CN112931534A - 一种链霉菌在生物防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种链霉菌在生物防治中的应用，链霉菌的保藏编号为CGMCC No.18657。采用该链霉菌及含有该链霉菌的菌剂，能有效抑制杨树溃疡病菌等多种病原菌，具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

Description

一种链霉菌在生物防治中的应用

本发明是分案申请，原中国专利申请号为：202010232732.9，申请日为：2020年3月28日，申请时专利名称为：一种链霉菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种链霉菌在生物防治中的应用。

背景技术

杨树溃疡病(Poplar canker)是我国杨树人工林的重大生物灾害，且危害日趋严重。目前关于杨树溃疡病的防治除了改良幼树品种，增强林木的抗病力外，主要采取化学防治措施。此方法成本低、见效快，长期以来受到广泛使用。缺点是长期使用化学农药，会增强病原菌的耐药性，造成农药的大量残留，同时对环境造成污染。生物防治对病原菌的抑制作用有很强的专一性、持久性和有效性，并可以增强寄主植物的抗性，是目前林木病害防治的主要研究方向。杨树溃疡病是一种寄主主导型病害，蔓延速度快、危害大，防治难度较大。向玉英等报道了杨树水泡型溃疡病的病原菌无性世代为聚生小穴壳(Dothiorellagregaria),有性世代为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。关于杨树溃疡病的生物防治方面的研究有见报道，如胥丽娜等利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和杨蕾等利用黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)以及郑甜甜报道的盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)等。目前杨树溃疡病的防治主要是化学防治，环保高效的生物防治鲜有报道。聚生小穴壳菌引发的杨树溃疡病危害200个杨树品种、杂交种和无性系，并且已发现其变异种。聚生小穴壳菌是一种弱寄生菌，具有潜伏侵染现象，几乎全年可侵入寄主，并潜伏于寄主体内，寄主逆境或长势弱时表现出症状，一般在春季，形成病发高峰期。同时存在寄主选择性，聚生小穴壳引起的水泡型溃疡病在毛白杨树皮上真菌数量少，而在NL895杨的1年生苗木上的发病率高达50％～70％。聚生小穴壳菌在不同树体空间均有分布,树体上部分布少，在树干部分布明显增多。杨树溃疡病生物防治方法目前只是在实验室或者小面积林区取得了一些结果，今后应继续筛选防效好环保的生防菌，研制并开发环境友好性的防治溃疡病药剂。

链霉菌Streptomyces是放线菌门中最大最高等的一个属，丝状分枝菌丝，无橫隔，革兰氏阳性好氧细菌，有较强的淀粉和蛋白质水解能力，并能够产生具有多种生物活性的次生代谢产物，广泛应用于各个领域里。在植物病虫害方面，链霉菌对病原菌有很好的拮抗作用。它能够产生几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶等胞外水解酶裂解真菌细胞壁，使真菌生长受到阻碍；它的次生代谢产物主要为氨基糖苷类、核苷类、多烯类、大环内酯类、四环素类抗生素对多种病原菌的细胞壁合成、蛋白质和核酸的合成具有抑制作用。淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)的胞外代谢产物丰加霉素对黄瓜立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌丝生长和菌核形成都有明显的抑制作用。除此之外，有些链霉菌还会分泌特有的物质促进植物自身生长，间接提高植物抗病性。薛泉宏等人发现棉花的内生拮抗链霉菌在根内定殖促进棉花幼苗光合及生长，其发酵液不同稀释梯度均能促进棉花胚根和胚轴生长。此外，黄冰纷等从土壤中筛选出一种链霉菌，其代谢产物呋喃它酮作用于松材线虫致死率达85％。综上所述，链霉菌在植物病害的生物防治方面有很广阔的发展前景，对其研究和应用仍值得继续探索。

螺旋轮生链霉菌(Streptomyces spiroverticillatus)在上世纪60年代上海农药所的学者在筛选抗油菜菌核病的抗生素时被发现，在其发酵产物中分离获得互变霉素(TTM)。1987年，在和日本的Isono研究小组合作下，对其结构进行了初步测定。在植物病害方面，互变霉素有很好的抗真菌活性，尤其是对油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，而抗细菌作用比较小。互变霉素导致油菜菌核菌的形态异常，在显微镜下观察到的菌丝肿胀和异常分支形状；经互变霉素处理的油菜菌核蛋白磷酸酶(PP)活性降低，细胞膜通透性发生变化；El-Abyad等人发现S.spiroverticillatus紫外突变体对对青枯假单胞杆菌(Pseudomona solanacearum)的抑菌活性增强；此外互变霉素对黄瓜灰霉病也有很好的抑制作用，但迄今为止未见关于该菌株应用于杨树溃疡病的报道。

