CN104611270A - 一种链霉菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力的链霉菌菌株及其在秸秆腐熟方面的应用。该链霉菌菌株（Streptomyces sp.）名称为纤维素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10359。本发明提供的链霉菌菌种，经过48h后就能在秸秆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于秸秆的腐化处理过程中。以该菌株孢子制成的秸秆腐熟剂，经过试验，秸秆10天便开始变软、腐烂，此时分解率已超过20%，经过25天，秸秆已经完全降解，说明制成的秸秆腐熟剂缩短了堆肥发酵周期，提高腐解速率。

Description

一种链霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有纤维素降解能力的链霉菌菌株及其在秸秆腐熟方面的应用。

背景技术

秸秆具有资源丰富，来源广泛，资源化利用率低，研究开发潜力大等特点，因而其资源化问题成为科研热点之一。我国是农业大国，秸秆资源丰富，年产秸秆量在8亿吨以上，虽然数量巨大，但是利用率低，全国每年约有60%以上的秸秆被焚烧或是废弃，这样不仅影响交通、诱发火灾、严重污染环境、破坏生态平衡，而且又浪费了宝贵的生物资源。微生物是自然界物质分解者，在维持生态平衡和物质转化方面发挥着其他生物无法取代的作用。环境中的微生物具有分布广泛、种类繁多、数量巨大、功能多样等特点，应用微生物发酵的方法对秸秆进行腐解处理是其他理化方法所不能替代的，前景非常广阔。由于秸秆主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成，易被利用的水溶性碳水化合物含量较低，化学结构复杂，具有很强的抗分解能力。又因为多数作物秸秆的表面有一层蜡质层，使微生物对其降解的难度增大。

降解纤维素的微生物有：①细菌。虽然种类远不如真菌多，但在土壤等环境中分布的数量却很多，如：芽孢杆菌属(Bacillus)、生孢食纤维菌属（Sporacytop hga）、假单胞菌属(Pseudomonas)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)等，最适生长温度大都在30~40℃之间。同时细菌降解木质素的能力比真菌低得多。②真菌。真菌对木质纤维素的分解起着重要作用。在中温条件下，主要有木霉属（Trichode rma）、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，其中木霉属真菌的纤维素酶应用最多，能加速秸秆分解进程，缩短堆肥时间。③放线菌。目前秸杆分解微生物的大部分研究集中在真菌和细菌，关于放线菌的研究较少。主要有：诺卡氏菌属(Nocardia)、链霉菌属(Streptomyces)，高温放线菌属(Thermoactin omyces)等。由于细菌产纤维素酶量低且多为胞内酶，因此很少用来生产纤维素酶，而且，细菌中除芽孢杆菌外其它的种类由于保存期限的问题以及相关胞外酶的诱导表达量比较低，在实际应用中受到限制。涉及纤维素降解的真菌很多，在环境中的中温型纤维素降解菌中大多数是真菌，但是很多都是植物病原菌且传染性强，很难将其开发为秸秆降解剂，这就导致细菌和真菌在纤维素降解的进一步应用研究中比较困难。

原核生物放线菌比真菌更具有抗逆性，在高温阶段木质素和纤维素的分解过程中，放线菌起着重要的作用，并且放线菌产纤维素酶活性较高，结构简单，便于基因改造和遗传分析，但是，放线菌繁殖慢且产酶能力没有真菌强。因此，将放射菌应用于秸秆腐熟技术上，最关键的问题是高效接种菌剂的筛选，从而促进秸秆腐熟的过程，提高秸秆腐熟的效率。

发明内容

本发明提供一种新型链霉菌，属放射菌目一科，以解决现有技术中秸秆腐熟过程缓慢、效率不高，而现有秸秆腐熟剂应用受限等问题。

本发明提供一种链霉菌菌株，所述链霉菌菌株（Streptomyces sp.）的名称为纤维素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10359。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株呈现典型的放线菌菌落形态，菌落为密毡状，产生灰色的孢子，基内菌丝为白色。

2.上述1提供的链霉菌菌株在秸秆腐熟中的应用。

3.本发明还提供一种秸秆腐熟剂，该秸秆腐熟剂包括上述1提供的链霉菌孢子。

4.上述3提供的秸秆腐熟剂，其中，腐熟剂成品中链霉菌孢子总浓度为 2×10⁹CFU/mL。

5.本发明还提供一种秸秆腐熟效果测试方法，该方法将秸秆的一端固定，另一端连接弹簧秤，用力拉弹簧秤并记录秸秆断裂时的重量即拉力；同一时期秸秆的拉力越小，即越易被拉断，说明秸秆腐熟程度越高。

