CN103468618B - 具有解磷能力的纤维素降解细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种生物环保技术领域的具有解磷能力的纤维素降解细菌及其应用，该纤维素降解细菌JSD-12为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为CGMCC No.7923，保藏日期为2013年7月15日。该细菌不仅对纤维素具有较强的降解能力，同时还对秸秆中半纤维素和果胶组分有一定的分解能力；该细菌繁殖迅速并且可耐受60℃以上的高温，可制成高温堆肥的添加菌剂；此外该菌还具有解磷能力，可供生产菌肥。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物环保技术领域的方法，具体是一株具有解磷能力的纤维素降解细菌及其应用。
背景技术
纤维素是植物光合作用的主要产物，是自然界储量最丰富的一类可再生资源，全世界每年作物秸秆产量为29亿吨左右，而我国每年秸秆产量就可达7亿吨以上。纤维素在农作物中的含量很高，可达40%-50%。由于纤维素是一种含有大量高能氢键的高分子聚合物，具有难降解、难水解的特点，因此其利用率很低。据统计，约有89%的秸秆未得到有效利用，绝大多数被弃置甚至燃烧，不仅造成资源浪费而且污染环境。
在当今能源严重不足的背景下，如何更加有效的开发和利用纤维素资源已经成为当今世界的热门课题之一。纤维素常见的处理方法有物理、化学和生物法。物理法需大量耗能；化学法需酸碱浸泡处理，易造成二次污染；生物法主要利用微生物代谢过程中分泌纤维素酶，加快纤维素的降解。利用微生物降解纤维素现已成为一种高效、经济、安全、无污染的方法，得到了社会的广泛关注。
细菌具有分布广、数量多、比表面积大、代谢繁殖速度快、适应力强等特点，因此细菌一直是纤维素生物降解领域研究的重点。综上，筛选高效纤维素降解菌，特别是细菌对纤维素资源化利用就显得尤为重要。
经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103013887，公开日2013-04-03，公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KMXU56，其保藏号为CGMCC No.6595。含有短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，经菌种活化、发酵种子液制备、接种剂的制备步骤得到。该技术的菌株从水葫芦渣在自然发酵条件下分离筛选出来，具有较好的分解纤维素能力，能够在中高温范围（40℃～70℃）条件下生存；经发酵培养和扩繁后制得的接种剂，加入到水葫芦渣混合物中，在自然条件下进行堆肥发酵，可将水葫芦渣转化为生物有机肥。但该技术无法针对秸秆中果胶和半纤维素组分进行分解；此外，该杆菌对于难溶性的无机磷盐也较难降解利用。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种具有解磷能力的纤维素降解细菌及其应用，该细菌不仅对纤维素具有较强的降解能力，同时还对秸秆中半纤维素和果胶组分有一定的分解能力；同时该细菌繁殖迅速并且可耐受60℃以上的高温，可制成高温堆肥的添加菌剂；此外还具有解磷能力，可供生产菌肥。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一株纤维素降解细菌JSD-12为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为CGMCC No.7923。
所述的纤维素降解细菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2013年7月15日，保藏编号为CGMCC No.7923；分类种名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
本发明涉及一种纤维素降解细菌的应用，具体为：将所述纤维素降解细菌制成高温堆肥菌剂进而制备成水稻秸秆生物有机肥。
所述的高温堆肥菌剂通过以下方式制备：将纤维素降解细菌接种于LB液体培养基中，48h后取样测定菌液的浓度为2.0×108cfu/mL后，停止发酵；每升菌液与0.4-0.6kg稻草秸秆混匀后制成。
所述的水稻秸秆堆肥通过以下方式制备得到：将芦笋秸秆经粉碎设备粉碎至5-10cm，形成秸秆段，按秸秆重量的0.5-1.0%接入堆肥菌剂，调节堆体水含量在65%；每天测定堆体温度，刚开始堆体温度会迅速上升到70℃，并维持1-2天，当温度不再上升且逐渐下降到45℃以下时，代表完成第一次发酵，然后进行翻堆，即7-8天翻堆1次，共翻堆3次；待第三次翻堆完成后，即制得秸秆生物有机肥。
所述的纤维素降解细菌通过以下方式进行保藏：采用-80℃低温冷冻保藏法，使微生物处于低温，以降低甚至停止其代谢作用从而达到保藏菌种的目的。
技术效果
与现有技术相比，本发明优点包括：
1、本发明纤维素降解细菌不仅对纤维素具有较强的降解能力，同时还对秸秆中半纤维素和果胶组分有一定的分解能力；
2、本发明纤维素降解细菌繁殖迅速并且可耐受60℃以上的高温，可制成高温堆肥的添加菌剂；
3、本发明纤维素降解细菌还具有解磷能力，可供生产菌肥。
附图说明
图1CMC-刚果红平板产生的水解圈。
图2LB培养基上的菌落形态图。
图3革兰氏染色图。
图4最适生长曲线图。
图516S rDNA电泳图。
图6滤纸降解能力测试。
图7菌株透明溶磷圈。
图8单周期堆肥温度曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
菌株的分离、纯化和保藏
取上海市闵行区浦江镇交大浦江基地水稻田的腐烂秸秆和土壤为样品。不同样本磨碎混均后取10g，置于100mL富集养基中，30℃、150rpm恒温培养。每隔5天，以10%接种量接入另一富集养基中，如此反复驯化4次。富集培养基采用以CMC-Na为唯一碳源的培养基。
