CN110699304A

CN110699304A - 一种生防链霉菌

Info

Publication number: CN110699304A
Application number: CN201911183884.8A
Authority: CN
Inventors: 李立梅; 丁芮涵; 陈越渠; 左彤彤; 于海媛; 孙伟; 刘庆珍; 王向东; 李刚
Original assignee: Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences
Current assignee: Jilin Provincial Academy of Forestry Sciences
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-27
Also published as: CN110699304B; CN113061551B; CN112877261B; CN113061551A; CN112877261A

Abstract

本发明涉及一种生防链霉菌。该菌株的保藏编号为CGMCC No.18658。培养时，将该生防链霉菌接种到发酵培养基，发酵培养。该菌株或采用该菌株制备的生防制品可以用于植物性病原菌防治。本发明所述生防链霉菌或采用该生防链霉菌制备的生防制剂具有抗菌效果好、抑菌谱广、低毒性、无残留、环境友好、开发前景广阔等优点。

Description

一种生防链霉菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种生防链霉菌。

背景技术

蓝莓又名越橘，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium Spp.)植物，果实酸甜可口，除鲜食外还可加工成果汁、果酒、饮料。它的果实具有超高的营养价值，除果糖和维生素之外富含大量花青素，多种抗氧化剂和类黄酮，其独特而又稀有的营养保健价值越来越受到人们的青睐，全球对蓝莓的需求量不断增长。

近年来蓝莓种植面积逐年增加，蓝莓病害日趋严重，经济损失惨重，蓝莓溃疡病由葡萄座腔孢菌(Botryosphaeria dothidea)引起的一种蓝莓的重要病害。该病害在世界范围内广泛分布，主要危害1年生枝条，多从伤口和修剪口处发生；发病初期产生红褐色病斑，随着病斑扩展，枝梢开始干枯，渐渐导致整个幼枝枯死；发病后期，病斑上可见密集埋生的小黑点(分生孢子盘)；剖开受害组织，维管束组织变浅褐色，可见白色菌丝体。如遇低温或昼夜温差较大时较易发生蓝莓溃疡病，该病害大大影响蓝莓产量，甚至会导致植株死亡。

近年来国内关于蓝莓病害发生为害的报道屡见不鲜，如蒋萍报道了蓝莓溃疡病的发病条件；杨燕林等报道了蓝莓栽培中常见病虫害的危害趋势及蓝莓枝条的栽培技术，大大遏制了蓝莓病害的发生。目前该病的防治采取以下几种措施：化学防治，选育抗病品种，培育无病壮苗，优化栽培场地和栽培方式等方法。众多防病手段中，化学防治和选育抗病品种最易被大众接受，但上述两种防治方法均存在明显弊端，一方面抗病品种的选育耗时较长且存在抗性退化等问题，达不到预期的防病效果；另一方面，大量的投入化学农药容易造成坏境污染、破坏生态平衡、毒性高、易残留等问题。因此，研究以生态系统调控为主的可持续控制技术，利用对病原菌具有抑制作用的拮抗微生物防治该病，以菌治菌，达到绿色环保，高效综合防治目的。

放线菌是最早发现的具有生物防治作用的一类微生物。链霉菌在放线菌中占据着重要地位。但目前放线菌在蓝莓溃疡病领域的防治，存在防治效果不理想、田间防效不稳定等问题。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种生防链霉菌，具有抗菌效果好、田间防效稳定、抑菌谱广、低毒性、无残留、环境友好、开发前景广阔等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种生防链霉菌，菌株的保藏编号为CGMCC No.18658。该菌株于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

发明人采集吉林省不同地区的土壤分离获得多株放线菌，采用多重筛选，最终意外的获得了1株能够有效抑制蓝莓溃疡病菌的拮抗菌株，在本发明实施例中将其标记为链霉菌CX3(Streptomyces sp.strain CX3)，简称CX3。本发明提供的生防链霉菌是蓝莓生产上的重要病害的生物防治提供新的生防因子，实现了放线菌在蓝莓溃疡病领域的突破。

