CN106190932B - 一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用 - Google Patents

一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用。一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。本发明还公开了利用该菌制备液体微生物菌剂的方法以及它们在防治甜瓜根腐病上的应用。本发明首次发现的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在低浓度下能够有效抑制腐皮镰孢菌的生长，且杀菌应用范围广，对黄瓜根腐病、番茄根腐病等均具有防治效果。

Description

一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用，属于植物病害生物防治技术领域。
背景技术
根腐病是甜瓜的常见病，以分苗或定植后缓苗前较为常见，危害严重。其病原菌主要为瓜类腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)，病菌以厚垣孢子、菌丝体或菌核在土壤中及病残体上越冬，厚垣孢子可在土壤中存活5-10年。厚垣孢子为引起发病的主要侵染源，病菌从根部伤口侵入，发病后在病部产生分生孢子，借雨水或浇水传播蔓延，进行重复侵染，一旦发生很难治愈。长期以来，该病害的田间防治主要依赖化学杀菌剂，随着咯菌腈、苯并咪唑类化学药剂的大量使用，腐皮镰孢菌已经对该类杀菌剂产生了抗药性，使得防效下降。病原菌的潜伏侵染会造成甜瓜反复染病，这些都影响农产品的品质及危害人和动物的健康，制约高产高效农业的发展。随着人们对环境保护和食品安全越来越重视，研发更加安全、环保的根腐病防治新技术，如生物防治，显得更加迫切。
蜡样芽孢杆菌是一种芽孢杆菌，在其自身生长繁殖过程中可以产生一系列具有抗菌活性的代谢产物，能够抑制有害微生物的繁殖，抑制镰刀菌、立枯丝核菌等病原真菌。代谢过程中产生蛋白酶等多种活性酶类，能够降解土壤中的营养成分，改善生态环境，促进作物生长。蜡样芽孢杆菌的芽孢具有较强的耐热、耐盐等抗逆性，在发酵工艺、剂型加工、贮存、定殖、繁殖等方面与其他芽孢杆菌相比具有无可比拟优势。
目前国内外对芽孢杆菌的研究比较多，市场上的芽孢杆菌菌剂有粉剂、颗粒、液体，体菌剂产品大都达不到质量标准要求，尤其是国内的液体菌剂产品良莠不齐，菌株功能较差甚至根本没有功效，退化严重或活菌数不达标，保质期达不到要求。固体剂型虽然解决了产品货架期问题，但是固体菌剂的加工工艺使得菌体的多数代谢产物加工过程中失活或被丢弃，造成了环境污染和资源浪费，且增加了生产成本。
中国专利文献CN101357857 A(申请号200810013122.9)公开了一种用于水产养殖水稻田的生物有机肥料及其生产方法。肥料包含下列重量份的原料加工制成：牛磺酸0.3～0.5份，吸水链霉菌2～3份，金产色链霉菌2～3份，蜡样芽孢杆菌2～4份，球形芽孢杆菌2～4份，胶冻样芽孢杆菌9～13份，褐球固氮菌2～3份，细黄链霉菌2～3份，水果废渣降解物10份，基质10份，土壤46.5～57份。
中国专利文献CN104988098A(申请号201510455413.3)公开了一株防治甜菜根腐病并且促进甜菜生长的芽孢杆菌菌株。该发明所提供的防治甜菜根腐病并且促进甜菜生长的芽孢杆菌菌株是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LHTYBA，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7566。田间实验证明，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LHTYBA对甜菜根腐病的防治效果可达86.7％，可使甜菜增产46.00％。但是该发明所指甜菜根腐病主要是立枯丝核菌和尖刀镰孢菌，对瓜类腐皮镰孢菌没有防治作用。
因此分离制备对瓜类腐皮镰孢菌具有特定生防功能的蜡样芽孢杆菌菌株并研究其液体菌剂配方工艺，用于研制甜瓜根腐病专用型液体菌剂，快速降低土壤中根腐病原菌数量。对于生产高活性、长货架期的液体生防菌剂产品，降低菌剂生产成本、资源的高效综合利用以及有效控制甜瓜根腐病的危害具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌及培养方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。
上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3的培养方法，步骤如下：
(1)将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在LB平板培养基上活化培养，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株转接至LB液体培养基中经种子培养，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积比0.5％～3.0％的比例接种于发酵培养基中，经发酵培养，制得蜡样芽孢杆菌NY3发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的LB平板培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉15～20g，水定容至1000mL，pH值为7.2.
