CN111909853B - 一种木质素降解菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木质素降解菌及应用，所述木质素降解菌命名为灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum)，株号P8，保藏号为CCTCC M 2020112。本发明通过筛选获得了一株能够高效降解木质素的菌株，对农作物秸秆具有较好的降解效果，可以用于生物法降解农作物秸秆。

Description

一种木质素降解菌及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种木质素降解菌及应用。

背景技术

农作物中占比最大的部分当属作物秸秆。作物成熟后，在收取地上果实部分，剩下的残留物，也就是秸秆。全球每年可产生约20亿吨秸秆。秸秆利用可以分为五类(卜毓坚等，2006)，一是作为原料用于造纸，二是用于食用菌等栽培的基料，三是作为畜牧的饲料，四是作为燃料，五是用作肥料。其中用于造纸或者栽培基质的使用少，占比低。畜牧业使用秸秆主要是秸秆中比较优质的部分，用量不大。用作生活燃料，随着国民生活水平的提高，农村电和天然气的使用作为燃料的量也是越来越小。但是像主粮作物大省，河南、河北、山东等地，为了避免大量秸秆回田，影响下茬种植，老百姓采用焚烧的方式还田。不但会造成环境破坏，同时有可能造成火灾和交通事故，所以国家已经明令禁止。

秸秆还田是指，使用农业设备将秸秆粉碎，翻耕，覆盖等方式还田。然后种植下一季作物，秸秆在缓慢降解的过程中，会对植物和土壤产生影响。秸秆还田与非还田比起来，土壤的空隙增加，容重降低，团粒结构形成较好，土壤有机质及土壤碳贮量均显著提高。同时，土壤蓄水能力增强，其增加的蓄水量主要集中在地上部分50cm。这样的方式可以有效的缓解水资源匮乏减少对水源的破坏。秸秆还田对土壤温度也有影响，冬季和早春对于土壤的温度有明显的增温作用，同时在春夏或者夏季的时候会降低土壤的温度。这样有效调节土壤温度，利于作物生长。秸秆还田还能降低土壤表层盐分保证作物产量，可改善盐渍土农林利用。

综上可知，秸秆还田有益于土壤结构，土壤肥力增加，土壤含水量保持，土壤温度调节，土壤盐分和抗生素调节。

秸秆还田虽然优点很多，但带来的弊端也很多。并且在秸秆还田之后需要一定降解时间，主粮生产区域耕地复种指数高，倒茬时间短，秸秆C/N比高，秸秆还田的降解带来困难。适宜秸秆腐烂的C\N为20:1～25:1.而秸秆本身的C\N比较高，玉米秸秆为53：1，小麦秸秆为87:1。这样高的C\N比在秸秆腐烂过程中就出现反硝化作用，影响作物生长。秸秆还田之后，土壤里大量充斥着不同规格的秸秆颗粒。使得土壤变得疏松，空隙大小不均匀。这样在种植过程中，使得种子不能很好的与土壤接触，如果遇到浇水困难，天气不好的情况下，会造成特别是像小麦这样的小颗粒种子无法扎根，影响正常发芽和生长。秸秆还田改变土壤微环境，为病原提供了良好的繁殖场所，导致病害爆发。这是因为秸秆还田之后，短时间增加了土壤里的有机质，打破了土壤之前的结构层。一方面因为土壤有机质的增加，改变了土壤的性质；另外一方面秸秆进入土层的同时大量微生物也进入到土里。土壤性质和微生物的改变，让土壤原有的一些土生优势菌群受到了威胁，而一些致病菌却能生长的很好，进而加重土传病害。

综上可以看出，秸秆还田的优缺点显著。其问题集中在如何提升秸秆的降解效率。学者为了提升秸秆的生物降解效率，在秸秆本身的性质上和生物降解菌上做了大量的研究。通过研究发现，秸秆降解菌能降解秸秆，主要是由于其能产生分解纤维、半纤维、木质素等的酶类。

木质纤维素是在地球上分布最广的可再生资源。广泛存在植物体内，木质纤维素的含量都能占植物的35％～50％。在农作物秸秆中的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。小麦秸秆杆部纤维素含量可达51.16％，而木质素高达23.89％(赵蒙蒙等，2011)，小麦秸秆纤维素木质素组合高达75.05％。玉米秸秆中各成分的含量为：纤维素63.03％、半纤维素5.91％、木质素13.67％(武崇辉，2014)，玉米秸秆纤维素木质素组合高达82.61％。小麦秸秆的木质素占比更高于玉米秸秆的木质素占比。所以，研究木质素和纤维素就显得尤为重要。