本发明的有益效果是：本发明获得的拮抗菌株CX3具有广阔的开发前景，其抑菌谱广，生物防治潜力极大，其发酵液中的活性抑菌组分经分离纯化等工艺后可以作为生物农药被开发应用于多种植物病害的防治方面，同时菌株CX3的发酵液较化学农药相比，具有低毒性、无残留、环境友好等多重优势，更符合可持续控制的环保理念。

具体的，上述生防链霉菌在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，菌丝体向各个方面放射状生长；28℃培养1-3天时，菌落光滑、无孢子生成，第7天后开始有孢子产生，显微镜下观察，孢子多发生呈链状；且孢子丝不自溶，无吸水现象；在培养15天时孢子堆颜色接近粉红色，孢子多数直，有时顶端呈勾状。

上述生防链霉菌可以利用D-木糖、D-果糖、甘露醇、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖；不能利用a-乳糖和棉子糖。

上述生防链霉菌的过氧化氢酶实验产生大量气泡；脲酶实验阴性；脂酶实验阳性，菌株周围产生了半透明晕圈；可使明胶液化；不能利用分解纤维素；可以使牛奶产生凝固，但不发生胨化现象；淀粉水解实验阳性，可以产生淀粉酶。

上述生防链霉菌的M.R.试验呈阴性；H₂S的实验阳性；V.P.实验CX3呈现阳性红色；硝酸盐还原反应中呈现阳性粉红色。

上述生防链霉菌的抑菌谱包括以下菌株：蓝莓溃疡病菌、杨树烂皮菌病、玉米大斑病菌、烟草赤星病菌、云杉立枯病菌、甜瓜枯萎病菌、红小豆炭疽病菌、瓜果腐霉病菌、水稻恶苗病菌、辣椒炭疽病菌、茄子褐纹病菌、杨树溃疡病。

上述生防链霉菌在发酵培养时，使用的发酵培养基的配方包括以下成分：每1000mL水，可溶性淀粉70g、花生饼粉33g、(NH₄)₂SO₄ 4g、NaCl 4g、CaCO₃ 4g，pH7.0。

上述生防链霉菌在发酵培养时，发酵培养温度为15-28℃。优选的，发酵培养温度为28℃。采用该温度更有利于生防链霉菌的发酵培养。

本发明提供一种生防制品，包括上述的生防链霉菌和/或上述的生防链霉菌发酵液。

采用上述方案的有益效果是：本发明获得的生防制品具有广阔的开发前景，其抑菌谱广，生物防治潜力极大，可以作为生物农药被开发应用于多种植物病害的防治方面，具有低毒性、无残留、环境友好等多重优势，更符合可持续控制的环保理念。

本发明提供上述生防链霉菌的培养方法，包括以下步骤：将生防链霉菌接种到发酵培养基，发酵培养。

进一步，发酵培养温度为28℃。

进一步，发酵培养基可以按照以下比例配制备，每1000mL水，可溶性淀粉70g、花生饼粉33g、(NH₄)₂SO₄ 4g、NaCl 4g、CaCO₃ 4g，pH7.0。

采用上述方案的有益效果是：合适的温度和培养基有利于生防链霉菌的发酵培养。

本发明提供上述的生防链霉菌在病原菌防治中的应用。优选的，本发明提供上述的生防链霉菌在植物性病原菌防治中的应用。

进一步，所述植物性病原菌包括蓝莓溃疡病菌、杨树烂皮菌病、玉米大斑病菌、烟草赤星病菌、云杉立枯病菌、甜瓜枯萎病菌、红小豆炭疽病菌、瓜果腐霉病菌、水稻恶苗病菌、辣椒炭疽病菌、茄子褐纹病菌、杨树溃疡病中的一种或几种。优选的，对于蓝莓溃疡病菌的防治效果更加显著，可以用于蓝莓溃疡病的生物防治。

本发明提供上述的生防制品在病原菌防治中的应用。优选的，本发明提供上述的生防制品在植物性病原菌防治中的应用。

本发明提供一种利用上述的生防链霉菌进行生物防治的方法，包括以下步骤：将上述生防链霉菌发酵培养后作用于需生物防治的植物或者将上述生防链霉菌发酵培养后分离出的发酵液作用于需生物防治的植物。