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养，温度为35～38℃，时间为18～24h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6g，氯化钠4～6g，水定容至1000mL，pH值为7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中种子培养，温度为32～37℃，时间为16～24h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中发酵培养基，每升组分如下：
葡萄糖20～30g，玉米浆干粉11～18g，黄豆粉15～40g，酵母浸膏1～2g，磷酸二氢钾0.1～0.3g，氯化钠0.1～0.2g，硫酸镁0.1～0.2g，水定容至1000mL，pH值为7.3。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中发酵培养，温度为32～37℃，摇床转速为170～210rpm，时间为30～42h。
一种防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，组分如下，均为重量百分比：
蜡样芽孢杆菌NY3发酵液10～30％，生化黄腐酸钾3.0～10.0％，甘油5.0～10.0％，硝酸钾6.0～12.0％，尿素2.0～6.0％，蔗糖1.0～3.5％，海藻酸钠0.05～0.01％，硼酸0.5～1.5％，半乳糖0.2～1.2％，无菌水余量。
上述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
按比例将蜡样芽孢杆菌NY3发酵液与无菌水混合，然后加入生化黄腐酸钾、甘油、硝酸钾、尿素、蔗糖、海藻酸钠、硼酸、半乳糖，混合均匀，即得。
上述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的施用方法，步骤如下：
定苗后12～15天时开始冲施防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，每亩用量3～5L/次，每隔18～22天冲施一次，在初花期至拉秧期施用3～5次，即可。
有益效果
1、本发明首次发现的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在低浓度下能够有效抑制腐皮镰孢菌的生长，且杀菌应用范围广，对黄瓜根腐病、番茄根腐病等均具有防治效果；
2.本发明的液体农用微生物菌剂用于防治由病原真菌引起的甜瓜根腐病，病原真菌为瓜类腐皮镰孢菌，该液体农用微生物菌剂抗瓜类腐皮镰孢菌专一性强、功效稳定，具有较长货架期、高活性菌株、活菌量达到1×109CFU/ml；
3.本发明的蜡样芽孢杆菌生防液体菌剂对作物具有明显促生作用，并使甜瓜发病率和严重度分别下降了69％～73％和91％～95％。
附图说明
图1-A为本发明实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3的菌落形态照片；
图1-B为本发明实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3的芽孢形态照片；
图1-C为根据16S rDNA序列获得的蜡样芽孢杆菌NY3菌株的系统发育树图；
图2-A为本发明实施例3的蜡样芽孢杆菌NY3对腐皮镰孢菌的抑菌作用结果照片；
其中：左图为对照，右图为涂布蜡样芽孢杆菌NY3；
图2-B为本发明中实施例1的蜡样芽孢杆菌NY3对尖刀镰孢菌的抑制作用结果照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus.Frankland)NY3的分离及鉴定
1、蜡样芽孢杆菌NY3的分离
选择山东省临沂市大棚甜瓜根际土壤土壤样本，使用灭菌采样铲采集同一区域内生长情况良好的甜瓜根际范围5～25cm深土壤，样品装于灭菌袋中，带回实验室后放于4℃冰箱保存。分离时称取10g土样放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分震荡30min，待土样均匀分散后，静置10min后，形成浓度为0.1g/ml的菌悬液，对此菌悬液进行稀释，依次得到浓度为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7g/ml的菌悬液。将各梯度稀释液分别在80℃水浴加热20min，分别吸取各梯度稀释的土壤悬液各0.1ml，涂布于壳聚糖选择性培养平板上，37℃培养2～4d后，挑取单菌落纯化，作物待测菌株。
蜡样芽孢杆菌的初筛：制备约2.5×105个/mL的甜瓜根腐病病菌孢子悬浮液，吸取2ml该孢子悬浮液涂布于PDA固体培养基平板中，预培养10h，用灭菌牙签均匀点接待测菌种于PDA固体培养基，并置于28℃的恒温培养箱下培养3d，观察有无抑菌圈。结合盆栽试验法进行筛选，从中筛选出一个对甜瓜根腐病具有明显防治效果的菌株，定名为NY3。
NY3菌株的分类鉴定：
(1)形态特征鉴定