聚生小穴壳导致溃疡病，杨树不是其单一的寄主。聚生小穴壳在雪松、苹果、板栗、枣树及诸多蔷薇科的植物上引发溃疡病、枯枝病、枣缩果病、烂果病等，因此聚生小穴壳菌的危害必须高度重视，对其的综合治理势在必行。生物防治具有高效、环保等优点，是植物病害防治的发展趋势。目前，针对杨树溃疡病原聚生小穴壳进行筛选的生防菌株未有报道。在生物防治过程中主要存在抑菌活性不理想、防治效率偏低等问题。因此，研制出持久有效的生防菌剂是目前生物防治研究中的最关键的一步。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种链霉菌在生物防治中的应用，使用的的链霉菌是一种能有效抑制杨树溃疡病菌等多种致病菌的拮抗链霉菌。本发明提供的链霉菌具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种链霉菌，菌株的保藏编号为CGMCC No.18657。该菌株经鉴定为螺旋轮生链霉菌Streptomyces spirovertillatus，在本发明实施例中将其命名为菌株HS1。于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述链霉菌的生长温度为4～28℃，28℃为最适生长温度；pH5～12，pH7为生长的最适pH。经鉴定，该链霉菌可以利用碳源有D-木糖、D-果糖、葡萄糖、a-乳糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖，其中D-木糖、D-果糖和葡萄糖是最合适的碳源，菌株生长旺盛；不能利用棉子糖、甘露醇、蔗糖和L-鼠李糖。该链霉菌具有过氧化氢酶，能催化分解过氧化氢；有产生尿素酶的能力；产生淀粉酶；硝酸盐还原反应呈阳性，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；脂酶实验呈阴性；不能使明胶液化；不能分解利用纤维素。

本发明提供的菌株，具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定等优点。尤其对聚生小穴壳抑菌效果明显且效果稳定。

本发明还提供一种链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：将上述的链霉菌，接种到培养基发酵培养。

培养基可以包括以下成分：以质量百分数计，淀粉7.0％、花生饼粉3.3％、(NH₄)₂SO₄0.4％、CaCO₃0.4％、NaCl 0.4％，蒸馏水1000ml，pH7.0。

发酵条件可以为：培养温度4～28℃，pH为5～12；优选的，培养温度为28℃，pH为7。

本发明的有益效果：采用该方法发酵的链霉菌及其发酵液，能有效抑制杨树溃疡病菌等多种病原菌，具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

本发明还提供一种菌剂，包括上述的链霉菌和/或上述链霉菌的发酵液。菌剂中还可以包括辅料。例如，所述辅料可以为扩散剂、吸附剂等等。该菌剂具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

上述的链霉菌和/或菌剂可以在病原菌抑菌活性中进行应用。

本发明还提供一种链霉菌在生物防治中的应用，链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.18657。

进一步，用于防治杨树溃疡病、杨树烂皮病、蓝莓溃疡病、蓝莓枯枝病、甜瓜枯萎病、水稻恶苗病、红小豆炭疽病、玉米大斑病、烟草赤星病、辣椒炭疽病、云杉立枯病、瓜果腐霉病、茄子褐纹病中的一种或几种的组合。

进一步，对以下病原菌的一种或几种的组合有抑菌作用：杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria、杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytosporachrysosperma、蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeria dothidea、蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccum parum、甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusariumoxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusariumtricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans。

本发明的有益效果：本发明的链霉菌在进行生物防治时，具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

本发明所述的链霉菌的抑菌谱广，对以下病原菌均有抑菌作用，例如：杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria、杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytosporachrysosperma、蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeria dothidea、蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccum parum、甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusariumoxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilumturcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusarium tricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans等。本发明所述链霉菌尤其对聚生小穴壳菌、金黄壳囊孢、葡萄座腔孢菌、三线镰刀菌、褐纹拟茎点霉、平头刺盘孢的抑菌效果最好。

本发明还提供一种含有链霉菌的菌剂在生物防治中的应用，链霉菌的保藏编号为CGMCC No.18657。

进一步，用于防治杨树溃疡病、杨树烂皮病、蓝莓溃疡病、蓝莓枯枝病、甜瓜枯萎病、水稻恶苗病、红小豆炭疽病、玉米大斑病、烟草赤星病、辣椒炭疽病、云杉立枯病、瓜果腐霉病、茄子褐纹病中的一种或几种的组合。

进一步，对以下病原菌的一种或几种的组合有抑菌作用：杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria、杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytosporachrysosperma、蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeria dothidea、蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccumparum、甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusarium oxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilumturcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichumcapsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusarium tricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans。

本发明的有益效果：本发明的菌剂在进行生物防治时，具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定、低毒环保等优点。

本发明所述的链霉菌和/或菌剂可以在生物防治中进行应用。例如，利用本发明所述的链霉菌和/或菌剂对由上述病原菌导致的疾病进行防治。

再例如：用于防治杨树溃疡病、杨树烂皮病、蓝莓溃疡病、蓝莓枯枝病、甜瓜枯萎病、水稻恶苗病、红小豆炭疽病、玉米大斑病、烟草赤星病、辣椒炭疽病、云杉立枯病、瓜果腐霉病、茄子褐纹病等。

