CN104894025B - 一种链霉菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力的链霉菌菌株及其在秸秆腐熟方面的应用。该链霉菌菌株(Streptomyces sp.)名称为纤维素分解菌F2，属链霉菌属，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10358。本发明提供的链霉菌菌种，经35h能将滤纸完全崩解，最大产纤维素酶活力为14.77U/mL，48h后就能在水稻和玉米秸秆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于多种秸秆的腐化处理。秸秆腐解后的种子发芽试验表明经腐熟剂处理后，促进了种子发芽率，对下茬作物的生长不会产生影响。

Description

一种链霉菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力、促进植物种子萌发的链霉菌菌株及其在秸秆腐熟方面的应用。
背景技术
我国是传统的农业大国，具有相当丰富的农作物秸秆资源，年产秸秆量在8亿吨以上，其中水稻秸秆的产量为1.5万吨，江苏、浙江、安徽、江西、湖北、湖南、广东、广西和四川9省是水稻秸秆的集中分布区。随着这些年我国农业的高速发展，我国水稻秸秆的产量始终保持上升趋势，我国会有越来越多的水稻秸秆面临被弃置、浪费甚至造成污染的现状。目前，我国水稻秸秆的利用主要是在能源、肥料、饲料和工业原料等领域。作为能源物质秸秆的直接燃烧效率比较低，只有12％～15％，秸秆在燃烧过程中会产生CO2、CH4、NO2、SO2等温室气体和大量烟尘，造成严重的大气污染。在饲料应用上，水稻秸秆含有高达24.0％的粗纤维，仅有3.8％的蛋白含量，所以适口性较差，营养价值也不高，需经复杂的后续处理。作为工业原材料，因为水稻秸秆含有大量的纤维素，因此可以处理后作为工业原料利用，主要包括造纸、建材、编织等利用方式，但因为秸秆密度较小，造成长途运输成本较高，因此制约了其在工业上的应用。而对秸秆最方便的处理方式是直接还田，既能简单快速的处理秸秆，又能提高土壤的有机质含量，改善土壤的理化性质，该方法的核心技术是利用微生物对秸秆进行直接腐熟处理。秸秆还田通常分为两种方式，一是直接还田，主要形式是：高茬还田、整秆覆盖还田和粉碎还田；二是间接还田，主要形式是：堆沤还田、沼肥还田、生物腐解还田等。
在秸秆中，纤维素、半纤维素和木质纤维素交互在一起，木质纤维素包围着纤维素，而木质纤维素又是非水溶性的、分子量非常巨大的、具有芳香环的三维聚合物，它对纤维素和半纤维素起保护作用。因此，木质纤维素难以被分解掉。在秸秆降解的过程中，首先是细菌吸附在外层的木质纤维素上，释放的胞外酶逐渐将木质纤维素的结构破坏，使微生物能够进入纤维素内部，从而逐渐降解纤维素。目前为止，已发现的能够降解纤维素的细菌种类有很多，主要有：红球菌属、芽孢杆菌属、生孢食纤维菌属、节杆菌属、假单胞菌属、纤维单胞菌属等。在纤维素的降解过程中，真菌也起着重要作用，按照温度来分，有中温真菌和高温真菌。在降解纤维素的过程中，真菌不但可以分泌胞外酶，从分子结构上破坏纤维素的稳定性，而且真菌菌丝穿插在纤维素之间，从宏观角度上拉扯纤维素，为酶发挥作用提供空间。在降解纤维素的真菌中，木霉属、担子菌属都被认为是降解纤维素的高效微生物。与降解纤维素的细菌和霉菌相比，目前对于放线菌降解纤维素的研究还相对较少。降解纤维素的放线菌主要有：诺卡氏菌属、链霉菌属，高温放线菌属等。虽然细菌的生长速度较快，但是细菌产生的纤维素酶大多是胞内酶且产量较低；而霉菌的降产纤维素酶的能力虽然更强，但是大多数霉菌对植物都有致病的效应，因此细菌和霉菌都很少应用于秸秆腐熟剂的生产。放线菌繁殖速度慢，对纤维素的降解能力也比不上真菌，但是放线菌的抗逆性更强，在低温和高温的环境中，放线菌在纤维素降解方面起重要作用。因此，寻找一种能高效降解纤维素、适应还田后土壤的链霉菌是目前采用微生物方式高效降解利用秸秆的关键之一。