自然界中能够降解纤维素的微生物很多。例如，担子菌：虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)；木腐菌：粉孢革菌(Coniophora puteana)和地窖粉孢革菌(Coniophoracerebella)；子囊菌：康宁木霉(Acrostalagmus koningii)和里氏木霉(Trichodermareesei)等(Magalhaes et al，2006)。

基于纤维素在自然界中广泛存在，近年有学者从不同地方筛选适宜自己需要的降解菌。例如有从腐烂的秸秆、森林土及羊瘤胃液培养发现，枯草芽胞杆菌，黑曲霉对纤维素降解较好(张二红等，2015)。从盐湖土壤里，矿藏的肺水肿，沙土里等分离的木霉、青霉、黑曲霉菌的组合菌的对于玉米秸秆的降解较好(张立霞等，2013)。更有学者从蚯蚓堆肥里筛选出四株纤维素的降解菌，制作成生物菌剂之后投入堆肥中查看其应用效果发现。可明显增强蚯蚓体内和粪便中的纤维素酶的活性，提高秸秆堆肥的效率(邓艳芹等，2016)。

自然环境中，能降解木质素的微生物较少。其需要依靠细菌和真菌等共同起作用。其中真菌的佼佼者就有褐腐菌与白腐菌(吴坤等，2000)。白腐菌是自然界中木质素最有效降解者(林云琴和周少奇，2003)。有三个重要特点：其一，可以将木质素降解为二氧化碳；其二，氧化反应，所以产物中不出现木质素单体；其三，但是其需要另外提供菌生长的能量(徐海娟和梁文芷，2000)。降解过程依赖包括过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)与漆酶Lac等一系列酶(梁军锋等，2009)。其中氧化反应过程中漆酶(Laccase)属于利用氧气的多酚氧化酶系和Lip和Mnp利用H₂O₂的过氧化物酶系(徐海娟和梁文芷，2000)。

同纤维素降解菌类似，木质素降解菌在自然界也广泛存在。通过在福建武夷山农田土壤进行分离，选出了一株经鉴定为大孢戴氏霉，对于水稻和玉米秸秆中的木质素降解率分别达到41.7％和48.3％(王垚等，2016)。在常年堆放在秸秆堆里的腐烂的秸秆和土壤里筛选的出来的降解木质素较强的菌种，用滤纸测定，发现三株降解较高的菌种，降解率达39.35％，44.38％和52.4％。其中两株菌为唐氏木菌(迟畅等，2013)。通过对多年玉米秸秆的腐烂的木材，玉米，从长春等多个地方采集70余份土壤，得到200余株真菌。通过在木质素上的分解表现，最后筛选出一株高效降解菌。比对照活力多达40.76％(郭晓威等，2017)。也有学者为满足工业化的需要，从马粪和朽木中发现了一株适宜45℃的高温木质素降解菌(张瑞秋等，2017)，用于对工业木质素降解的需要。

有学者研究发现，秸秆还田过程中，木质素的降解与土壤性质，水分大小，以及土壤养分都有相关性。通过对旱地和水旱轮作地以及两种不同的长期肥料的使用方式，秸秆还田配合使用化肥，单独使用化肥来测定其对于土壤里的木质素的含量及组成的影响发现。N素水平和木质素的降解速度成正相关(冯书珍等，2015)。以秸秆还田配合化肥两种不同土壤条件下的使用，两种土壤的木质素含量都有所提升。石灰土的木质素分解矿化程度较红壤高。木质素含量及组成均与土壤速效养分(碱解氮、速效磷、速效钾)显著相关(冯书珍等，2015)。

虽然可在很多地方都能发现和获得秸秆降解菌，但这些微生物只有在应用的环境中能繁殖和生长发育才具有应用价值，因而选择株系具有适应当地还条件是关键。秸秆最后是要在土壤中进行降解，所以从产生秸秆的土壤里筛选适应当地土壤环境的降解菌，这些具有良好适应性生物学特性的株系为田间应用提供了保证。