在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)，菌落大，直径5～7mm表面粗糙，扁平，不规则。在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(M.S.P)培养基上生长更旺盛，菌落直径达8～10mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素如图1-A。另取培养24h后的菌落，适当稀释后涂布于载玻片，革兰氏染色，置于显微镜下观察。革兰氏染色显阳性，产生芽孢，芽孢呈椭圆形，位于菌体中部，无荚膜，菌体细胞杆状，末端方，成链状，如图1-B。
(2)分子鉴定
PCR扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3的16S rDNA，引物核苷酸序列如下：
27F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；
1429R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’；
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长为1449bp。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，2016年01月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。
实施例2、NY3菌种的扩繁
上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3的培养方法，步骤如下：
(1)将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3在LB平板培养基上，温度为37℃活化培养20h，制得活化菌株；
所述LB平板培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g，酵母提取物为5g，氯化钠5g，琼脂粉18g，水定容至1000mL，pH值为7.2；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株转接至LB液体培养基中，温度为37℃、摇床转速200rpm的条件下种子培养18h，制得种子液；
所述LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g，酵母提取物为5g，氯化钠5g，水定容至1000mL，pH值为7.2；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积比1.0％的比例接种于发酵培养基中，温度为37℃、摇床转速为200rpm发酵培养32h，制得蜡样芽孢杆菌NY3发酵液；
所述发酵培养基，每升组分如下：
葡萄糖2.0～3.0g，玉米浆干粉1.1～1.8g，黄豆粉1.5～4.0g，酵母浸膏0.1～0.2g，磷酸二氢钾0.01～0.03g，氯化钠0.01～0.02g，硫酸镁0.01～0.02g，水定容至1000mL，pH值为7.3；
经镜检，计算芽孢率：芽孢率(％)＝成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)×100％；
制得的蜡样芽孢杆菌NY3发酵液芽孢率达到90％以上。
实施例3、NY3菌株对甜瓜根腐病菌丝的抑制作用
1、在PDA培养基平板中央接种甜瓜根腐病菌菌块，在28℃预培养1d后，在平板中央和距离中央2cm处接种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3菌株，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，实验重复三次。测量抑菌带平均宽度达16mm。
2、取500μL浓度为1.0×107cfu/ml的甜瓜根腐病菌孢子悬浮液，分装至1.5ml离心管中，再往离心管中加入50μL实施例2制备的蜡样芽孢杆菌NY3发酵液，对照组加入等量无菌水，分别与甜瓜枯萎病菌孢子悬浮液混匀后置28℃恒温培养。每个实验重复3次，统计蜡样芽孢杆菌NY3发酵液在24h和36h对甜瓜根腐病菌分生孢子萌发的抑制率。
抑制率＝(对照萌发率-实验萌发率)×100％/对照萌发率
结果表明在24h时，蜡样芽孢杆菌NY3发酵液对甜瓜根腐病菌分生孢子萌发的抑制率是82.27％，在36h时，蜡样芽孢杆菌NY3发酵液对甜瓜根腐病菌分生孢子萌发的抑制率是89.21％。
实施例4、防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的制备
防治甜瓜根腐病的微生物菌剂按照如下步骤制备：
(1)将实施例2制得的蜡样芽孢杆菌NY3发酵液进行芽孢计数，得到发酵液芽孢数为50×109CFU/ml，用无菌水稀释蜡样芽孢杆菌NY3发酵液，制得1×109CFU/ml的稀释后菌液；
(2)用步骤(1)制得的1×109CFU/ml的稀释后菌液，分别按照重量百分比添加保护剂：生化黄腐酸钾8％，海藻酸钠0.05％，甘油10.0％，蔗糖2.5％，半乳糖0.6％，硝酸钾8.0％，尿素4.0％，硼酸0.9％，充分溶解，混合均匀，即得到防治甜瓜根腐病的微生物菌剂；