一种生物防治的方法，包括以下步骤：将链霉菌和/或链霉菌的菌剂施加到需要防治的作物。采用上述方法具有防治效果好、效果稳定等优点。所述作物可以为杨树、蓝莓、甜瓜、水稻、红小豆、玉米、烟草、辣椒、云杉、茄子以及其他瓜果等。

附图说明

图1为HS1活体对聚生小穴壳菌的抑制效果。

图2为菌株HS1的菌落(A，B)和菌丝(C)和分生孢子(D)形态特征。

图3为菌株HS1的M.R./V.P.试验结果。

图4HS1基因组DNA电泳结果和16S rDNA扩增产物电泳结果，其中，M:DNA MarkerDL2000；1:HS1的总DNA；2:阳性对照；3,4:HS1 DNA16S rDNA PCR产物；5:阳性对照；6:阴性对照。

图5菌株HS1及相关菌株的系统发育分析。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明从吉林省长白山国家级自然保护区横山保护站落叶松林下土壤中筛选出对多种农林重要病害病原菌有良好生防效果的拮抗链霉菌HS1，采用平板对峙法、杯碟法分别测定了该菌株活菌及发酵液的抑菌活性；并通过形态学、生理生化特征、16SrRNA等方法研究其分类地位。结果显示，该菌株活菌及其发酵液对13种供试植物病原菌均有抑制作用，抑菌谱广，其中对杨树溃疡病病原菌-聚生小穴壳菌抑制作用最强，活菌抑菌带达20.66mm，发酵液的抑菌圈直径达40.26mm。对杨树烂皮病病原菌-金黄壳囊孢的抑菌带20.30mm，发酵液的抑菌直径40.02mm，对蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢的抑菌带为21.72mm，抑菌直径39.84mm；根据其菌株形态、生理生化特性及16SrRNA序列比对，最终鉴定菌株为螺旋轮生链霉菌Streptomyces spiroverticillatus，该菌株对多种农林重要病害病原菌的抑菌作用效果良好，以期为植物病害的生物防治提供新的生防因子。

实施例中，采用的实验材料及仪器介绍如下。

(1)供试植物病原菌：

杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria，杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma，由吉林省林业科学研究院分离纯化并保存；蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeria dothidea，蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccum parum，由延安大学徐成楠副教授馈赠；甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusarium oxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusariumtricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans由沈阳农业大学植物病毒研究室馈赠。

上述菌株均可为公众获得仅用于非商业目的的重复本发明实施例内容。

(2)供试土样：

供试土样采自吉林省长白山国家级自然保护区横山保护站落叶松林、池西保护站马鞍山云杉人工林、抚松县前川林场等地土样十二份。

(3)供试培养基：

高氏一号合成琼脂培养基(Gause′s synthetic agar)：KNO₃1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄0.01g、可溶性淀粉20g、琼脂20g、水1000ml、pH 7.2～7.4；

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar)：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂20g；蒸馏水1000ml；

蔗糖察氏琼脂(Czapek′s agar)：NaNO₃3g、K₂HPO₄1g、MgSO₄0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；

葡萄糖天门冬琼脂(Glucose asparagine)：葡萄糖10g、天门冬素0.5g、K₂HPO₄0.5g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；

克氏一号琼脂(Carrot no.1agar)：K₂HPO₄1g、MgCO₃0.3g、NaCl0.2g、KNO₃1g、FeSO₄0.01g、CaCO₃0.5g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；

淀粉铵琼脂(Starch ammonium salt medium)：(NH4)₂SO₄2g、CaCO₃3g、K₂HPO₄1g、可溶性淀粉10g、MgSO₄1g、NaCl 1g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；

麦芽糖酵母膏琼脂(Yeast extract-medium extract agar)：酵母膏10g、麦芽膏10g、葡萄糖4g、蒸馏水1000ml、琼脂20g、pH 7.0；

贝奈特琼脂培养基(Bennett's agar)：葡萄糖10g、牛肉膏1g、酵母膏1g、水解酪素2g、蒸馏水1000ml、琼脂15g；

燕麦粉琼脂(Oatemeal agar)：燕麦粉20g、微量盐溶液1ml、蒸馏水1000ml、琼脂20g、pH 7.2；微量盐溶液的配方包括：FeSO₄0.1g、MnCl₂0.1g、ZnSO₄0.1g、蒸馏水1000ml；

淀粉琼脂(Soluble starch agar)：可溶性淀粉10g、NaNO₃1g、MgCO₃1g、K₂HPO₄0.3g、NaCl 0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂20g；