发明内容
本发明提供一种新型链霉菌，属放射菌目一科，以解决现有技术中秸秆腐熟过程缓慢、效率不高，而现有秸秆腐熟剂应用受限等问题。
1.本发明提供一种链霉菌菌株，所述链霉菌菌株(Streptomyces sp.)的名称为纤维素分解菌F2，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10358。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
该菌株呈现典型的放线菌菌落形态，菌落为密毡状，产生白色的孢子，基内菌丝为白色。
2.本发明还提供上述1提供的链霉菌菌株在秸秆腐熟中的应用。
3.本发明还提供一种秸秆腐熟剂，该秸秆腐熟剂包括上述1提供的链霉菌菌株。
4.上述3提供的秸秆腐熟剂，该腐熟剂成品中链霉菌孢子总浓度为1×108CFU/g以上。
5.本发明还提供上述1提供的链霉菌菌株在促进植物种子萌发方面的应用。
6.本发明还提供秸秆腐熟剂在促进植物种子萌发方面的应用。
有益效果：
1.本研究从不同样本中分离、筛选到高效降解秸秆纤维素的优势链霉菌菌种，经过35h能将滤纸完全崩解，最大产纤维素酶的活力为14.77U/mL，48h后就能在水稻和玉米秸秆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于多种秸秆的腐化处理过程中。再通过水稻秸秆的好氧堆肥中试研究，为秸秆的综合利用提供理论参考，开发出能够应用于农业生产的微生物秸秆腐熟菌剂。
2.通过筛选获得的纤维素分解菌F2，以该菌株制成的秸秆腐熟剂，经过试验，秸秆10天便开始变软、腐烂，此时分解率已超过20％，经过25天，秸秆已经完全降解，说明制成的秸秆腐熟剂缩短了堆肥发酵周期，提高腐解速率。应用于秸秆腐解、还田过程，既可以增加土壤中的有机质含量，培肥地力，改善土壤理化性质，可减少化肥和农药的使用量，降低农业面源污染，又减少了因秸秆焚烧引起的空气污染等环境问题。
3.秸秆腐解后的种子发芽试验表明经腐熟剂处理后，促进了种子发芽率，对下茬作物的生长不会产生影响。
附图说明
图1本发明提供的纤维素分解菌F2的菌落形态
图2菌株F2在CMC-Na刚果红平板上的透明圈
图3菌株F2对滤纸的崩解情况
图4培养时间对菌株F2F2的酶活性影响
图510d后不同菌株对水稻秸秆的降解率
图6菌株F2对玉米秸秆堆肥效果的研究
图7菌株F216SrDNA测序和聚类结果
图8菌株F2分解水稻秸秆的中试效果
图9菌株F2堆肥分解水稻秸秆堆温的变化
图10菌株F2对植物种子发芽的影响
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
本研究采用以下3种指标作为堆肥的评价标准，即秸秆颜色、堆肥温度、种子发芽率。
①颜色：颜色可以用来判断堆肥腐熟的指标。一般认为秸秆颜色达到深褐色或灰黑色为宜，并有光泽。
②温度：在较短的时间内堆肥温度升到50℃以上，进入高温阶段，并且高温持续7-14天。
③种子发芽率：发芽率＝[(浸提液中的种子发芽率×种子根长)]/[(蒸馏水中的种子发芽率×种子根长)]×100％。该方法可以判断经微生物处理后，秸秆腐熟物对下茬作物生长的影响，该结果有助于了解秸秆的腐熟状态，在秸秆还田的实际应用中具有重要的指导意义。
实施例1
纤维素分解菌F2的筛选与鉴定
以下试验用培养基在制备过程中均在121℃灭菌20min。
1)以蒸馏水浸泡水稻秸秆、枯枝败叶，过夜，去除可溶性有机物，冲洗数次，烘干待用。将水稻秸秆、枯枝败叶剪成2cm左右，作为接下来富集培养基的唯一碳源。
配制富集培养基【赫奇逊(Hutchinson)秸秆培养基】：磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g，氯化钠(NaCl)0.1g，氯化铁(FeCl3·6H2O)0.01g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.3g，硝酸钠(NaNO3)2.5g，氯化钙(CaCl2·6H2O)0.1g，蒸馏水1000mL。