发明内容

本发明提供了一种木质素降解菌及应用，该木质素降解菌能够降解植物木质素，对农作物秸秆具有较好的降解效果。

一种木质素降解菌，命名为灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum)，株号P8，保藏号为CCTCC NO：M 2020112。

本发明又提供了所述木质素降解菌在降解农作物秸秆中的应用。其中，农作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆。

本发明又提供了一种用于农作物秸秆降解的菌剂，包含所述的木质素降解菌。

本发明还提供了一种农作物秸秆降解方法，向农作物秸秆中加入所述的菌剂。其中，农作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆。

本发明通过筛选获得了一株能够高效降解木质素的菌株，对农作物秸秆具有较好的降解效果，可以用于生物法降解农作物秸秆。

附图说明

图1为刚果红染色对纤维素酶的产生进行定性测定其中两个菌株的结果。

图2为使用苯胺蓝和雷玛唑亮蓝染色筛选结果，P8-1在雷玛唑亮蓝染色的木质素筛选培养基上，P20-1、L12-2在苯胺蓝染色的木质素筛选培养基上，同一菌株上下两张图分别为正面和反面的染料脱色效果图。

图3为菌株(T7、T9、T3、T4、T1)在雷玛唑亮蓝染色筛选培养基、苯胺蓝染色培养基正反面脱色图。

图4为短梗蠕孢菌在麦芽培养基(MEA)25℃培养8d的形态特征。a.正面；b.背面；c-i.分生孢子梗，分生孢子链和分生孢子；标尺：c-f，h-i＝10μm，g＝20μm。

图5为24个腐质霉属分类单元结合RPB2位点序列产生的最大似然(ML)系统发育树。用Ovatospora brasiliense CBS140.50作为外群，具有>50％ML支持值表示在分枝上，土壤样品中分离出来的菌株用粗体显示。T：模式种。

具体实施方式

培养基配制：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂粉17.5g/L。

纤维素筛选培养基(PSM)：尿素0.3g/L，硫酸铵1.4g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，酵母提取物0.25g/L，蛋白胨0.75g/L，羧甲基纤维素钠10.0g/L，琼脂粉17.5g/L。

木质素筛选培养基：木质素磺酸钠3.00g/L，K₂HPO₄ 1.00g/L，MgSO₄·7H₂O 0.20g/L，CaCl₂ 0.10g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L，KH₂PO₄ 1.00g/L，(NH₄)₂SO₄1.98g/L，琼脂15.00g/L，pH为7.0。

基础培养基(BM)：酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，pH为7.0。

察氏液体培养基(Czapek–Dox Medium)：蔗糖30.0g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蒸馏水定容至1000mL，pH调至7.0～7.2。

麦芽培养基(MEA培养基)：麦芽提取物50g/L，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.005g/L，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.01g/L，琼脂15g/L，pH调至5.2-5.6。

实施例1

1、取样

取自河南省小麦-玉米-小麦轮作田的土壤样品和10份，每份1000g，小麦-花生-小麦轮作田土壤样品(10份，每份1000g)。扒开土壤地上杂草，随机采取地表下20cm土样于无菌袋中，密封后4℃保存。

2、纤维素降解菌筛选

将纤维素筛选培养基(PSM)倒入9cm直径培养皿中风干备用。配制土壤悬浮液。称取20种土样各1g，倒入干净试管中，加入9ml无菌水，水摇床震荡，配成1×10^-1g/L土壤悬浮液，然后序列稀释为1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4和1×10^-5的土壤悬浮液。分别取200μL的系列稀释悬浮液均匀涂布于纤维素筛选培养基。在无菌操作台中吹干后封口。将涂有土壤悬浮液的培养基倒置放在25℃培养箱中黑暗条件下培养约2-3d后观察生长情况，挑取长势良好的不同真菌菌落于新的培养基中，尽量保持菌落单一，依据样品先后进行编号。将挑取的菌落在25℃培养箱中培养2d后，在每个菌落中用灭菌的接种针挑取纯净菌丝或孢子于新的木质素筛选培养基培养待用。