防治甜瓜根腐病的微生物菌剂菌种存活率测定：将步骤(2)得到的NY3液体菌剂分装至50ml离心管中，室温存放；前三个月每隔15d取样测定一次活菌数，之后每隔30d取样测定一次，统计NY3菌株在菌剂中的存活率；
防治甜瓜根腐病的微生物菌剂中蜡样芽孢杆菌活菌数的测定：制剂中初始的活菌数通过系列稀释涂板确定，使用营养琼脂培养基；
制备的防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，在整个测定周期内，蜡样芽孢杆菌在前1个月内活菌数较初始呈增加趋势，其中放置15d时活菌较初始增加最多，因蜡样芽孢杆菌中的部分营养体依旧具有繁殖能力，之后逐步开始衰退，在120d时仍能保持94％以上的存活率；随着放置时间的增加，蜡样芽孢杆菌NY3的存活率逐渐降低，在放置12个月时，蜡样芽孢杆菌的存活率降至86％。
实施例5、防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的使用方法
防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的使用方法为：
选择寄主对病原菌比较明显的定植初期、花期和幼果期，开始使用上述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，先冲施，改善土壤环境，抑制有害菌群的繁殖，占领生存空间。
从定植后7天开始灌根，每20d冲施一次可以有效减少甜瓜根腐病的发生率，在定植后至采收期施用4次防治甜瓜根腐病，发病率和严重度分别下降了69％～78％和91％～96％，另外，可将该液体复合生防菌剂与稀释后液体肥、水溶肥配合冲施，提高作物对养分的利用及抗病效果。
实施例6、蜡样芽孢杆菌NY3对甜瓜根腐病防治效果的对比试验
(一)试验处理：
(1)微生物菌剂：实施例4制备的防治甜瓜根腐病的微生物菌剂；用水稀释100倍。
(2)化学药剂：50％多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)；用水稀释500倍。
(3)空白对照：清水。
(二)试验方法：本试验在国家缓控释肥工程技术研究中心生防菌剂实验室及智能玻璃温室内进行。在50孔育苗盘中育甜瓜苗(新丰甜一号甜瓜，安徽省丰乐农科院选育)，长出2片复叶时移栽到直径20厘米的花盆中，每盆1棵苗，移栽的同时接种病原菌菌块。共设3个处理，每个处理10个重复，待植株生长至5～6片复叶时，选择1个处理用实施例4所得的防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，用水稀释后(悬浮液含菌体107cfu/ml)的蜡样芽孢杆菌进行灌根，使菌剂充分到达根部。同时以未用菌剂的清水、多菌灵为对照处理，整个生长期内冲施2次。待空白对照充分发病后调查根腐病发病情况，计算防治效果。计算发病率和防效，结果如表1。
发病率＝发病株数/处理总株数×100％。
防治效果＝(对照发病率-实验发病率)/对照发病率×100％
表1蜡样芽孢杆菌NY3对甜瓜根腐病防效的对比试验结果
结果(见表1)盆栽接种结果表明，本发明蜡样芽孢杆菌NY3对甜瓜根腐病防效为60.7％，化学药剂的防效为64.47％，NY3对甜瓜根腐病的防治与化学药剂接近，说明防治甜瓜根腐病的微生物菌剂对甜瓜根腐病具有很好的防治效果。
实施例7、蜡样芽孢杆菌NY3对甜瓜根腐病防治效果的对比实验
(一)试验处理：
(1)微生物菌剂：实施例4制备的防治甜瓜根腐病的微生物菌剂；用水稀释100倍。
(2)化学药剂：50％多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)；用水稀释500倍。
(3)空白对照：清水。
(二)试验方法：2015年2-5月在山东省临沂市临沭县金正大产品实验示范园大棚内进行。开始试验时整个大棚甜瓜为第二茬种植，甜瓜根腐病为中度发生，土壤为常规施肥。每小区四行，四次重复，随机区组排列。移栽后7天对甜瓜进行灌根处理，之后每20天冲施1次，处理组为实施例四所制备的蜡样芽孢杆菌NY3液体菌剂(用水稀释100倍，含活菌数107cfu/ml)；另设对照药剂和空白对照。药剂处理施用方式同菌剂处理，整个生长期施用4次。开花前调查各个处理小区的发病植株数量，并计算防效。
结果(见表2)防治甜瓜根腐病的微生物菌剂处理后，其甜瓜根腐病的发病植株数显著低于空白对照，略高于化学药剂对照，其防效达到75.81％，说明防治甜瓜根腐病的微生物菌剂对甜瓜根腐病有很好的防治效果。
表2蜡样芽孢杆菌NY3对甜瓜根腐病防效的对比试验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一株防治甜瓜根腐病的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC NO.11962。
2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3的培养方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）NY3在LB平板培养基上活化培养，制得活化菌株；