称取从不同地域收集的腐败树枝和秸秆样品10g，转移至装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，180rpm摇床振荡20min，静置，用移液器吸取1mL悬液转移至装有富集培养基的三角瓶中，放于55℃水浴锅中振荡培养，待秸秆松散变软后，转接到新鲜的富集培养基中，接种量为5％(质量百分比)，如此转接数代，淘汰不能在培养基中生长的菌群，即没有分解纤维素能力的菌群。
2)配制分离培养基(CMC-Na刚果固体红培养基)：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，硝酸钾(KNO3)1.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钠(NaCl)1.5g，刚果红0.2g，琼脂13g，蒸馏水1000mL。
将上述转接数代后的培养基采用稀释涂布平板法在CMC-Na刚果红固体培养基上分离，置于55℃恒温培养箱中培养获得单菌落，通过目测，选择菌落较大(较大是一个相对概念，比较范围是整个培养基中生长的菌落)、透明圈较大的菌落(如图2所示)，以此为标准选择在以纤维素为唯一碳源的条件下生长较好的菌株，从而得到分解纤维素能力较强的菌株。在CMC-Na刚果红固体培养基上反复划线纯化(如图1所示)。在CMC-Na平板用0.02％的刚果红溶液染色20min，然后用1mol/L的NaCl脱色20min，观察并记录透明圈的直径(D，cm)和菌落直径(d，cm)，计算其比值H，即H＝D/d。由于H值越大，表示该菌株分解纤维素的能力越强，因此，选择H值大的透明圈所对应的菌株F2。
根据伯杰氏细菌鉴定手册，首先通过形态观察和生理生化试验确定该菌株为链霉菌，随后采用16SrDNA聚类分析的方法，测定分离菌株的16SrDNA序列，并从NCBI上下载已经报道的链霉菌的16SrDNA序列，经过软件分析比较得出该菌株16SrDNA的系统发育树，结果如图7，该表显示菌株F2生理生化结果与链霉菌相符，属链霉菌属。
3)制备滤纸条崩解培养基：配方同赫奇逊培养基。用1cm×2cm滤纸条作为唯一碳源，滤纸条的处理法：用1％乙酸浸泡一昼夜，用碘液检查确无淀粉后，再用2％苏打水(碳酸氢钠)冲洗至中性，烘干待用。
将分离培养基中得到的菌株转接到滤纸条崩解培养基中以验证其对滤纸的分解情况，同时，以未添加菌株的培养基作为对照组CK(如图3)。从图中结果可以看出处理组F2在培养后能将滤纸降解为粉末状，而对照组中滤纸仍保持原来的状态。
4)制备液体种子培养基【高氏(Gause)I号培养基】：可溶性淀粉20.0g，硝酸钾(KNO3)1.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01g，氯化钠(NaCl)0.5g，蒸馏水1000mL。
将上述分离培养基中得到的菌株(经过滤纸条崩解培养基验证过)的菌株接种于液体种子培养基37℃，180rpm振荡培养72h，至形成大量致密的菌丝球，即F2种子培养液。
5)制备液体产酶培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，蛋白胨(Peptone)2.0g，酵母提取物(Yeast extract)2.0g，蒸馏水1000mL。