有益效果：

1.本研究从不同样本中分离、筛选到高效降解秸秆纤维素的优势链霉菌菌种，经过48h后就能在秸秆上生长，72h长出大量菌丝，并产生大量孢子。说明本发明提供的链霉菌活力高，适应性强，可广泛用于秸秆的腐化处理过程中。再通过水稻秸秆的好氧堆肥中试研究，为秸秆的综合利用提供理论参考，开发出能够应用于农业生产的微生物秸秆腐熟菌剂。

2.通过筛选获得的纤维素分解菌F1，经过驯化成高效稳定的菌株并制成秸秆腐熟剂，经过试验，接种分解菌F1的秸秆10天便开始变软、腐烂，此时分解率便已经超过20%，经过25天，秸秆已经完全降解，说明制成的秸秆腐熟剂缩短了堆肥发酵周期，提高腐解速率。应用于秸秆腐解、还田过程，既可以增加土壤中的有机质含量，培肥地力，改善土壤结构，有利于实现农业的可持续发展，同时减少了化肥和农药的使用量，降低了农业面源污染，提高作物产量及品质，又减少了因秸秆焚烧引起的空气污染等环境问题。

3.本发明创造性地提出以秸秆剪切拉力作为秸秆腐熟效果测定的一个指标，方法简单易测，适合于农业生产应用，值得推广。

附图说明

图1本发明提供的纤维素分解菌F1的菌落形态

图2菌株F1在CMC-Na刚果红平板上的透明圈

图3菌株对滤纸的崩解情况

图4培养时间对F1的酶活性影响

图5 10d后不同菌株对水稻秸秆的降解率

图6纤维素降解菌对水稻秸秆堆肥效果的研究

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

本研究采用以下4种指标作为堆肥的评价标准，即秸秆颜色、秸秆剪切拉力。

①颜色：颜色可以用来判断堆肥腐熟的指标。一般认为秸秆颜色达到深褐色或灰黑色为宜，并有光泽。

②秸秆剪切拉力：是最近新提出的测定秸秆腐熟的方法，以前很少有学者用这个指标作为评价标准，所以该方法的使用增加了本文的创新性。秸秆剪切拉力即秸秆拉力，为秸秆最大承受力，测定方法是将秸秆的一端固定，另一端连接弹簧秤，用力拉弹簧秤并记录秸秆断裂时的重量。同一时期秸秆的拉力越小，即越易被拉断，说明秸秆腐熟程度越高。

实施例1

纤维素分解菌F1的筛选与鉴定

以下试验用培养基在制备过程中均在121℃灭菌20 min。

1）从不同地域收集的腐败树枝和秸秆样品，以蒸馏水浸泡水稻秸秆、枯枝败叶，过夜，去除可溶性有机物，冲洗数次，烘干待用。将水稻秸秆、枯枝败叶剪成2cm左右样品，作为接下来富集培养基的唯一碳源。

配制富集培养基【赫奇逊（Hutchinson）秸秆培养基】：磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0 g，氯化钠（NaCl）0.1 g，氯化铁（FeCl₃·6H₂O）0.01 g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.3 g，硝酸钠（NaNO₃）2.5 g，氯化钙（CaCl₂·6H₂O）0.1 g，蒸馏水1000 mL。

称取2cm左右样品10 g，转移至装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，180 rpm摇床振荡20 min，静置，用移液器吸取1 mL悬液转移至装有富集培养基的三角瓶中，放于55℃水浴锅中振荡培养，待秸秆松散变软后，转接到新鲜的上述培养基中，接种量为质量分数5%，如此转接数代，淘汰不能在培养基中生长的菌群，即没有分解纤维素能力的菌群。

    2）配制分离培养基（CMC-Na刚果固体红培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g，硝酸钾（KNO₃）1.0 g，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）0.5 g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.5 g，氯化钠（NaCl）1.5 g，刚果红0.2 g，琼脂13 g，蒸馏水1000 mL。

将上述转接数代后的培养基采用稀释涂布平板法在CMC-Na刚果红固体培养基上分离，置于55℃恒温培养箱中培养获得单菌落，通过目测，选择菌落较大（较大是一个相对概念，比较范围是整个培养基中生长的菌落）、透明圈较大的菌落（如图2所示），以此为标准选择在以纤维素为唯一碳源的条件下生长较好的菌株，从而得到分解纤维素能力较强的菌株。在CMC-Na刚果红固体培养基上反复划线纯化。在CMC-Na平板用0.02%的刚果红溶液染色20 min，然后用1 mol/L的NaCl脱色20 min，观察并记录透明圈的直径（D，cm）和菌落直径（d，cm），计算其比值H，即H=D/d。由于H值越大，表示该菌株分解纤维素的能力越强，因此，选择H值大的透明圈所对应的菌株F1。按照刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小即通过纤维素酶定性实验初步确定其产纤维素酶活性。