（2）将步骤（1）制得的活化菌株转接至LB液体培养基中经种子培养，制得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液按体积比0.5%～3.0%的比例接种于发酵培养基中，经发酵培养，制得蜡样芽孢杆菌NY3发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的LB平板培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6 g，氯化钠4～6 g，琼脂粉15～20 g，水定容至1000mL，pH值为7.2。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养，温度为35～38℃，时间为18～24h。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨8～12g，酵母提取物为4～6 g，氯化钠4～6 g，水定容至1000mL，pH值为7.2。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子培养，温度为32～37℃，时间为16～24h。
7.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养基，每升组分如下：
葡萄糖20～30g，玉米浆干粉11～18 g，黄豆粉15～40 g，酵母浸膏1～2 g，磷酸二氢钾0.1～0.3 g，氯化钠0.1～0.2 g，硫酸镁0.1～0.2 g，水定容至1000mL，pH值为7.3。
8.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养，温度为32～37℃，摇床转速为170～210rpm，时间为30～42h。
9.一种防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，其特征在于，组分如下，均为重量百分比：
蜡样芽孢杆菌NY3发酵液10～30%，生化黄腐酸钾3.0～10.0%，甘油5.0～10.0%，硝酸钾6.0～12.0%，尿素2.0～6.0%，蔗糖1.0～3.5%，海藻酸钠0.05～0.01%，硼酸0.5～1.5%，半乳糖0.2～1.2%，无菌水余量。
10.权利要求9所述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
按比例将蜡样芽孢杆菌NY3发酵液与无菌水混合，然后加入生化黄腐酸钾、甘油、硝酸钾、尿素、蔗糖、海藻酸钠、硼酸、半乳糖，混合均匀，即得。
11.权利要求9所述防治甜瓜根腐病的微生物菌剂的施用方法，其特征在于，步骤如下：
定苗后12～15天时开始冲施防治甜瓜根腐病的微生物菌剂，每亩用量3～5L/次，每隔18～22天冲施一次，在初花期至拉秧期施用3～5次，即可。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109536423B (zh) * 2019-01-11 2022-06-07 宁夏医科大学 一种蜡样芽孢杆菌的培养方法及其专用培养基
CN113122468B (zh) * 2019-12-30 2023-03-10 杭州远大生物制药有限公司 制备蜡样芽孢杆菌的方法及其应用
CN114621946B (zh) * 2022-04-07 2023-07-04 施可丰化工股份有限公司 一种防治大豆根腐病的生防菌剂及其制备方法
CN114853543A (zh) * 2022-04-20 2022-08-05 青海省湟中县海宁合资化肥厂 一种防治枸杞根腐病液体肥、制备方法、防治方法及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101463333B (zh) * 2009-01-09 2013-10-09 南京工业大学 高活性蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法
CN102433280B (zh) * 2011-12-15 2013-07-31 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一种溶磷复合微生物菌剂及其应用
CN104988098B (zh) * 2015-07-29 2018-07-13 中国农业大学 一株防治甜菜根腐病并且促进甜菜生长的芽孢杆菌菌株

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mode of Action of Bacillus subtilis for Control of Avocado Postharvest Pathogens;L. Korsten et al;《South African Avocado Growers’ Association Yearbook》;19951231;第124-130页 *

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