葡萄糖酵母膏琼脂(Glucose yeast extract agar)：葡萄糖10g、酵母膏10g、蒸馏水1000ml、琼脂20g、pH 7.2；

甘油天冬素培养基(Glycerol-asparagine agar)：甘油10g、天冬门酰胺1g、K₂HPO₄1g、微量盐溶液1ml、蒸馏水1000ml、琼脂20g；微量盐溶液的配方包括:FeSO₄0.1g、MnCl₂0.1g、ZnSO₄0.1g、蒸馏水1000ml；

黄豆粉琼脂培养基(Bean agar medium)：黄豆粉40g、蔗糖20g、过磷酸钙1.5g、MgSO₄0.75g、蒸馏水1000ml、琼脂20g；

甘油精氨酸培养基(Glycerine arginine medium)：甘油6g、精氨酸1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂20g；

黄豆粉蛋白胨培养基(Soybean powder peptone medium)：黄豆浸粉20g、可溶性淀粉5g、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母浸粉2g、NaCl 2g、K₂HPO₄0.5g、CaCO₃0.1g、蒸馏水1000ml、琼脂20g、pH 7.2。

菌株筛选、鉴定选用高氏一号合成琼脂。

发酵培养基:按质量百分数计，淀粉7.0％、花生饼粉3.3％、(NH₄)₂SO₄0.4％、CaCO₃0.4％、NaCl 0.4％、蒸馏水1000ml，pH7.0。

(4)试剂：

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，购自上海生工生物工程股份有限公司；16SrDNA forward primer(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，reverse prime(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，Taq PCR Master Mix(2×，blue dye)，购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker DL2000，购自宝生物工程(大连)有限公司；Granulated agar，购自BD生物科学，其它均为国产分析纯。

(5)仪器：BX53型奥林巴斯光学显微镜，奥林巴斯株式会社；ABI VeritiFAST梯度PCR仪，美国ABI公司。

下面通过具体实施例来介绍菌株的筛选及抑菌活性测定。

1、方法

1.1生防菌株的筛选及抑菌活性测定

实施例1.1.1菌株筛选

2018年8月份，供试土样采自吉林省长白山国家级自然保护区横山保护站落叶松林、池西保护站马鞍山云杉人工林、抚松县前川林场等地随机采集土样十二份。采集方法：先用小铲除掉表土，取5～10cm深处的土壤约200g，分别装入塑料袋中，放入记载有采集地、采集时间的标签，用于链霉菌的分离。若不能马上分离，则将土样阴干后，阴凉处保存。

采用稀释分离法进行生防链霉菌的分离纯化。将每份称好的10g土壤样本分别加入100ml无菌水中，震荡30min后，吸取1ml混悬液，用无菌水梯度稀释，从10^-3(即稀释10³倍)、10^-4(即稀释10⁴倍)和10^-5(即稀释10⁵倍)稀释管内分别吸取0.1ml加到高氏一号平板上，均匀涂布，然后将培养皿倒置于28℃恒温箱内培养3～10d。将上述分离获得的所有菌株采用稀释分离法重新纯化3～5次后，转入高氏一号斜面培养基培养，编号保存至4℃冰箱中备用。将分离获得的所有菌株转入高氏一号培养基培养，待各菌株产生足够量的孢子后，制作放线菌菌块进行抑菌活性测定。

实施例1.1.2菌株抑菌活性的测定

以聚生小穴壳菌(D.gregaria)作为靶标菌，采用平板对峙培养法进行拮抗链霉菌的活体筛选。将靶标菌制成5mm菌饼接种在马铃薯葡萄糖琼脂平板(PDA平板)(平板直径90mm)中央，在距离菌饼上下1.75cm处接种环挑取培养72h的放线菌，平行画线，28℃恒温培养72h后测量放线菌与病原真菌之间抑菌带的宽度，每处理重复3次。根据抑菌带的大小和稳定性确定发酵试验的菌株。

实施例1.1.3生防菌株活体及发酵液抑菌谱测定

菌株HS1进行活体抑菌谱测定采用平板对峙培养法，抑菌谱的病原菌共13种，测量生防菌株与每种病原真菌之间抑菌带的宽度，每处理重复3次。

常规制作发酵培养基，配方:按质量百分数计，淀粉7.0％、花生饼粉3.3％、(NH₄)₂SO₄0.4％、CaCO₃0.4％、NaCl 0.4％、蒸馏水1000ml，pH7.0。选择抑菌活性强稳定性好的生防菌株HS1转接至发酵培养液中，装样量为250ml的三角瓶装发酵液40ml，接种菌量为5个菌块，恒温震荡培养(28℃、150r/min)5d，发酵液8000r/min离心15min，取上清过细菌过滤器去除菌体，-20℃冰箱保存备用。

采用杯碟法，制备直径7mm的病原菌菌块，等距离倒置于PDA平板四周，中央放置牛津杯，发酵液加样量200μl，28℃恒温培养箱中培养72h后，十字交叉法测量抑菌圈直径。