采用上述方法具有抗菌效果好、田间防效稳定、抑菌谱广、低毒性、无残留、环境友好、开发前景广阔等优点。

本发明提供一种利用上述生防制品进行生物防治的方法，包括以下步骤：将上述生防制品发酵培养后作用于需生物防治的植物或者将上述生防生防制品发酵培养后分离出的发酵液作用于需生物防治的植物。

附图说明

图1为CX3活菌对蓝莓溃疡病菌的抑制效果。

图2为菌株CX3光学显微镜下形态。

图3为M.R.试验结果。

图4为硝酸盐还原试验结果。

图5为V.P试验结果。

图6为H₂S产生试验结果。

图7为菌株CX3及相关菌株的系统发育分析结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明中，供试植物病原菌：

蓝莓溃疡病菌Botryosphaeria dothidea、蓝莓枝枯病菌Neofusicoccum parum、杨树烂皮病菌Valsa sordida、杨树溃疡病菌Botryosphaeria dothidea、云杉立枯病菌Rhizoctonia solani、甜瓜枯萎病菌Fusarium oxysporium 、水稻恶苗病菌F.moniliforme、红小豆炭疽病菌Colletotrichum truncatum、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum、烟草赤星病菌Alternaria alternata、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici、茄子褐纹病菌Phomopsis vexans

上述供试植物病原菌均可被公众所获得，仅用于重复本发明的实验过程和结果，非用于商业用途。

供试土样采自吉林省吉长白山保护区横山保护站落叶松人工林，长白山保护区池西保护站马鞍山云杉人工林，抚松县前川林场林下土壤，共十余份。

供试培养基：

高氏一号合成琼脂培养基(Gause′s synthetic agar)：KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄ 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄ 0.01g、可溶性淀粉20g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.2～7.4；

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；

蔗糖察氏琼脂(Czapek′s agar)：NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、MgSO₄ 0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；

伊莫松琼脂(Emenson agar)：葡萄糖10g、酵母膏10g、牛肉膏4g、蛋白胨4g、NaCl2.5g、琼脂20g，蒸馏水1000mL；

葡萄糖天门冬琼脂(Glucose asparagine)：葡萄糖10g、天门冬素0.5g、K₂HPO₄0.5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；

瓦氏肉汁琼脂(Broth agar)：蛋白胨5g、葡萄糖10g、牛肉膏10g、NaCl 5g、琼脂20g；蒸馏水1000mL

克氏一号琼脂(Carrot no.1agar)：K₂HPO₄ 1g、MgCO₃ 0.3g、NaCl 0.2g、KNO₃ 1g、FeSO₄ 0.01g、CaCO₃ 0.5g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；

淀粉铵琼脂(Starch ammonium salt medium)：(NH₄)₂SO₄ 2g、CaCO₃ 3g、K₂HPO₄1g、可溶性淀粉10g、MgSO₄ 1g、NaCl 1g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；

麦芽糖酵母膏琼脂(Yeast extract-medium extract agar)：酵母膏10g、麦芽膏10g、葡萄糖4g、蒸馏水1000mL、琼脂20g、pH 7.0；

贝奈特琼脂培养基(Bennett's agar)：葡萄糖10g、牛肉膏1g、酵母膏1g、水解酪素2g、琼脂15g；蒸馏水1000mL

燕麦粉琼脂(Oatemeal agar)：燕麦粉20g、微量盐溶液1mL、蒸馏水1000mL、琼脂20g、pH 7.2；

微量盐溶液的配方：FeSO₄ 0.1g、MnCl₂ 0.1g、ZnSO₄ 0.1g、蒸馏水100mL；

淀粉琼脂(Soluble starch agar)：可溶性淀粉10g、NaNO₃ 1g、MgCO₃ 1g、K₂HPO₄0.3g、NaCl 0.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g；

葡萄糖酵母膏琼脂(Glucose yeast extract agar)：葡萄糖10g、酵母膏10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g、pH 7.2；

甘油天冬素培养基(Glycerol-asparagine agar)：甘油10g、天冬门酰胺1g、K₂HPO₄1g、微量盐溶液1mL、蒸馏水1000mL、琼脂20g；