采用伯杰氏细菌手册上的方法，测定分离菌株的生化特性，结果如表1

表1菌株F1的生理生化特性

该表显示菌株F1生理生化结果与链霉菌相符，属链霉菌属。

3）制备滤纸条崩解培养基：配方同赫奇逊培养基。用1 cm×2 cm滤纸条作为唯一碳源，滤纸条的处理法：用1%乙酸浸泡一昼夜，用碘液检查确无淀粉后，再用2%苏打水(碳酸氢钠)冲洗至中性，烘干待用。

将分离培养基中得到的菌株转接到滤纸条崩解培养基中以验证其对滤纸的分解情况，同时，以未添加菌株的培养基作为对照组CK（如图3）。从图中结果可以看出处理组F1在培养后能将滤纸降解为粉末状，而对照组中滤纸仍保持原来的状态。

4）制备液体种子培养基【高氏（Gause）Ⅰ号培养基】：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾（KNO₃）1.0 g，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）0.5 g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.5 g，硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）0.01 g，氯化钠（NaCl）0.5 g，蒸馏水1000 mL。    

将上述分离培养基中得到的菌株（经过滤纸条崩解培养基验证过）的菌株接种于液体种子培养基37℃ ，180 rpm振荡培养72 h，至形成大量致密的菌丝球，即F1种子培养液。

5）制备液体产酶培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g，蛋白胨（Peptone）2.0 g，酵母提取物（Yeast extract）2.0 g，蒸馏水1000 mL。

将F1种子培养液3mL接种于液体产酶培养基，37℃，180 rpm培养，每隔24 h取样。发酵液8000 rpm离心5 min，上清液即为粗酶液，取1 mL上清液于试管中（空白用1 ml蒸馏水代替），加入1.5 ml DNS试剂摇匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即放入冷水冷却，取100 μL加入到900 μL蒸馏水中，稀释摇匀，然后在540 nm波长处测定吸光度。对照标准曲线后测量酶活力。如图4所示，随着时间的延长，酶活性不断升高，达到最高点后开始下降，在14 d左右达到最大值11.64 U/mL，这与在刚果红平板上的结果相符。其中，酶活力单位按照国际单位规定定义为在1 mL体系中，在1 min内催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。

实施例2

纤维素分解菌F1的堆肥效果试验  

将F1菌株的孢子制成浓度为2×10⁹CFU/mL的孢子悬液，并将孢子悬液按体积质量比为1%的接种量接种到水稻秸杆上，观察各处理对秸秆底物的降解情况。结果发现，接种48 h后，水稻秸杆上开始出现菌丝，至72 h时已长出大量的菌丝，而此时对照处理CK（加等量的无菌水处理）无菌丝出现。随后，秸秆表面产生大量的孢子。10 d后，加孢子悬液处理的水稻秸杆变软、腐烂，同时，根据处理前后秸秆干重的变化，测定秸秆的降解率，如图5所示，经过处理的秸秆降解率超过20%，而对照组CK没有降解。经过25 d的培养观察，秸秆已经完全降解，变成黑褐色或黑色，并有光泽，没有氨味和酸臭味，并带有潮湿泥土的气味，手握质地松软，纤维失去弹性，轻拉即断，如图6所示。

表2 堆肥过程中水稻秸秆拉力变化

测定堆肥过程中水稻秸秆拉力变化，用弹簧秤测定上述加入F1菌株孢子悬液的秸秆，试验结果如表2所示，可以发现，试验开始前各处理的秸秆拉力一致，10 d后，接种菌剂处理的秸秆拉力比对照减少1200 g，减少幅度为14.8%；15 d后，接种菌剂处理的秸秆拉力比对照减少1620 g,减少幅度为20.7%；20 d后，接种菌剂处理的秸秆拉力比对照减少2440 g，减少幅度为32.36%；25 d后，接种菌剂处理的秸秆拉力比对照减少3200 g，减少幅度为45.71%；30 d后，接种菌剂处理的秸秆拉力比对照减少3700 g，减少幅度为59.68%。结果表明，与对照相比，接种菌剂能加快水稻秸秆的腐熟。

Claims (5)

1.一种链霉菌菌株，其特征在于：所述链霉菌菌株（Streptomyces sp.）的名称为纤维素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10359。

2.权利要求1所述的链霉菌菌株在秸秆腐熟中的应用。

3.一种秸秆腐熟剂，其特征在于：该秸秆腐熟剂包括权利要求1所述的链霉菌孢子。

4.权利要求3所述的秸秆腐熟剂，其特征在于：腐熟剂成品中链霉菌孢子总浓度为 2×10⁹CFU/mL。

5.一种秸秆腐熟效果测试方法，其特征在于：将秸秆的一端固定，另一端连接弹簧秤，用力拉弹簧秤并记录秸秆断裂时的重量即拉力；同一时期秸秆的拉力越小，即越易被拉断，说明秸秆腐熟程度越高。