实施例1.1.4生防菌株生理生化特性鉴定

实施例1.1.4.1 HS1菌株形态学观察

在高氏一号培养基上接种观察生防菌株HS1菌落形态；用插片法观察菌株的菌丝及孢子形态特征：灭菌的PDA培养基倒成平板，一般每皿倒15ml培养基，凝固后用无菌盖玻片以45°角插入培养基中，盖玻片插入培养基的深度以1/2为宜，然后沿着盖玻片与培养基表面的钝角交界线进行接种，于28℃下培养，分别于7、14、28d将盖玻片取出，在显微镜下观察基内菌丝、气生菌丝形态以及孢子的形态特征，并拍照记录。

根据国际链霉菌计划(1966)及中科院微生物所放线菌分类组(1975)的研究方法使用放线菌鉴别用培养基培养(培养基配方详见上文中“(3)供试培养基”)，将HS1菌株转接到各鉴定培养基斜面上，每株三支试管，同时转接两个平板，置28℃温箱培养，15d后观察其培养特征。记录菌株在各种鉴定培养基上的气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色和特征。颜色比对采用《链霉菌鉴定手册》。

实施例1.1.4.2 HS1菌株耐受特性的鉴定

pH耐受实验选用贝奈特液体培养基，设置pH2，5，7，9，12共五个耐受梯度。接种等量菌株HS1的新鲜孢子，28℃恒温培养，7、14d记录处理菌株的生长情况，每处理重复3次。

温度耐受实验选用贝奈特琼脂培养基，设置温度4℃，15℃，28℃，37℃，50℃共五个耐受梯度。均匀涂布等量菌株HS1菌悬液，7、14d记录处理菌株的生长情况，4℃培养分别在14d和28d时记录。每处理重复3次。

NaCl耐受实验选用的培养基同pH耐受实验，设置0％，5％，15％，25％，30％共五个耐受梯度。接种等量菌株HS1的新鲜孢子，28℃恒温培养，7、14d记录处理菌株的生长情况，每处理重复3次。

实施例1.1.4.3 HS1菌株碳源利用的测定

将菌株HS1的孢子接入液体培养基，分别加入等量不同的碳源，观察菌株是否生长并记录菌株生长的状态。基础培养基采用普戈二氏培养基：(NH₄)₂SO₄2.64g、K₂HPO₄2.38g、MgSO₄·7H₂O 1.0g、CuSO₄·5H₂O 0.0064g、FeSO₄·7H₂O0.0011g、MnCl₂·4H₂O 0.0079g、ZnSO₄·7H₂O 0.0015g、蒸馏水1000ml。碳源物质的选择：D-木糖、D-果糖、甘露醇、L-鼠李糖、a-乳糖、葡萄糖、蔗糖、D-麦芽糖、棉子糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖。

实施例1.1.4.4 HS1菌株酶学特性的鉴定

过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上对数生长期的HS1菌苔置于干净载玻片上，滴加3～10％的过氧化氢，观察结果，0.5min内有大量气泡产生的为阳性，不产气泡者为阴性。

脲酶实验：将30％的尿素用乙醚消毒，待培养基冷却至55℃时加入无菌尿素，使其中终浓度为2％。接种HS1菌株，28℃恒温4天后观察培养基颜色变化，培养基变成桃红色则为阳性，白色则为阴性。培养基：蛋白胨1g、NaCl5g、葡萄糖1g、KH₂PO₄2g、酚红0.012g、琼脂15g、蒸馏水1000ml。

脂酶实验：待培养基冷却至40～50℃，加入无菌吐温20至终浓度为1％，制备平板，接种HS1菌株。28℃恒温培养7～14天，每天观察。在生长的菌株周围有模糊的晕圈者为阳性，没有则为阴性。培养基：蛋白胨1g、NaCl5g、CaCl₂·7H₂O0.1g、琼脂9g、蒸馏水1000ml、pH7.4。

明胶液化实验：将HS1菌株接种于明胶培养基上，28℃恒温培养，5，10，20，30d观察液化程度。观察前将平板放在4℃冰箱内30min左右。以不接菌种的培养基为对照，每组三次重复。培养基的选择：蛋白胨5g、葡萄糖20g、明胶200g、蒸馏水1000ml。

淀粉水解实验：将HS1菌种接种到淀粉琼脂培养基上，28℃恒温培养，10d后测定淀粉酶活性，将碘液滴在平板上，观察菌苔周围的颜色，透明圈的有无和大小情况。培养基的选择：可溶性淀粉10g、K₂HPO₄0.3g、MgCO₃1.0g、NaCl0.5g、KNO₃1.0g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4。

牛奶凝固与胨化实验：将HS1菌种接入脱脂牛奶中，28℃恒温培养，3、6、10、20、30d观察有无凝固现象和胨化现象。以未接种菌种为对照，每组三个重复。凝固：有凝块产生；胨化：酪蛋白被水解成透明或半透明的液体状。培养基：脱脂鲜牛奶1000ml、CaCO₃0.02g，间歇灭菌3次。