黄豆粉琼脂培养基(Bean agar medium)：黄豆粉40g、蔗糖20g、过磷酸钙1.5g、MgSO₄ 0.75g、蒸馏水1 000mL、琼脂20g；

甘油精氨酸培养基(Glycerine arginine medium)：甘油6g、精氨酸1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄ 0.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g；

黄豆粉蛋白胨培养基(Soybean powder peptone medium)：黄豆浸粉20g、可溶性淀粉5g、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母浸粉2g、NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.5g、CaCO₃ 0.1g、蒸馏水1000mL、琼脂20g、pH 7.2。

菌株筛选、鉴定选用高氏一号合成琼脂培养基。

发酵培养基:可溶性淀粉70g、花生饼粉33g、(NH₄)₂SO₄ 4g、NaCl 4g、CaCO₃ 4g、蒸馏水1000mL、pH7.0。

实施例中所使用的试剂：Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq PCR Master Mix，BBI Life Sciencs和DNA Marker DL2000，其它均为国产分析纯。

仪器：BX53型奥林巴斯光学显微镜，奥林巴斯株式会社。

实施例1

1.1.1菌株筛选

选用高氏一号合成培养基，采用多浓度梯度稀释涂布法分离筛选菌株，每天观察并挑选菌落形态各不相同的菌株及时转接到高氏一号斜面上培养，采用稀释分离法重新纯化3-5次后，并编号保存至4℃冰箱中备用。

1.1.2放线菌抑菌活性的测定

将分离获得的所有菌株转入高氏一号培养基培养，待各菌株产生足够量的孢子后，以蓝莓溃疡病菌为靶标菌，通过平板对峙培养法测定1.1.1分离得到的放线菌的抑菌活性，制备7mm蓝莓溃疡病菌菌饼接种在PDA平板(直径90mm)中央，在距离菌饼上下1.5cm处接种环挑取培养72h的放线菌，平行画线，以不接种放线菌的平板作为对照组，28℃恒温培养到对照组平板长满后测量放线菌与病原真菌之间抑菌带的宽度，每处理重复3次。根据抑菌带的大小，将拮抗活性最强，长势最旺盛的菌株作为入选菌株进行抑菌谱的测定。

1.1.3发酵液的制作及其抑菌谱测定

发酵培养基：可溶性淀粉70g、花生饼粉33g、(NH₄)₂SO₄ 4g、NaCl 4g、CaCO₃ 4g、蒸馏水1000mL、pH7.0。配制200mL发酵培养液装入500mL的三角瓶中，根据1.1.2的结果，选择抑菌活性强的菌株CX3转接至发酵培养液中，28℃，150r/min恒温振荡培养5-7天，获得的发酵液经8 000r/min离心15min，取上清液，-20℃冰箱保存备用。

采用杯碟法，制备7mm病原菌菌饼，将菌病对称倒置于PDA培养基四周，平板中央放置牛津杯，接种发酵液于牛津杯内，接种量为200μL，以不接种发酵液为对照，28℃恒温培养待对照组菌体长满培养皿后十字交叉法测量处理组抑菌圈直径。

1.1.4 CX3菌株形态学观察

将菌种接种至高氏1号琼脂平板上，将灭菌盖玻片以45°斜插在培养基中，28℃培养5-7d后，取出盖玻片，在光学显微镜下直接观察其形态。

根据国际链霉菌计划及中科院微生物所放线菌分类组(中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著.链霉菌鉴定手册.北京:科学出版社,1975.)的研究方法使用放线菌鉴别用培养基培养，观察其生长状况及气生菌丝、基内菌丝及可溶性色素的颜色。

1.1.5 CX3菌株生理生化特性的鉴定

PH耐受实验选用贝奈特液体培养基，设置pH 2，5，7，9，12共五个耐受梯度。分别接种菌株CX3的新鲜孢子，28℃恒温培养，7、14天记录各个处理菌株的生长情况，每组实验3组重复。

温度耐受实验选用培养基同pH耐受实验，设置温度4℃，15℃，28℃，37℃，50℃共五个耐受梯度。分别接种菌株CX3的新鲜孢子，7、14天记录各个处理菌株的生长情况，4℃培养分别在14d和28d时记录。每组实验3组重复。