3、木质素分解菌筛选

将木质素筛选培养基倒入9cm直径培养皿中风干备用。称取20种土样各1g，倒入干净试管中，加入9ml无菌水配成1×10^-1g/L土壤悬浮液，于摇床震荡。配成1×10^-1g/L土壤悬浮液，然后序列稀释为1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4和1×10^-5的土壤悬浮液。分别取200μL的1×10^-3、1×10^-4和1×10^-5悬浮液涂布于木质素筛选培养基。将涂有土壤悬浮液的培养基倒置放在25℃培养箱中黑暗条件下培养约2-3d后观察生长情况，挑取长势良好的不同真菌菌落于新的木质素筛选培养基中，尽量保持菌落单一，依据样品先后进行编号。将挑取的菌落在25℃培养箱中培养。

4、初筛结果

使用木质素筛选培养基和纤维素筛选培养基对20份土样进行初筛，在10份小麦-花生-小麦轮作土壤中，用纤维素筛选培养基筛选得到22种真菌，分别命名为P1-1、P1-2、P2-1、P2-2、P2-3、P2-4、P2-5、P2-6、P4-1、P4-2、P4-3、P5-1、P5-2、P5-3、P5-4、P6-1、P6-2、P7-1、P8-1、P8-2、P9-1、P9-2；用木质素筛选培养基筛选得到11种真菌，分别命名为L1-1、L2-1、L3-1、L5-1、L5-2、L5-3、L7-1、L7-2、L8-1、L8-2、L10-1。在10份小麦-玉米-小麦轮作土壤中，用纤维素筛选培养基筛选得到11种真菌，分别命名为P11-1、P11-2、P12-1、P13-1、P16-1、P16-2、P17-1、P18-1、P19-1、P19-2、P20-1；用木质素筛选培养基筛选得到9种真菌，分别命名为L11-1、L12-1、L12-2、L15-1、L17-1、L18-1、L19-1、L19-2、20-1。此外，两种培养基共筛选木霉菌14种，分别编号为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14。总计67株。

5、纤维素复筛菌株酶活性测定。

将PSM培养基筛选得到的菌株培养7d后，用1％刚果红染色纤维素筛选培养基30min，1Mol NaCl溶液脱色20min。有纤维素系列酶的菌落会在经刚果红染色，氯化钠洗脱后在菌丝边缘有明显脱色的晕圈，测量透明圈直径H和菌落C直径，二者比值HC值，衡量其纤维素酶能力：

6、木质素复筛菌株酶活性测定。

将筛选菌株接种到在BM培养基中分别加入0.1g/L的苯胺蓝和雷玛唑亮蓝染料的培养基上，25℃培养。根据过木质素氧化物酶、锰过氧化物酶对苯胺蓝和漆酶对雷玛唑亮蓝染料的脱色效果可定性检测木质素系列酶的产生，筛选脱色效果最佳的菌株进行后续实验。

7、纤维素复筛结果

通过刚果红染色对纤维素酶的产生进行定性测定，33种真菌共筛选出3种有酶活的菌株(表1)。

表1：纤维素降解菌的筛选结果

菌株	透明圈	透明圈直径	菌落直径	HC比值
					P5-3	清晰	5.18	3.85	1.35
L17-1	较清晰	3.03	2.57	1.18
					P19-2	较清晰	4.05	3.45	1.17
其它	模糊不清	\	\	\

如图1所示，其中菌株P5-3透明圈清晰。将筛选所得清晰的菌系进一步进行筛选及鉴定。

8、木质素复筛降解菌筛选结果

20种真菌中，培养7d后。使用苯胺蓝和雷玛唑亮蓝染色筛选出三种显色的菌株，其它菌株显色不明显(表2)。

表2：木质素降解菌的筛选结果

菌株	苯胺蓝	亮蓝
			P8-1	-	+
P20-1	+	-
			L12-2	+	-
其它	-	-

如图2所示，其中，菌株P8-1，P20-1，L12-2脱色效果显著，将用于下一步试验研究。

9、木霉菌株筛选结果

将14株木霉菌株分别在雷玛唑亮蓝和苯胺蓝染色的木质素筛选培养基上，3d后木霉菌均能长满培养基，但是脱色效果没有明显区分，7d后共有5种木霉脱色(表3)。

表3：木质素降解菌(木霉菌)筛选结果

菌株	苯胺蓝	亮蓝
			T1	+	+
T3	+	+
			T4	+	+
T7	+	+
			T9	+	+
其它	-	-

其中5种木霉(T1，T3，T4，T7，T9)脱色效果显著，将用于下一步试验研究。

由图3可知，3d后初筛木霉对雷玛唑亮蓝染色的木质素筛选培养基的脱色效果均不明显。7d后T7菌株在苯胺蓝染色木质素筛选培养基上开始初步显现脱色效果。7d后T7菌株有明显优于其他木霉菌株的脱色效果。