取100μL富集液涂布于CMC-刚果红培养基平板，之后于32℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，3天后观察。结果平板出现透明水解圈，如图1。挑取少量菌体，在LB固体培养基上划线，直至获得单菌落，如图2所示，再将获得的单菌落，在以CMC-Na为唯一碳源的无机盐固体培养基上连续传6代，待菌落形态稳定后，即得纯培养，菌体形态如图3。
实施例2
菌种鉴定
结合细菌的Biolog GP2和16S rDNA V3(图4)区域序列比对，鉴定该菌芽孢杆菌，分类种名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
命名该短小芽孢杆菌为JSD-12，已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7923。
实施例3
最适生长曲线的测定
经测定，确定该菌最适培养基为LB液体培养基，调节pH为7.0，将活化细菌接种到LB液体培养基，接种量为培养基体积的1.0%，于32℃、150rpm摇床上培养，在培养时间为1、2、4、6、8、10、12、14、18、22、26、30、34、38小时，分别测定菌液OD600值，绘制曲线如图5所示。
所述的LB液体培养基的组分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
实施例4
产纤维素酶活力的测定
取1.5mL0.05mol/L醋酸(HAc)缓冲液配制的0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)于25mL容量瓶中，加入0.5mL离心发酵液50℃反应30min；将剪好的滤纸(1cm×6cm)卷成小卷，放进25mL容量瓶内，加入1.5mL HAc-NaAc缓冲液(pH=4.8)，再加入0.5mL粗酶液，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中，50℃保温1h。
在每个容量瓶内加1.5mL DNS试剂，沸水浴5min，流动水立即冷却，以葡萄糖标准曲线的空白为对照，测定其OD520值；在上述条件下，均定义每分钟1mL粗酶液催化纤维素水解生成1μg葡萄糖为一个酶活力单位(U)。
经测定，该芽孢杆菌在初始接种体积为1.5%，初始培养液pH为6.5，发酵温度为37℃，在发酵的第3天，产CMCase和FPase活性最高，分别为50.18U/mL和26.19U/mL。
实施例5
对滤纸降解测试
把菌接种到滤纸崩解培养基中。滤纸崩解培养基成分为：牛肉膏1.5g，蛋白胨1.0g，CaCO32.0g，H2O1L。每个三角瓶装80mL，并放入准确称取为0.50g的圆形滤纸1片。32℃、180r/min静止培养5d后观察滤纸崩解情况，如图6所示，滤纸已完全崩解。将瓶底沉淀离心后烘干进行称重，沉淀质量为0.16g，滤纸失重率为68%。
实施例6
溶磷能力测试
配制磷酸钙培养基，其成分如下：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.2g，KCl0.2g，MgSO4·7H2O0.002g，MnSO4·H2O0.002g，FeSO4·7H2O0.5g，酵母提取物5g，Ca3(PO4)22g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
将菌接种于该培养基上，4d后观察平板是否产生透明溶磷圈，观测结果记录如图7。经测定，水解圈直径(D)与菌落直径(d)平均比值D/d为4.8。一般而言，溶磷能力大小与D/d的值成正比。
溶磷测试结果表明，该芽孢杆菌可以利用难溶无机盐。该菌可将土壤中难溶的无机磷盐转化为易被植物吸收的可溶性磷肥。这便减少了化肥的投入，不仅降低了成本，而且避免了大量化肥投入带来的土壤板结和次生盐渍化，具有巨大的环境效益。
实施例7
高温堆肥菌剂的制备
将菌接种于LB液体培养基中，48h后取样测定菌液的浓度约为2.0×108cfu/mL后，停止发酵。每升菌液与0.4-0.6kg稻草秸秆混匀，便制备成高温堆肥菌剂。
实施例8
高温堆肥菌剂在水稻秸秆堆肥中的应用
将芦笋秸秆经粉碎设备粉碎至5-10cm，形成秸秆段，按秸秆重量的0.5-1.0%接入堆肥菌剂，调节堆体水含量在65%左右。每天测定堆体温度，刚开始堆体温度会迅速上升到70℃，并维持1-2天，当温度不再上升并逐渐下降到45℃以下时，代表完成第一次发酵(如图8)，进行翻堆。约7-8天翻堆1次，共翻堆3次。待第三次翻堆完成，即制得秸秆生物有机肥。
Claims (4)
1.一种纤维素降解细菌JSD-12，其特征在于，该纤维素降解细菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为CGMCC No.7923，保存日期为2013年7月15日。
2.一种纤维素降解细菌的应用，其特征在于：将权利要求1所述的纤维素降解细菌制成高温堆肥菌剂进而制备成水稻秸秆生物有机肥，具体为：将纤维素降解细菌接种于LB液体培养基中，48h后取样测定菌液的浓度为2.0×108cfu/mL后，停止发酵；每升菌液与0.4-0.6kg稻草秸秆混匀后制成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的水稻秸秆堆肥通过以下方式制备得到：将芦笋秸秆经粉碎设备粉碎至5-10cm，形成秸秆段，按秸秆重量的0.5-1.0％接入堆肥菌剂，调节堆体水含量在65％；每天测定堆体温度，刚开始堆体温度会迅速上升到70℃，并维持1-2天，当温度不再上升且逐渐下降到45℃以下时，代表完成第一次发酵，然后进行翻堆，即7-8天翻堆1次，共翻堆3次；待第三次翻堆完成后，即制得秸秆生物有机肥。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的纤维素降解细菌通过以下方式进行保藏：采用-80℃低温冷冻保藏法，使微生物处于低温，以降低甚至停止其代谢作用从而达到保藏菌种的目的。
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