NaCl耐受实验选用的培养基同pH耐受实验，设置0％，5％，15％，25％，30％(质量体积百分比，下同)共五个耐受梯度。分别接种菌株CX3的新鲜孢子，28℃恒温培养，7、14天记录各个处理菌株的生长情况，每组实验3组重复。

1.1.6 CX3菌株碳源利用的测定

将菌株CX3的新鲜孢子接入液体培养基，分别加入等量不同的碳源，观察菌株是否生长并记录菌株生长的状态。基础培养基采用普戈二氏培养基：(NH₄)₂SO₄ 2.64g、K₂HPO₄2.38g、MgSO4·7H₂O 1.0g、CuSO₄·5H₂O 0.0064g、FeSO₄·7H₂O 0.0011g、MnCl₂·4H₂O0.0079g、ZnS0₄·7H₂O 0.0015g、蒸馏水1000mL。碳源的选择：D-木糖、D-果糖、甘露醇、L-鼠李糖、a-乳糖、葡萄糖、蔗糖、D-麦芽糖、棉子糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖。

1.1.7 CX3菌株酶学特性的鉴定

过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上对数生长期的CX3菌丝于干净载玻片上，滴加3-10％的过氧化氢，观察结果，5min内有大量气泡产生的为阳性，不产气泡者为阴性。

脲酶实验：30％的尿素用乙醚消毒，待培养基冷却至55℃时加入无菌尿素，使其终浓度为2％。接种CX3菌株，培育4天后观察培养基颜色，培养基变成桃红色则为阳性，白色为阴性。培养基：蛋白胨1g，氯化钠5g，葡萄糖1g，KH₂PO₄ 2g，酚红0.012g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。

脂酶实验：底物为吐温-20(121℃灭菌备用)。冷却培养基至40-50℃，加入无菌吐温至终浓度为1％，制备平板，接种CX3菌株。培养7-14天，每天观察。在生长的菌株周围有模糊的晕圈者为阳性，没有则为阴性。培养基：蛋白胨1g、NaCl 5g、CaCl₂·7H₂O 0.1g、琼脂9g、蒸馏水1000mL、pH7.4。

明胶液化实验：将菌菌在培养基上划线28℃培养，于5，10，20，30天观察液化程度。观察前将平板放在4℃冰箱内30min左右。以不接菌种的培养基为对照，每组三次重复。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，蒸馏水1000mL。

淀粉水解实验：将菌种接种到淀粉琼脂培养基上。10天后测定淀粉酶活性，将碘液滴在平板上，观察菌苔周围的颜色，透明圈的有无和大小情况。培养基的选择：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄ 0.3g、MgCO₃ 1.0g、NaCl 0.5g、KNO₃ 1.0g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4。

牛奶凝固与胨化实验：将CX3菌种接入脱脂牛奶中，28℃恒温培养，3、6、10、20、30天观察有无凝固现象和胨化现象。以未接种菌种为对照，每组三个重复。凝固：有凝块产生；胨化：酪蛋白被水解成透明或半透明的液体状。培养基：脱脂鲜牛奶1000mL、CaCO₃ 0.02g，间歇灭菌3次。

纤维素利用实验：将菌种接种到试管中的滤纸条上，滤纸的一半浸泡在无碳源合成的溶液内，培养30天观察菌种是否能生长并且是否能够分解滤纸条。以未接种菌种为对照，每组三个重复。培养基的选择：MgSO₄ 0.5g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、KNO₃ 1g、蔗糖20g、蒸馏水1000mL。

1.1.8 CX3菌株代谢产物实验

M.R.试验：接种菌种于液体培养基内，28℃培养2-6天，在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为阳性，黄色为阴性反应。培养基：甲基红0.1g、葡萄糖5g、K₂HPO₄ 5g、酚红0.012g、蒸馏水1000mL。

V.P.试验：同M.R.试验培养条件，将培养液与40％氢氧化钠等量混合，加入少许肌酸，10min内出现红色为阳性反应。培养基同M.R.实验。

硫化氢生成实验：将菌种接在Tresner培养基上，培养7天后观察是否产生黑色素。产生黑色素则表明菌种产生硫化氢，以未接种的培养基为对照。培养基：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