10、玉米、小麦秸秆降解

将使用上述方法筛选的降解菌进行玉米秸秆、小麦秸秆锥形瓶降解实验。将小麦秸秆剪成3-4cm长度，玉米秸秆表皮剥下，剪成每段3-4cm长度。在60℃烘箱烘干24h待用。配制察氏液体培养基，在250ml锥形瓶中每瓶分装100ml，每瓶加入烘干的玉米秸秆约3.00g或烘干的小麦秸秆约2.00g，记录每瓶中玉米秸秆或小麦秸秆具体重量。高温灭菌备用。筛选培养基得到的纯化菌株在25℃条件下培养3d后，在超净工作台中切取边长为0.5cm的菌块，放入察氏液体培养基中，每个处理重复3瓶，将边长为0.5cm的空白培养基菌块也放入加入玉米秸秆和小麦秸秆的察氏液体培养基中，重复3瓶作为对照。将锥形瓶放入摇床，在25℃，180rpm条件下培养25d。然后将锥形瓶中玉米小麦秸秆取出，洗净筛选菌株的菌丝和菌块，放入烘箱在60℃条件下烘干72h后记录烘干后质量，计算筛选菌株的降解率。

将果红染色的P5-3菌株、雷玛唑亮蓝脱色效果良好的P8-1；苯胺蓝脱色效果良好的P8-1、L12-2；木霉菌株中效果良好的T7进行玉米秸秆、小麦秸秆锥形瓶降解实验，实验结果如表4所示。

表4：5个分离系降解玉米秸秆的测定结果

^*25℃，25d。

玉米降解试验数据显示：所有的菌株对玉米秸秆降解均有效果。其中P8-1平均降解率为31.08％，表现最好，与别的菌株存在显著差异(P<0.5％)。T7与L12-2降解率分别为16.13％和14.24％，不存在显著差异P20-1和P5-3降解率也不存在显著差异(表5)。

表5：5个分离系对小麦秸秆降解的测定结果

^*25℃，25d。

在小麦秸秆的降解试验中(表5)：所有的菌株对其均有降解的效果，其中P8-1降解率为29.57％，效果最好，与P5-3没有显著差异(P<0.5％)。P8-1与P5-3同其他菌株存在显著差异。

11、形态学观察

将分离的菌株接种到直径9mm的PDA和MEA培养基上，在25℃培养箱中黑暗培养7d，观察P8-1的菌落形态特征。挑取子实体，制片，用显微镜观察分生孢子的形态、大小；分生孢子梗形态特征。

根据形态学特征，分离系P8-1被鉴定为短梗蠕孢属灰短梗蠕孢菌(Trichocladiumgriseum)。

如图4所示，在MEA培养基上，25℃下，8d后，菌落平展，初棉絮状或鼠毛状，后淡灰色至灰黑色，背面观黑色。直径3.9-4.0cm。菌丝体大部分表生，少部分埋生。分生孢子梗不分枝，透明或亚透明，浅褐色，柱形或在顶部膨大，直或稍弯曲，2.5–50μm长，2–5μm宽(接近顶部)。分生孢子12–18μm长，12–16μm宽，单细胞，单生，有时2-3个孢子成链或几个成簇，橄榄褐到深褐色，光滑，球形或亚球形。这些特征一致于灰短梗蠕孢菌(T.griseum)特征。

12、基因组DNA的提取

用上述初筛、平板复筛、玉米小麦秸秆降解筛选得到的P8-1菌株进行真菌基因组DNA的提取。菌株接种在含有100ml PDB液体培养基锥形瓶中，然后放在25℃、150rpm转速震荡摇床中培养4d，收集菌丝，用液氮冷冻，研磨成粉，然后用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物有限公司，上海)提取真菌基因组DNA。将获得的基因组DNA溶于50μLTE缓冲液并冻存于-20℃冰箱。

