CN112438277B

CN112438277B - 一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用

Info

Publication number: CN112438277B
Application number: CN202110036335.9A
Authority: CN
Inventors: 彭华正; 朱汤军; 金群英; 张飞英; 叶华琳
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-01-12
Also published as: CN112438277A

Abstract

一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种炭角菌科真菌sj18及其次生代谢产物在控制松材线虫上的作用。本发明的炭角菌科真菌sj18及其次生代谢产物源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对松材线虫有高效的抑制作用，可作为无公害新型生物农药，用于松材线虫感染引起的松树萎蔫病的无害化防治。

Description

一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及炭角菌科真菌sj18在松材线虫防治上的应用。

背景技术

松材线虫病是由松树感染寄生虫——松材线虫引起松树萎蔫死亡的一种国际重大检疫性病害。1982年我国首次在南京市紫金山黑松上发现松材线虫病，死树265株，到2017年，35年时间内松材线虫病先后在18个省的300多个市县发生。在我国松材线虫病是一种典型的病原主导性病害，即病害的发生取决于有没有病原的感染，一旦感病，其结果就是死亡，因此，被称为松树的“癌症”。我国全国松林面积有5亿多亩，三十多年来的观察发现，我国所有乡土松树如马尾松、黑松、赤松、琉球松、华山松、云南松、思茅松、黄山松、华山松、红松等都是易感病树种。事实上，目前松材线虫病已经成了我国的头号森林病虫害。松材线虫病是一种相对比较复杂的病害，它由媒介昆虫-松墨天牛传播，所以这个病害既涉及到病，又涉及到虫，非常复杂。目前，防治媒介昆虫主要有以下几种做法：一是喷洒化学药剂；二是用引诱剂引诱媒介天牛；三是生物防治。在自然界中喷洒化学药剂，要求每隔几天大面积喷洒一次药剂，这个办法经济成本很高。引诱剂防治存在的问题是，无法回答防治后林间还有多少天牛数量，因此显然也不能把它做为松材线虫病防控的主要手段。生物防治措施方面当前主要有两个，一个是真菌—球孢白僵菌：寄生天牛幼虫使其死亡；第二个是天敌昆虫—管氏肿腿蜂、花绒寄甲：可寄生天牛幼虫使其死亡；但这些方法在林间的影响因素很多，防治效果很不稳定，也不确定。在控制松材线虫病方面，生产上用的比较多的是用生物杀线剂阿维菌素、甲维盐等进行树干注射，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂价格高，注射全程由人工完成，因此仍然成本较高，通常只能应用在重要区域或古树名木上。全国大面积的松树，特别是马尾松，亿万年来随着进化的发展适应于我国的气候环境，是我国的乡土树种，也是造林先锋树种，具有很多的优点，不能把它彻底放弃掉。目前，我们国家也开始做马尾松抗松材线虫病的抗性育种，但这是一条长期的道路，无法在短期内实现。

利用真菌侵染使松木获得松材线虫病的抗性，这是一个值得尝试的新方法。事实上，这个方法已经在菌根的研究中有所证实，如中华美牛肝菌、黄豹斑鹅膏和彩色豆马勃等真菌，在接种到马尾松和黑松上后能够延缓或减轻其苗木的死亡。但是，目前尚未发掘出在驱虫和熏蒸方面有足够效力的侵染真菌，多年来这方面的进展不大，也未引起足够的重视。本发明即从这个角度，在筛选出具有驱虫和熏蒸等多重作用的炭团菌属真菌sj18（已授权发明201710795984.0）的基础上，进一步挖掘其作为松材线虫的生物农药功能。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明在原有发明“一种炭角菌科真菌及其应用”（专利号201710795984.0）的基础上，开发出一种利用该菌杀灭松材线虫的技术方案；

所述的一种炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18，其保藏号为CGMCC No.12780；

所述的炭角菌科真菌及其粗提取物作为松材线虫杀灭剂的应用；

本发明的炭角菌科真菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对松材线虫有独特的控制作用，可作为无公害新型农药。

附图说明

图1为sj18菌在显微镜下的形态；

图2为不同浓度的甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图3为不同浓度的sj18的PDB培养发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图4为不同浓度的sj18的大麦发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图5为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图6为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物加甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图7为不同浓度的sj18菌的100℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图8为不同浓度的sj18大麦发酵液70℃恒温30min后的上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；

图9为纯水对照。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。下述的实施例并不对本发明作限定作用。

实施例1：炭角菌科真菌的分离

从一株野生山核桃林木的根部取材，洗净，切成2cm左右小段，先经70%酒精表面消毒，再用50%安替福民（次氯酸钠溶液）浸泡消毒半小时，最后无菌水浸泡冲洗4-5次；

将消毒好的材料在超净台上切开，接种到PDA培养基（固体土豆培养基）平板上培养，待有菌长出时，分别划线纯化，并分别提取DNA进行分子鉴定，从而获得并确认该菌株。确认该菌株的具体步骤如下：