纤维素利用实验：将HS1菌种接种到试管中的滤纸条上，滤纸的一半浸泡在无碳源合成的溶液内，培养30天观察菌种是否能生长并且是否能够分解滤纸条。以未接种菌种为对照，每组三个重复。培养基的选择：MgSO₄0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.5g、KNO₃1.0g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml。

硝酸盐还原实验：将HS1接种于培养液内，培养7，14d时测定。每1ml菌液加入溶液Ⅰ和溶液Ⅱ各两滴，红色为阳性。以未接种的培养基为对照。培养基：MgSO₄0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.5g、KNO₃1.0g、蔗糖20g、水1000ml。溶液Ⅰ：氨基苯磺酸0.8g溶于5mol/L醋酸100ml。溶液Ⅱ：二苯胺0.1g，水20ml，二苯胺先溶于少量乙醇中再加水，经煮沸后加150ml稀释的醋酸。

实施例1.1.4.5 HS1菌株代谢产物实验

M.R.试验：接种HS1菌种于液体培养基内，28℃培养2～6d，在培养基中加入一滴甲基红试剂，红色为阳性，黄色为阴性反应。培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K₂HPO₄5g、酚红0.012g、蒸馏水1000ml。甲基红试剂：甲基红0.1g、95％乙醇300ml、蒸馏水200ml。

V.P.试验：同M.R.试验，培养HS1菌株后，将培养液与40％NaOH溶液等量混匀，加入少许肌酸，10min出现红色为阳性反应，有时需要放置更长时间。培养基同M.R.实验。

硫化氢生成实验：将菌种HS1接种于Tresner培养基上，培养7d后观察是否产生黑色素。产生黑色素则说明菌种产生硫化氢，以未接种的培养基为对照。培养基：蛋白胨10g、柠檬酸铁0.5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2。

实施例1.1.5菌株分子生物学鉴定

DNA提取按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书操作。PCR反应体系为50μL：PCR Mixture 25μL、Template 2μL、Primer F1、Primer R1各2μL、ddH₂O 19μL。

PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。以无菌水的PCR产物为阴性对照，以实验室已测定16SrDNA结果的菌株的PCR产物为阳性对照，上样量2μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。出现符合长度单一条带，将PCR产物送至长春库美生物公司测序，结果与NCBI数据库进行比对，确定链霉菌种属的初步鉴定，为系统发育树的建立做准备。

实施例1.2数据分析

采用SPSS 19.0进行数据统计，Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析，系统发育树采用MEGA6.0版建立。

2、实验结果与分析

2.1菌株初筛

分离纯化得到形态特征各有差异的生防菌株104株，平板对峙试验结果表明，抑菌带宽度大于10mm的共有13个菌株，抑菌带宽大于19mm的有3个菌株，其中，菌株HS1抑菌效果最好，抑菌带宽度达20.6mm(表1，图1)。如图1所示，图1为上述实施例中菌株HS1与聚生小穴壳菌的对峙的实验结果，左图是菌株HS1活体与聚生小穴壳菌的对峙实验，右图菌株HS1发酵液与聚生小穴壳菌的对峙实验。从图1左图中可以看出聚生小穴壳的左侧的生长受限，右侧生长正常，菌株HS1活体对聚生小穴壳的生长有明显的抑制作用，呈现出清晰宽阔的抑菌带。右图中可看出上两行盛放菌株HS1发酵液牛津杯下方呈现出清晰明显、直径较大的抑菌圈，聚生小穴壳生长受限。最后一行盛放等量无菌水的牛津杯下方无抑菌圈产生，聚生小穴壳菌生长正常。说明菌株HS1抑菌作用显著，真实有效，符合筛选要求。

表1链霉菌活体对聚生小穴壳菌的抑菌活性

Table 1 Inhibition of antagonistic streptomyces to Dothiorellagregaria

表中数据为平均数±标准差。Data in the table are mean±SD.

2.2生防菌HS1活菌及其发酵液抑菌谱测定

菌株HS1活体抑菌谱测定结果表明：HS1菌株抑菌谱广，对所有供试病原菌菌株均有一定的抑制作用(如表2所示)。HS1活菌对聚生小穴壳菌、金黄壳囊孢、葡萄座腔孢菌、三线镰刀菌、褐纹拟茎点霉、平头刺盘孢的抑制效果最好，可见明显的抑菌带，平均宽度达到20mm以上，与其他病原菌对比差异性显著(P<0.05)。对凸脐蠕孢、互隔交链孢、尖孢镰孢、辣椒刺盘孢也有较强的抑制作用，抑菌带平均宽度15mm以上。