13、PCR扩增和测序

用筛选获得的P8-1进行分子鉴定。为了扩增ITS-28S区，用引物对V9G/LS266。为了分析株系P8-1，RNA聚合酶II二大亚基(RPB2)基因用引物对rpb2-5F2/rpb2AM-7R(其中，Y表示C/T，M表示A/C，W表示A/T，R表示A/G)。引物序列如表6所示。

表6：为扩增分离系P8-1的引物

配制50μL PCR反应体系(表7)，PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性60s，各引物最适退火温度退火60s，72℃延伸90s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min，4℃下保存。其中，NL1/NL4为51℃，983F/2218R和BT2a/BT2b的退火温度为57℃。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统观察片段大小。PCR产物由擎科生物技术有限公司进行测序，测序结果与GenBank库中已知序列比对。

表7：PCR反应体系(50μL)

试剂	体积(μl)
		2×HLingene PCR MasterMix	25
上游引物(10μM)	2-3
		下游引物(10μM)	2-3
模板	2
		ddH<sub>2</sub>O	加至50

用引物对V9G/LS266扩增ITS-28S区所得扩增产物大小为1048bp，测序结果显示序列如SEQ ID No.1所示。用引物对rpb2-5F2/rpb2AM-7R对分离系P8-1进行PCR检测，分别扩增到大小为1153bp片段，测序结果显示序列如SEQ ID No.2所示。P8-1测序结果用BLAST在GenBank数据库进行搜索，序列分析显示，分离系P8-1与Humicola grisea strain CBS119.14NeoT有很高的同源性。

14、系统发育树的构建

将获得的序列与GenBank数据库中同源基因进行比较分析，获得最相似的序列从而初步确定菌株属种。从GenBank中下载同源序列(表8)，用于系统发育分析。用软件MAFFT7.273对序列进行排列，再用BioEdit对序列两端进行剪切，获得的序列用Gblocks 0.91b进行保守区域的选择，剔除模糊位点以及有分歧的区，然后通过jModel Test 2.1.7进行模型预测。用软件RaxmLGUI v.1.5构建ML树。

表8：P8-1系统发育树株系来源和GenBank号

^a核糖体内转录间隔区(ITS)和大亚基(LSU)序列；^b聚合酶II中第二大亚基(RPB2)基因。

用于系统发育树的同源序列，包括23个分类单元作为内群，T.ucrainicus作为外群。每个ITS区或基因的序列用MAFFT 7.273进行排列，并用BioEdit进行编辑，再用Gblocks0.91b在系统发育分析之前挑出模糊排列的位置和歧义区。用jModel Test 2.1.7估计每个排列的演化模型，根据Akaike信息标准选择最佳模型。用RaxmlGUI v.1.5进行短梗蠕孢菌属系统发育最大似然(ML)法分析。GTR+I用于核苷酸置换演化模型分析，1000次靴带值重复推断每个最大似然树。50％的值显示在树的节点上。

系统发育分析表明(图5)，所有分类单的关系可在种水平上清楚地区分。测试分离系P8-1与3个Trichocladium griseum分类单元聚在一起作为一个分支，具有100％靴带支持值。它们与Trichocladium griseum CBS 119.14^T聚在一起，显示了密切的亲缘关系。

依据形态学和系统发育的分析，都证实本实验筛选得到的分离系P8-1被鉴定为短梗蠕孢属灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum sp)。将该P8-1命名为灰短梗蠕孢菌(T.griseum)，株号P8，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020112，保藏日期为2020年5月11日。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种木质素降解菌及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1048

<212> DNA

<213> 灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum sp)

<400> 1

aagagttgca aactcccaaa ccattgtgaa ataccttcaa cgttgcttcg gcgggttggc 60

cccggtctcc ggggtccccg gccctactcg ggcgcccgcc ggaggtatct aactcttgaa 120

cttttatggc ctctctgagt ctttgtactt aataagtcaa aactttcaac aacggatctc 180

ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 240

tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcatgc 300

ctgttcgagc gtcatttcaa ccatcaagcc cccggcttgt gttggggacc tgcggctgcc 360

gcaggccctg aaaaccagtg gcgggctcgc tagtcactcc gagcgtagta atacatctcg 420

ctcagggcgt gctgcgggtt ccggccgtta aaaagcctta tttacccaag gttgacctcg 480

gatcaggtag gaagacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa aagaaaccaa 540

