:10混合，均匀涂布在WA固体培养上，28℃恒温培养。
在WA固体培养基上加入LB液体培养基20μL和孢子悬液200μL(1:10，v/v)混匀涂布置于28℃恒温培养箱内培养，以此作为对照。在培养96h内用显微镜观察，实施例组的少孢节丛孢产生捕食器官三维菌网，而对照组基本没有捕食器官三维菌网形成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）在诱导少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)产生捕食器官中的应用，其特征在于，所述副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）保藏编号为CGMCC No.19121。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述捕食器官为三维菌网。
3.一种诱导少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)产生捕食器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
副氧化微杆菌（Microbacterium paraoxydans）发酵上清液的制备；
少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)的孢子悬液的制备；
将副氧化微杆菌发酵液的上清液与制备得到的孢子悬液混匀，培养即得；
所用副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）菌株，已于2019年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.19121。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）发酵上清液的制备：取副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）菌株进行活化，将活化后菌株进行种子培养；将种子液接种到发酵培养基进行发酵，发酵完成后将发酵液进行离心，取上清液即得。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）所用活化培养基、种子培养基及发酵培养基均为LB培养基。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，种子液接种量按0.5%-2%v/v接入到发酵培养基中。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，将接种后的发酵培养基置于25°C～35°C恒温摇床培养36-96小时。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，将副氧化微杆菌（Microbacteriumparaoxydans）发酵上清液与少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)的孢子悬液按体积比1:1-10混合。
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