菌株HS1发酵液的抑菌谱测定结果表明(如表2所示)：菌株HS1发酵液可抑制所有供试病原菌的生长，尤其是聚生小穴壳菌、金黄壳囊孢、葡萄座腔孢病菌、大斑病凸脐蠕孢这四种病原菌抑菌效果最好，抑菌直径达39mm以上；对平头刺盘孢、褐纹拟茎点霉、互隔交链孢、辣椒刺盘孢的抑制强度较高，抑菌直径在30～38mm。菌株HS1的发酵液对上述8种病原菌的抑制强度高，防治效果优于其他病原菌。通过Duncan氏新复极差方法分析，HS1发酵液对聚生小穴壳菌、金黄壳囊孢、葡萄座腔孢、大斑病凸脐蠕孢、辣椒刺盘孢与其他供试菌株相比差异性显著。从筛选试验中可以看出，尽管在土壤中含有丰富的放线菌，但拮抗菌的淘汰率也比较高。对于拮抗菌株的室内筛选过程，将活体、发酵液及其稳定性等多方面综合考虑，才能筛选到真正有应用价值的菌株。生防菌株HS1及发酵液对聚生小穴壳菌的抑制强度高，稳定性好，抑菌谱广泛，因此选取菌株HS1作为聚生小穴壳菌引起的杨树溃疡病的生防菌株。

表2生防菌株HS1活体和发酵液的抑菌谱

Table 2 Antimicrobial spectra of antagonistic microorganism andfermented broth about HS1

表中数据为平均数±标准差。同列数据后小写字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.05水平差异显著。

Data in the table are mean±SD.Different lowercase letters in thesame column indicate significant difference at P<0.05 levels by Duncan’s newmultiple range test,respectively.

2.3生防菌株HS1的形态学分类鉴定

2.3.1菌株HS1形态观察

菌株HS1在高氏一号培养基上呈辐射状生长，气生菌丝茂盛，28℃培养1～2d时，圆形菌落光滑、无孢子生成。第3d开始有白色孢子从菌落边缘长出，4d后开始逐渐变为肉蚌白色，基质菌丝体呈现酪黄色，无可溶性色素产生(图2A)。30d后，菌落凸出变大，颜色呈现灰紫粉色(图2B)。在显微镜下观察，菌丝细长有大量分枝，菌丝螺旋或直形，无横膜，不断裂(图2C)，菌丝的不同位点会产生小的椭圆形分生孢子(图2D)，根据形态特征初步分析菌株HS1为链霉菌属。

2.3.2菌株HS1培养特征

菌株HS1接种于15种测试培养基上，28℃恒温培养24～48h后开始有菌落出现，72～96h后孢子开始产生。不同的培养基上菌苔的形态、孢子堆的颜色、基质菌丝的颜色、产生的色素、生长情况均有不同，根据《链霉菌鉴定手册》提供的方法和色版进行观察、比对，结果如表3所示，综合菌株在15种培养基上形态特征及菌丝和孢子形态初步判定HS1为淡紫色类群链霉菌。

表3菌株HS1的培养特征

Table 4 Cultural characteristic of Streptomyces strain HS1

“-”:不生长；“+”:生长；“++”:生长良好；“+++”:旺盛生长。“-”:No growth；“+”:growth；“++”:moderate growth；“+++”:abundant growth.

2.4生防菌株HS1的生理生化特征

2.4.1菌株HS1的耐受性测定

菌株HS1对碱的耐受性良好，在pH5～12的范围内均能生长，且pH＝7为生长的最适pH；对NaCl的耐受性很强，盐浓度越高，菌株生长越旺盛；菌株在4～28℃下均可生长，对高温度耐受性较弱，低温耐受性较好，28℃为最适生长温度(表4)。

表4菌株HS1的耐受性测定

Table 4 Tolerance to PH/temperature/NaCl of Streptomyces strain HS1

“-”:不生长；“+”:生长；“++”:生长良好；“+++”:旺盛生长。“-”:No growth；“+”:growth；“++”:moderate growth；“+++”:abundant growth.

2.4.2菌株HS1的碳源利用情况

菌株HS1可利用碳源有D-木糖、D-果糖、葡萄糖、a-乳糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸、L-阿拉伯糖，其中D-木糖、D-果糖和葡萄糖是最合适的碳源，菌株生长旺盛；不能利用棉子糖、甘露醇、蔗糖和L-鼠李糖。

表5菌株HS1的碳源利用测定和酶学特性

Table 5 Utilization of carbon sources and enzyme properties ofStreptomyces strain HS1

“-”:不生长；“+”:生长；“++”:生长良好；“+++”:旺盛生长。“-”:No growth；“+”:growth；“++”:moderate growth；“+++”:abundant growth.