cagggattgc cctagtaacg gcgagtgaag cggcaacagc tcaaatttga aatctggctt 600

cggcccgagt tgtaatttgt agaggatgct ttgggcgcgg ctctaactga gttccctgga 660

acgggacgcc acagagggtg agagccccgt atagttagat gcctagccta tgtaaagctc 720

cttcgacgag tcgagtagtt tgggaatgct gctctaaatg ggaggtaaat ttcttctaaa 780

gctaaatatt ggccagagac cgatagcgca caagtagagt gatcgaaaga tgaaaagcac 840

tttgaaaaga gggttaaata gcacgtgaaa ttgttgaaag ggaagcgctt gtgaccagac 900

ttgcgccggg cagatcatcc ggtgttctca ccggtgcact ctgcccggct caggccagca 960

tcggttctcg tggggggata aaggtcccgg gaacgtagct cctccgggag tgttatagcc 1020

cggggcgtaa tgccctcgtg ggaccgag 1048

<210> 2

<211> 1153

<212> DNA

<213> 灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum sp)

<400> 2

aaatgaattg ctgttcgctg cttgccagct cttccgaggt gtcgtgcggc gcatgaccca 60

agacttgatg tcctacatga agcggtgcat cgacaccaac aagaacttct ccctcgctct 120

gggcatcaag cactcgactc tcaccaatgc cctgaagtac tctctggcga cgggtaattg 180

gggcgaccag aagaaagcca tgagctccac cgccggtgtg tctcaggtgc ttaatcgcta 240

cacctttgcc tcgacactct cccatttgcg gcgaaccaac acgcctatcg gccgcgacgg 300

caagattgcc aaaccccgac agctccacaa cacccattgg ggcctggtgt gccctgcaga 360

gactcccgaa ggtcaggctt gcggcctcgt caagaacctg tcgttgatgt gctacgtcag 420

cgtgggcacg cccgcggatc ccgtagtaga gttcatgatt gccaggaata tggaagtcct 480

cgaagagtac gaaccgctcc gatatcccaa tgccaccaag gtgttcgtca atggtacctg 540

ggtcggtgtt catcaagatc cgaagcacct ggtctcgttg gtccagggtc tgcggagaaa 600

gaacgtcatc tcgttcgagg tctcgctggt ccgcgacatc cgtgaccgcg agttcaagat 660

cttctcggat gcggggcgag tcatgaggcc actctacacg gtggaacagg aggagaacgg 720

cgaccatggc gctgagaagg gccagcttat cctcaacaag gaccacatcc aaaggctcga 780

ggcggacaag gagctgggga agttccatcc cgactactgg ggctggcaag ggcttttgag 840

gtcaggtgcc attgagtact tggatgccga ggaggaagag acagtcatga tttgcatgac 900

gcccgaggac ctcgacatgt accgcctgag caagatgggc ttcgaggtgg acgacacctc 960

tggtgtcgga aataaccgga ttaggaccaa gatgaatccg acaactcatg tgtacacaca 1020

ttgtgagatc caccccagca tgctgctcgg catctgcgcg agcatcattc cattccccga 1080

tcacaaccaa tctcccagaa acacatacca gtctgccatg ggcaagcagg ctatgggtct 1140

catacactcg cag 1153

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttacgtccct gccctttgta 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcattcccaa acaactcgac tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (3)..(18)

<223> Y stands for C/T, M stands for A/C，W stands for A/T.

<400> 5

gaygaymgwg atcayttygg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (5)..(17)

<223> R stands for A/G.

<400> 6

gaatrttggc catggtrtcc at 22

Claims (6)

1.一种木质素降解菌，命名为灰短梗蠕孢菌(Trichocladium griseum)，株号P8，保藏号为CCTCC NO：M 2020112。

2.如权利要求1所述木质素降解菌在降解农作物秸秆中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，农作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆。

4.一种用于农作物秸秆降解的菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的木质素降解菌。

5.一种农作物秸秆降解方法，其特征在于，向农作物秸秆中加入如权利要求4所述的菌剂。

6.如权利要求5所述的农作物秸秆降解方法，其特征在于，农作物秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆。

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