将F2种子培养液3mL接种于液体产酶培养基，37℃，180rpm培养，每隔24h取样。发酵液8000rpm离心5min，上清液即为粗酶液，取1mL上清液于试管中(空白用1ml蒸馏水代替)，加入1.5mlDNS试剂摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入冷水冷却，取100μL加入到900μL蒸馏水中，稀释摇匀，然后在540nm波长处测定吸光度。对照标准曲线后测量酶活力。如图4所示，随着时间的延长，酶活性不断升高，达到最高点后开始下降，在14d左右达到最大值14.77U/mL，这与在刚果红平板上的结果相符。其中，酶活力单位按照国际单位规定定义为在1mL体系中，在1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U/mL)。
实施例2
纤维素分解菌F2的堆肥效果试验
1)将F2菌株的孢子制成孢子悬液(浓度为1.5×109CFU/mL)，并将孢子悬液按1％的接种量接种到水稻秸杆上，观察各处理对秸秆底物的降解情况。结果发现，接种48h后，水稻秸杆上开始出现菌丝，至72h时已长出大量的菌丝，而此时对照处理CK(加等量的无菌水处理)无菌丝出现。随后，秸秆表面产生大量的孢子。10d后，加孢子悬液处理的水稻秸杆变软、腐烂，同时，根据处理前后秸秆干重的变化，测定秸秆的降解率，如图5所示，经过处理的秸秆降解率超过20％，而对照组CK没有降解。
并对玉米秸秆进行相同处理，经过25d的培养观察，秸秆已经完全降解，变成黑褐色或黑色，并有光泽，没有氨味和酸臭味，并带有潮湿泥土的气味，手握质地松软，纤维失去弹性，轻拉即断，如图6所示。该结果显示纤维分解菌F2对不同的秸秆均具有良好的分解效果。
2)在实验室小试之后，将试验放大进行水稻秸秆腐解的中试试验，结果显示在第10天时，水稻秸秆已经明显出现腐解、变色迹象，第30天时水稻秸秆完全腐解，如图8所示。对堆肥温度进行持续检测，发现接菌处理从第3天开始即达到最大发酵温度60℃，持续到第30天秸秆完全腐解后堆温开始降低，而对照处理的秸秆一直在中温范围发酵，堆温不超过40℃。结果如图9所示。
3)种子发芽率(GI)的测定：将新鲜的接种过F2菌株和未接种菌株的二种处理的堆肥分别用无菌去离子水按肥水比1/10振荡30min，28℃浸提过夜，然后用滤纸过滤，吸取5mL滤液加入经灭菌处理的铺有滤纸的培养皿内，每个培养皿均匀点播20粒饱满的萝卜种子，放置在22℃的培养箱中培养，72h后测种子的发芽率，每个处理重复3次，以蒸馏水为对照，计算公式为：发芽率＝[(浸提液中的种子发芽率×种子根长)]/[(蒸馏水中的种子发芽率×种子根长)]×100％。结果如图10所示，在整个堆肥过程中，种子发芽率随着时间的推移不断增大，其中，接种菌剂处理增长的更快，二者之间差异显著(P＜0.05)。这表明在堆料中对种子发芽有促进作用的物质在不断增多。堆肥起始阶段，接种菌剂处理和对照组的种子发芽率都比较低，只有10％左右，可能由于堆料中存在的毒性物质对种子的发芽生长产生影响，抑制了其生长；高温阶段，接种菌剂处理的种子发芽率最大达到55％，说明此时的抑制性物质已经减少了很多，而CK的最大值只有28％。接种菌剂处理从第30d开始种子发芽率就稳定在一定的范围内，在堆肥结束时基本维持在86％以上，说明此时的抑制性物质已经降到最低值，从侧面体现了高温腐解对秸秆中有害物质的降解同样有效果，提高了下茬作物的生长状况，可以应用于农业生产而不会对农作物造成伤害，而CK的只有59.24％，不能用于农业生产。该结果显示在水稻还田中，如果不接种腐熟剂对秸秆进行处理，会对下茬作物的生长产生影响，在秸秆直接还田中外加高效纤维分解菌株是必要的。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种促进植物种子萌发的链霉菌菌株，其特征在于：所述链霉菌菌株（Streptomycessp.）的名称为纤维素分解菌F2，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10358。
2.权利要求1所述的链霉菌菌株在促进植物种子萌发方面的应用。
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