硝酸盐还原实验：将菌种接种在培养液内，培养7，14天时测定。每1mL菌液加入溶液1，2各两滴。红色为阳性，以未接种的培养基为对照。培养基：MgSO₄ 0.5g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、KNO₃ 1.0g、蔗糖20g、蒸馏水2000mL。溶液1：氨基苯磺酸0.5g，溶于醋酸(80％醋酸，加2倍水稀释)。溶液二：二苯胺0.1g，蒸馏水20mL，二苯胺先溶于少量乙醇中再加水，经煮沸后加入150mL稀释的醋酸。

1.1.9 CX3菌株鉴定

将菌种接种至高氏1号琼脂平板上，将灭菌盖玻片以45°斜插在培养基中，28℃培养5-7d后，取出盖玻片，在光学显微镜下直接观察。

DNA提取按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书操作。PCR反应体系为50微升：PCR Mixture 25μL、Template 2μL、forward primer(SEQ NO.1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')2μL、reverse primer(SEQ NO.2:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')2μL、ddH₂O 19μL。

PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存，以无菌水的PCR产物为阴性对照，上样量2μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。所有操作按照试剂盒的操作流程操作，回收产物送至吉林省库美生物技术有限公司测序分析。

1.2数据分析

采用SPSS 17.0进行数据统计，Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析，系统发育树采用MEGA6.0版建立。

实施例2结果与分析

2.1菌株初筛

经过纯化后，获得了形态、大小、颜色一致的纯化菌株84株，平板对峙试验结果表明，抑菌带宽度大于10mm的共有12个菌株(如表1所示)，抑菌带宽大于15mm的有8个菌株，其中菌株CX3抑菌效果好(图1)，抑菌带宽度达16.16mm，因此选定菌株CX3(该菌株由长白山保护区池西保护站马鞍山云杉人工林采集的样品筛选获得)为下一步试验的菌株。

表1链霉菌活体对蓝莓溃疡病菌的抑菌活性

表中数据为平均数±标准差。

2.2拮抗菌CX3活菌及其发酵液抑菌谱测定

拮抗菌CX3对所有供试菌株均有一定的抑制作用。CX3对蓝莓溃疡病菌的抑制作用最强，可见明显的抑菌带，抑菌带宽度达16.16mm，与其他供试病原菌差异效果显著；对红小豆炭疽病菌、玉米大斑病菌和辣椒炭疽病菌也具有很强的抑制作用，抑菌带宽分别为13.42、13.88、12.84mm，对烟草赤星病菌、甜瓜枯萎病菌等抑制作用相对弱一些，但抑菌带宽度也达9.30mm以上(表2)。

采用杯碟法测定了拮抗菌株CX3发酵液的抑菌活性，其发酵液仍保持了较好的抑菌活性，该菌株的发酵液对蓝莓溃疡病菌的抑菌效果最强，达31.73mm，与其他供试菌株差异效果显著；对茄子褐纹病菌、辣椒炭疽病菌有极强的拮抗作用，平均抑菌直径达30.37mm，对玉米大斑病菌、红小豆炭疽病菌、杨树烂皮病菌也有较好的抑制作用，抑菌直径分别为28.82、25.74、26.94mm，该拮抗菌的发酵液对所有供试病原菌均有明显的抑制作用(表2)，最小抑菌直径也达到22.60mm。

表2拮抗菌CX3活体和发酵液的抑菌谱

表中数据为平均数±标准差。同列数据后字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.01水平差异显著。Data in the table are mean±SD.The letters in the samecolumn indicate significant differences at the P<0.01 level by Duncan's newcomplex range method.

2.3菌株CX3形态学观察

菌株CX3在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，菌丝体向各个方面放射状生长；28℃培养1-3天时，菌落光滑、无孢子生成，第7天后开始有孢子产生，显微镜下观察如图2所示，孢子多发生呈链状；且孢子丝不自溶，无吸水现象；在培养15天时孢子堆颜色接近粉红色，孢子多数直，有时顶端呈勾状，根据以上特征参考链霉菌鉴定手册(中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著.链霉菌鉴定手册.北京:科学出版社,1975)，.初步分析菌株CX3为链霉菌属的粉红孢类群。