2.4.3菌株HS1的酶学特性

菌株HS1的酶学特性结果如表5所示，过氧化氢酶、脲酶、淀粉水解实验均呈阳性。说明菌株HS1具有过氧化氢酶，能催化分解过氧化氢；有产生尿素酶的能力；产生淀粉酶活性较强。硝酸盐还原反应呈阳性，玫瑰红色，菌株HS1能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。脂酶实验呈阴性；不能使明胶液化；不能分解利用纤维素。

2.4.4菌株HS1的代谢产物测定

此实验主要测定菌株HS1代谢产物中有机酸组分。如图3所示，为菌株HS1的M.R./V.P.试验结果，左图为M.R.试验结果，右图为V.P.试验结果。左图中，接种HS1菌株的试管内培养基变成红色，control管呈现原培养基颜色，未变色。右图中，接种HS1菌株的试管变成红色，control管未变色。说明，HS1的M.R.试验和V.P.实验均呈阳性，菌株HS1比较特殊，实验时间持久变色，不存在假阳性。表明菌株HS1在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸或进一步脱羧乙酰甲基甲醇(图3)；H₂S的产生实验呈现阳性灰黑色，产生黑色素，说明菌株HS1可分解含硫有机物。

2.5菌株HS1的16S rDNA鉴定

电泳结果表明，所提的DNA完整性良好，无污染，菌株HS1的16S rDNA基因扩增产物如图4所示。目的片段后扩增效果良好，产物的大小约为1.4Kb，与报道的16S rDNA大小一致。经测序，菌株HS1(基因登录号：MN636764)的16S rDNA基因扩增片段全长为1398bp，与GenBank数据库中相关放线菌菌株的16S rDNA序列比对，菌株与已知放线菌的链霉菌Streptomyces spiroverticillatus16S rDNA同源性最高，达到99％。选择17株与菌株HS1同源性较高的序列，使用MAGA6软件进行系统发育分析(图5)，结果表明，菌株HS1与Streptomyces spiroverticillatus亲缘关系最近，因此初步确定菌株HS1为螺旋轮生链霉菌。

3结论与讨论

植物病害的农用抗生素的药害一般较化学农药低，且杀菌作用强，防治效率较高，具有高效低毒的特点，使用抗生素代替化学农药防治植物病害是今后的发展方向之一。放线菌是产生抗生素最多的类群，而链霉菌又是放线菌中产抗生素最多的一个属。一般来说，农用抗生素的筛选可以直接用植物的病原菌作为筛选模型。目前初筛的方法一般均以体外抗菌活性测定为主。在杨树溃疡病的防治方面，针对聚生小穴壳的研究目前并没有报道，本发明利用稀释分离法从土壤样品中共分离到链霉菌菌株104株，以聚生小穴壳菌作为靶标，采用活体对峙，发酵液抑菌活性测定及抑菌谱测定相结合的多重筛选法，获得对聚生小穴壳菌抑菌效果明显、抑菌谱较广且效果稳定的拮抗链霉菌菌株HS1，根据它在不同的培养基中的形态表现，生理生化特性及16SrDNA序列的分子鉴定，初步将菌株HS1鉴定为Streptomyces spiroverticillatus。菌株HS1对聚生小穴壳菌的抑菌带达20.66mm，发酵液的抑菌圈直径达40.26mm，杨树烂皮病菌金黄壳囊孢的抑菌带20.30mm，抑菌直径40.02mm，葡萄座腔孢菌的抑菌带21.72mm，抑菌直径39.84mm。说明本发明所述的链霉菌HS1具有抑菌谱广、抑菌效果明显、效果稳定等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种链霉菌在生物防治中的应用，其特征在于，链霉菌的保藏编号为CGMCCNo.18657。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于防治杨树溃疡病、杨树烂皮病、蓝莓溃疡病、蓝莓枯枝病、甜瓜枯萎病、水稻恶苗病、红小豆炭疽病、玉米大斑病、烟草赤星病、辣椒炭疽病、云杉立枯病、瓜果腐霉病、茄子褐纹病中的一种或几种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，对以下病原菌的一种或几种的组合有抑菌作用：杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria、杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma、蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeriadothidea、蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccum parum、甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusarium oxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusariumtricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans。

4.一种含有链霉菌的菌剂在生物防治中的应用，其特征在于，链霉菌的保藏编号为CGMCC No.18657。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于防治杨树溃疡病、杨树烂皮病、蓝莓溃疡病、蓝莓枯枝病、甜瓜枯萎病、水稻恶苗病、红小豆炭疽病、玉米大斑病、烟草赤星病、辣椒炭疽病、云杉立枯病、瓜果腐霉病、茄子褐纹病中的一种或几种的组合。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，对以下病原菌的一种或几种的组合有抑菌作用：杨树溃疡病病原菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria、杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma、蓝莓溃疡病病原菌葡萄座腔孢菌Botryosphaeriadothidea、蓝莓枯枝病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccum parum、甜瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢Fusarium oxysporium、水稻恶苗病病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、红小豆炭疽病病原菌平头刺盘孢Colletotrichum truncatum、玉米大斑病原大斑病病原菌凸脐蠕孢Exserohilum turcicum、烟草赤星病病原菌互隔交链孢Alternaria alternata、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici、云杉立枯病病原菌三线镰刀菌Fusariumtricinctum、瓜果腐霉病病原菌瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、茄子褐纹病病原菌褐纹拟茎点霉Phomopsis vexans。

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