1）从PDA平板上挑取待测菌加入至悬浮溶液A中，在菌液中加入经灭菌后的直径3-5mm碳化钨圆珠1颗，置于沸水浴中5min后，在液氮速冻下，用往复式粉碎机研磨，研磨粉碎后，待恢复至常温；

2）准备高吸附力的柱子：取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；

3）菌裂解和核酸吸附：加入裂解液L到步骤1）处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；

4）清洗：取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次离心15s后，吸附柱不再放回收集管；

5）洗脱：将吸附柱转移到新离心管中，滴上10-15μL洗脱液E，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液；

6）ITS序列的PCR扩增：取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’）进行PCR扩增，PCR反应体积是60μL，10X Taq Buffer 6μL, 2.5 mM 的dNTP mixture 5μL, Taq 3u, 10μM的引物各2.5μL，模板体积为6μL，剩余用纯水补足；PCR反应程序为：95°C 300s；94℃ 15s，52°C45s，72°C 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s。其扩增产物约600bp，该产物以常规PCR产物切胶纯化方法纯化后，最后以ITS4为测序引物，测得其ITS序列为：

TTCTAGCTGAGCTGAGGTCACCTCTAGAATATATAGGGGTTTAACGGCTACCAGCCAGGGCCACCACACGAGCGAGAGAGATTACTACGCTGAGAGTGTACCCTAACTCCGCCACTAACTTTGAGGAACTACGCCGTAGATTCCCAACGCTAAGCAACAAGGGCTTAAGGGTCGAAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTATAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCGCTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTTATTTAGGTTTACAATTCATAGAAACAGTAATAAAAAACAAAAGTTTGGCGGTCCTTCGGCGGACCATAAGCCGGCTACAGGGTAGCTACAGGGTAACTATAGGGTAGCTGCAGGGTAACTACAGGGTAACTATAGGGTAACTACAGGGTAGCCGTAGCTCACGCCGAGGCAACGACGGTAAGGTTCACAAAGGGTTTGGAGTTTTAATAACTCAGTAATGATCCCTCCGCTGGCTCACCAACGGAGACCTTGTTCGATTTTTTAACTTCCAAGGA

经blast比对，与现有的Xylaria sp. YS-13菌株相似性为97%，可以认为是同一种菌的不同菌株，定名为sj18；

作为优选：

上述的溶液A为：100 mM Tris-HCl，25 mM EDTA，2.0 M NaC1，RnaseA 10μg/mL，pH 8.0；

上述的带过滤柱的离心管是由离心柱铺上1-3层孔径1-10μm的亲水微孔滤膜压紧得到；

上述的吸附剂悬液S通过以下步骤制得：称取3g硅土至50mL三角瓶中，加20-30mL双蒸水，充分振荡，静置片刻，去上清，清洗3遍，加入双蒸水至2倍硅土体积，总体积约20mL，经高压灭菌后常温存放待用；

上述的裂解液L由以下组分混合得到：异硫氰酸胍30g、无菌水40mL、PH5.2的灭菌NaAc 3mL、灭菌10% SDS 2.5mL、灭菌甘油2.5mL，总体积为50mL；

上述的清洗液W为浓度70%的酒精溶液；

上述的洗脱液E为灭过菌的Tris溶液，PH8.5；

该菌株可以接种入PDB培养基（液体土豆培养基）中振荡培养，然后加甘油等冷冻保护剂以菌丝形态在超低温冰箱作永久保存。炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18于2016 年08 月08 日保存于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.12780。

实施例2：菌株的形态学和生物学特征

炭角菌科真菌 (Metarhizium anisopliae) sj18在PDA培养基上生长良好，最适温度为32-34℃，在32℃下0.5cm菌块4天可以长到8cm，在pH5-11均能正常生长，且生长速度不受影响。菌丝初生长时为白色，培养1周后菌呈深褐色，不产孢子。图1为sj18菌在显微镜下的形态。

实施例3：菌株发酵液杀灭松材线虫的效果

具体实施步骤如下：

1．松材线虫收集

1）取备用的PDA平板，接种入灰葡萄孢菌，25℃培养，长满整个平板后，倒放于4℃保存备用；

2）将松木块用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜后，浸泡液2000rpm离心3-5min，去上清，留1-5mL，即为虫液；

3）取20-50μL虫液以划线的方式加入到步骤1）中长满菌丝的灰葡萄孢平板上，25℃生长至虫子面积达培养皿2/3以上，4度冰箱保存备用；

2．线虫筛选

1）提前一天把线虫平板从4度冰箱中取出， 22℃培养一晚，用移液器将无菌水加入到该线虫平板清洗，然后收集含虫清洗液；

2）收集的虫液经10-20μm的尼龙滤膜过滤，滤液为幼虫，滤膜上粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，这样就得到了所需的虫液，一般采用成虫进行抑制剂的筛选；

3）将虫液1000g低速离心5min，去掉部分上清，用千分之一的琼脂糖溶液调节虫液至千分之0.5琼脂糖浓度，这样便于线虫悬浮分散均匀，借助40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；