2.3.1菌株CX3培养性状

菌株CX3接种于10种测试培养基上后，28℃培养36-48h后开始有菌落出现，7天后孢子开始产生。不同的培养基上菌苔的形态、孢子堆的颜色、基质菌丝的颜色、产生的色素、生长情况均有不同，结果如表3所示，菌株CX3在大多数培养基上不会产生可溶性色素。经查阅链霉菌检索手册(中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著.链霉菌鉴定手册.北京:科学出版社,1975.)，菌株CX3在高氏一号培养基上的气生菌丝粉白，基质菌丝呈现荔枝肉白色，可进一步确定为链霉菌属的粉红孢类群。

表3菌株CX3的培养特征

“-”:不生长；“+”:生长；“++”:生长良好；“+++”:旺盛生长。

2.4拮抗菌CX3的生理生化特征

2.4.1拮抗菌CX3的耐受性测定

菌株CX3对逆境的耐受性能表现很好，结果如表4所示。该菌株喜高盐环境，含5％NaCl的培养基上生长，在高盐情况下生长旺盛；对温度耐受性良好，可在15-28℃下生长，28℃为最适生长温度；对碱的耐受性表现良好，在pH5-12的范围内均能生长，且pH7左右为其生长的最适pH。

表4菌株CX3的耐受性测定

2.4.2拮抗菌CX3的碳源利用情况

菌株CX3对各种碳源的利用情况结果如表5所示，该菌株可以利用D-木糖、D-果糖、甘露醇、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖；不能利用a-乳糖和棉子糖。该菌株可以更好的利用单糖和二糖，不能利用多糖，最合适的碳源可以是木糖，果糖和麦芽糖。

2.4.3拮抗菌CX3的酶学特性

菌株CX3的酶学特性结果如表5所示，该菌株的过氧化氢酶实验产生大量气泡；脲酶实验阴性；脂酶实验阳性，菌株周围产生了半透明晕圈；可使明胶液化；不能利用分解纤维素；可以使牛奶产生凝固，但不发生胨化现象；淀粉水解实验阳性，可以产生淀粉酶。

2.4.4拮抗菌CX3的代谢产物测定

菌株CX3的代谢产物测定结果如表5所示；M.R.试验呈阴性；H₂S的实验阳性；V.P.实验CX3呈现阳性红色；硝酸盐还原反应中对照透明无色，菌株CX3呈现阳性粉红色。经查阅链霉菌分类鉴定手册，进一步判定菌株CX3为链霉菌属，粉红孢类群的弗氏亚群。

表5菌株CX3的生理生化实验测定

M.R.试验结果如图3所示。图3中，左边试管为阴性对照样品(阴性对照样品为未加菌液并加入了等量无菌水的样品)，右边试管为实验样品(CX3菌株培养液)，从图3中可以看出两只试管均呈阴性黄色，说明该菌株能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步代谢分解为乳酸、甲酸、乙酸，使混合液最终pH下降到4.5以下，则M.R.实验最终呈阴性。

硝酸盐还原实验结果如图4所示。图4中，左边试管为实验样品(CX3菌株培养液)，右边试管为阴性对照样品(阴性对照样品为未加菌液并加入了等量无菌水的样品)，从图4中可以看出实验样品试管呈粉红色，阴性对照试管无色，说明该混合液中有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。

V.P试验试验结果如图5所示。图5中，左边试管为阴性对照样品(阴性对照样品为未加菌液并加入了等量无菌水的样品)，右边试管为实验样品(CX3菌株培养液)，从图5中可以看出实验样品试管呈红色，阴性对照试管呈黄色，说明该菌株分解葡萄糖产生的丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下会氧化为二乙酰，进而与培养基蛋白胨中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色化合物，即V.P.试验阳性。

H₂S产生实验结果如图6所示。图7中，左边平板为阴性对照样品(阴性对照样品为未加菌液并加入了等量无菌水的样品)，右边平板为实验样品(CX3菌株培养基)，从图6中可以看出阴性对照平板呈黄色，实验平板呈棕褐色，说明有H₂S产生，H₂S与柠檬酸铁结合产生FeS,培养基呈现阳性棕褐色。