4）取96孔板，按每孔25μL加虫液，再分别加无菌水25μL，调整总体积为50μL，同时起到降低琼脂糖浓度的作用，便于显微镜观察；

3．sj18发酵产物收集和提取

1）sj18菌在PDA平板上32℃培养3天，用0.5cm打孔器在菌落边缘打孔1-2个；

2）取步骤1）的菌块1-2块，接种入200mL PDB培养基或大麦液体培养基，32℃振荡培养5天；

作为优选大麦液体培养基为1L水含100g麦芽粉；

3）菌丝发酵培养好后，用300目尼龙滤网抽滤，进行固液分离，得到的滤液4℃冷藏备用；菌丝50℃烘干，用粉碎机粉碎，4℃冷藏备用；

4）将步骤3）的菌丝粉末进行水提，具体方法如下：

水提取物：称取sj18粉末0.2g，加入10mL纯净水，混匀后在设定温度下保温30min，4000g离心，取上清0.22μm过滤灭菌，滤液分装后冰箱冻存备用；

5）发酵液：sj18菌分别进行PDB培养基和大麦液体培养基的发酵，发酵液经300目尼龙滤布过滤，滤液经4000g离心，取上清液经0.22μm过滤灭菌，滤液分装后冰箱冻存备用；

4．测试板制作

1）上述步骤3中得到的发酵液和水提物分别稀释好并分装到96孔板中，每孔分别加25μL试剂和25μL无菌水，每孔的内容物具体见表1；

表1：

表1中：

A.阳性对照，不同浓度甲维盐（结果见图2所示）；

B. sj18在PDB培养基里的发酵液上清液经0.22μm过滤（结果见图3所示）；

C. sj18在大麦培养基里的发酵液上清液经0.22μm过滤（结果见图4所示）；

D. sj18菌丝70℃水抽提物（结果见图5所示）；

E. sj18菌丝70℃水抽提物加甲维盐（结果见图6所示）；

F. sj18菌丝100℃水抽提物（结果见图7所示）；

G. sj18的大麦发酵液70℃恒温30min，离心取上清液（结果见图8所示）；

H.阴性对照，纯水（结果见图9所示）；

2）在上述步骤1）的基础上，每孔加入步骤2的分步骤4）中获得的虫液50μL，混匀，每孔总体积100μL。每组各4个重复；

3）将线虫培养在上述有药剂的96孔板中，控制环境温度25℃；

5．数据处理

1）用倒置显微镜在40倍放大下依次拍摄96孔板中的各孔，每隔2h拍摄一次所有孔的照片，追踪24h以上线虫的死活变化；

2）利用软件和人工相结合的方法标识照片中线虫的状态，将线虫分为s形、g形、c形和J形。根据线虫死活的观察，s形、g形相加是活的线虫数，c形和J形相加是死的线虫数；

3）将标识的状态进行电脑自动统计汇总，绘制每组线虫处理与时间的关系图，根据图形确定药物的抑制线虫效果；

研究结果表明，与对照（图8）相比，sj18发酵液不论是PDB发酵（图2）还是大麦发酵（图3），其发酵液在稀释至8倍浓度下，均能在8h内彻底杀死松材线虫；更低浓度的效果就不太稳定（图4）；sj18菌丝不论经70℃（图5）、还是100℃（图6）热水抽提后都能在8h左右有效杀死线虫，但100℃下抽提的效果不太稳定，线虫容易复活。另外，甲维盐与sj18菌提取物有一定的协同作用，两者配合可以达到最好的效果，既迅速又持久有效，在0.2g菌丝粉末/10ml水的抽提液作用下，即使在1mg/L的甲维盐浓度下，也能在6h左右彻底杀灭松材线虫。由此证明sj18发酵液及其粗提物有杀灭松材线虫的重要作用。

序列表

<110> 浙江省林业科学研究院

<120> 一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 613

<212> DNA

<213> 炭角菌科真菌sj18(Xylaria radix)

<400> 1

ttctagctga gctgaggtca cctctagaat atataggggt ttaacggcta ccagccaggg 60

ccaccacacg agcgagagag attactacgc tgagagtgta ccctaactcc gccactaact 120

ttgaggaact acgccgtaga ttcccaacgc taagcaacaa gggcttaagg gtcgaaatga 180

cgctcgaata ggcatgccca ctataatact aatgggcgca atgtgcgttc aaagattcga 240

tgattcgctg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat 300

gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttaacttat ttaggtttac aattcataga 360

aacagtaata aaaaacaaaa gtttggcggt ccttcggcgg accataagcc ggctacaggg 420

tagctacagg gtaactatag ggtagctgca gggtaactac agggtaacta tagggtaact 480

acagggtagc cgtagctcac gccgaggcaa cgacggtaag gttcacaaag ggtttggagt 540

tttaataact cagtaatgat ccctccgctg gctcaccaac ggagaccttg ttcgattttt 600

taacttccaa gga 613

Claims

1.保藏号为CGMCC No.12780的炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18发酵液及其粗提物作为松材线虫杀虫剂的应用。