2.5拮抗菌CX3的分组生物学鉴定

2.5.1菌株CX3的16S rDNA鉴定

经测序，菌株CX3的16S rDNA基因扩增片段全长为1 385bp(基因登录号：MN636760)。选择了9株与菌株CX3同源性较高的序列，建立系统发育树，菌株CX3及相关菌株的系统发育分析结果如图7所示，从图中可以看出与菌株CX3亲缘关系较近的菌株均属于链霉菌属，因此，初步确定菌株CX3为链霉菌属，粉红孢亚群的弗氏亚群。

本发明从吉林省各林区的的林下土壤中分离得到了84种放线菌，以蓝莓溃疡病菌为靶标病原菌进行筛选，最终选定了1株采自吉林省的池西地区马鞍山云杉人工林林下土壤的放线菌，通过形态观察，生理生化鉴定，16SrDNA分析等分子生物学分析鉴定方法，确定菌株CX3为链霉菌属，粉红孢类群的弗氏亚群。经查阅链霉菌鉴定手册发现没有与之对应的种，但在分析中发现有两株菌的理化性质与拮抗菌株CX3有相似之处，分别是噬多碳链霉菌(S.polycarbophilus)和地中海链霉菌(S.mediterranei)，他们的培养性状只有细微差异；理化性质较为相似，都能够使淀粉水解，但菌株CX3不能分解利用纤维素。其中地中海链霉菌属于同为粉红孢类群的玫瑰亚群的一个变种，可以产生利福霉素(Rifomycin)是一种广谱抗生素。噬多碳链霉菌能够产生抗菌素万-135，抑制阳性细菌，包括分歧杆菌。

CX3菌株具有杀真菌活性，其活菌和发酵液对于蓝莓溃疡病菌均表现较强的抑制效果，分析可能是由于该菌株在生理代谢过程中产生了抗真菌的物质。菌株CX3可以很好的利用单糖和二糖但不能利用多糖，分析与它的生理代谢途径也有重要关系。综上，暂定命名为链霉菌CX3。

本发明通过一系列实验证明，该菌株具有抗菌效果好、田间防效稳定、抑菌谱广、低毒性、无残留、环境友好、开发前景广阔等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林省林业科学研究院

<120> 一种生防链霉菌

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种生防链霉菌，其特征在于，菌株的保藏编号为CGMCC No.18658。

2.根据权利要求1所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，菌丝体向各个方面放射状生长；28℃培养1-3天时，菌落光滑、无孢子生成，第7天后开始有孢子产生，显微镜下观察，孢子多发生呈链状；且孢子丝不自溶，无吸水现象；在培养15天时孢子堆颜色接近粉红色，孢子多数直，有时顶端呈勾状。

3.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌可以利用D-木糖、D-果糖、甘露醇、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖；不能利用a-乳糖和棉子糖。

4.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌的过氧化氢酶实验产生大量气泡；脲酶实验阴性；脂酶实验阳性，菌株周围产生了半透明晕圈；可使明胶液化；不能利用分解纤维素；可以使牛奶产生凝固，但不发生胨化现象；淀粉水解实验阳性，可以产生淀粉酶。

5.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌的M.R.试验呈阴性；H₂S的实验阳性；V.P.实验CX3呈现阳性红色；硝酸盐还原反应中呈现阳性粉红色。

6.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌的抑菌谱包括以下菌株：蓝莓溃疡病菌、杨树烂皮菌病、玉米大斑病菌、烟草赤星病菌、云杉立枯病菌、甜瓜枯萎病菌、红小豆炭疽病菌、瓜果腐霉病菌、水稻恶苗病菌、辣椒炭疽病菌、茄子褐纹病菌、杨树溃疡病。

7.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌在发酵培养时，使用的发酵培养基的配方包括以下成分：每1000mL水，可溶性淀粉70g、花生饼粉33g、(NH₄)₂SO₄ 4g、NaCl 4g、CaCO₃ 4g，pH7.0。

8.根据权利要求1或2所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌在发酵培养时，发酵培养温度为15-28℃。

9.根据权利要求8所述生防链霉菌，其特征在于，所述生防链霉菌在发酵培养时，发酵培养温度为28℃。

10.一种生防制品，其特征在于，包括权利要求1-9任一项所述的生防链霉菌和/或权利要求1所述的生防链霉菌发酵液。