JP4904122B2

JP4904122B2 - 植物残渣を分解・減容する新規バチルス菌株

Info

Publication number: JP4904122B2
Application number: JP2006273131A
Authority: JP
Inventors: 孝博川端
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2026-10-04
Also published as: EP2062969A4; KR20090068271A; TW200825182A; JP2008086287A; WO2008041505A1; US8003366B2; KR101419964B1; US20100028974A1; EP2062969A1; AU2007303514A1

Description

本発明は、植物残渣を分解・減容する能力を持つ新規バチルス菌株、これを含む植物残渣の分解・減容資材、並びにこれらを用いて植物残渣を分解・減容する方法に関する。

庭やゴルフ場のグリーンなどにおいては、芝を定期的に手入れする必要があり、定期的に芝草の刈かすが発生する。さらに、枯死した刈かすや芝草や他の植物の茎、葉、根などの残渣が、分解されない状態で芝生上に蓄積し、サッチが形成される。このような刈芝やサッチを長期間放置しておくと、各種の病原菌が発生・増殖したり、有害なガスが発生したりし、その結果、芝の枯死や生育不良などの被害が起こることが知られている。特に、胞子を形成する病原菌が一旦発生すると、サッチ層内で胞子の形成が促進され、これが病原菌の新たな接種源となって、被害はさらに深刻化する。また、土壌に刈芝やサッチの層が一定以上の厚みで蓄積することによって、土壌や芝の根への空気、水、栄養源、農薬などの移行が妨げられ、その結果、芝の生育阻害が起こったり、病気が発生しやすくなったりすることも知られている。このような問題を引き起こす刈芝やサッチを除去するために、従来、ゴルフ場等では、バーチカルやエアレーションを実施したり、目土を施すなどの物理的手段が用いられていた。しかしながら、これらの方法は、簡便な方法とは言いがたく、定期的に実施するには労力を要し、さらにコストもかかるなどの問題があった。また、これらの方法によっては、十分に刈芝及びサッチを除去することができなかった。

また、河川や道路に発生する雑草の管理は、これまで雑草の刈り倒し、乾燥、集草、搬出、焼却により実施されてきたが、現在、安易な野焼き処分や埋め立て処分は厳しく法律で規制されている。特に膨大な量の刈草の処分は環境、美観、コストの面で大きな問題となっている。
また、農作物を収穫した後に残された残渣などは、畑などにそのまま放置されると病原菌の発生源となることから速やかな除去や分解が望まれるが、上記雑草の管理と同様に、環境、コストなどの面で大きな問題となっている。

このような状況下で、刈芝やサッチを細菌などの微生物を用いて分解・減容することにより、除去する方法が提案されている。例えば、セルロースを分解する能力を有するペニシリウム属細菌やバチルス・マセランス（Bacillus macerans）などが知られており、この菌体を刈芝やサッチ層を有する土壌に施用することが提案されている（特許文献１、２）。しかしながら、これらの細菌を含む微生物資材の刈芝やサッチの分解能力は十分ではなく、実用的ではなかった。さらに、上記の何れの細菌も、一定の試験条件下においては増殖し、刈芝やサッチを分解することができるものの、実用段階においては、日照、温度、降雨などの自然条件が、その増殖速度などに大きく影響し、十分かつ安定した効果が得られないという問題があった。
また、雑草については、堆肥化して利用する方法が検討されているが、適用する具体的な微生物についての検討は十分に行われておらず、効果が安定しないという問題があった（特許文献３）。

特許第３３２４９７９号公報特許第３２８３２２８号公報特開平１１−２４０７８４号公報

本発明は、短期間で十分に植物残渣を分解・減容する方法、該方法に用いるための細菌、及び該細菌を含む植物残渣の分解・減容資材を提供することを課題とする。特に、自然条件下でも十分に安定して植物残渣を分解・減容する能力を持つ細菌を見出し、植物残渣の分解・減容のために利用することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、植物残渣を分解・減容する能力に優れる細菌を見出した。そして、この細菌を培養して得た培養物を含む資材を植物残渣に投入したところ、植物残渣の分解・減容が促進されることを見出し、発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）植物の残渣を分解・減容する能力を持つバチルス・プミルス (Bacillus pumilus) ＫＳ−Ｃ４菌株（ＦＥＲＭＰ−２０９７８）。
（２）（１）に記載の菌株及び／又は植物の残渣を分解・減容する能力を有する該菌株の変異株の菌体、若しくはその菌体培養物を有効成分として含有する植物残渣の分解・減容資材。
（３）（２）に記載の植物の残渣の分解・減容資材を植物残渣に投入することを特徴とする、植物残渣の分解・減容方法。

本発明のバチルス・プミルスＫＳ−Ｃ４菌株（以下、単に「ＫＳ−Ｃ４菌株」ともいう。）を培養し、植物残渣の分解・減容資材を植物残渣に投入することにより、植物残渣の分解・減容が短期間で十分に行われる。本発明のＫＳ−Ｃ４菌株は、自然条件下でも効率的かつ安定的に植物残渣を分解・減容する能力を発揮するため、屋外での使用にも十分耐え得るものであり、当該菌株を含む植物残渣の分解・減容資材は、製品としての品質安定性、実用性を備えている。

本発明のバチルス・プミルス (Bacillus pumilus) ＫＳ−Ｃ４菌株は、本発明者らによって、埼玉県のゴルフ場の土壌から分離された菌株であり、植物残渣を分解・減容する能力を持つことを特徴とする。「植物残渣」とは、植物の葉、茎、花、根などの植物体の少なくとも一部を含み、かつ除去、分解が必要とされるものを指し、例えば、ゴルフ場、庭などの刈芝やサッチ、オガクズ、バーク、剪定材等などの木質物、イナワラ、ムギワラなどのワラ類、モミガラ、フスマなどの穀物残渣、農作物等の収穫残渣、農作物等の土壌中の根部残渣、野菜などの植物を含む家庭の生ゴミ、植物を摂食する家畜の糞、食品産業廃棄物などが含まれる。また、「分解・減容する能力」とは、植物残渣に菌体を投入した場合に、その植物残渣に含まれる植物体を構築している多糖類を栄養源として増殖し、その結果、植物残渣の固形分の質量や体積を減少させる能力をいう。

バチルス・プミルスＫＳ−Ｃ４株の菌学的性質は以下のとおりである。
ＫＳ−Ｃ４株は、セルラーゼ活性及びペクチナーゼ活性を有している。セルラーゼ活性及びペクチナーゼ活性を有するとは、菌体を培養して得られた培養物中にセルラーゼ活性及びペクチナーゼ活性を検出することができる程度にこれらの酵素を産生することをいう。具体的には、細胞内でセルラーゼ及びペクチナーゼを産生し、細胞壁の外側に産生セルラーゼ及び産生ペクチナーゼを付着しているか、細胞外に産生セルラーゼ及び産生ペクチナーゼを分泌することをいう。
セルラーゼは、セルロースのβ１→４グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルラーゼは、セルロース鎖をランダムに分解するエンドグルカナーゼ、及びセルロースの還元末端からセルロース鎖を分解し、セロビオースを生成するセロビオヒドロラーゼの両方を含む。ペクチナーゼは、ペクチン、ペクチニン酸、ペクチン酸を構成するポリガラクツ
ロン酸のα１→４結合を加水分解する酵素である。

ＫＳ−Ｃ４菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。また、ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果、ＫＳ−Ｃ４菌株の１６ＳｒＲＮＡは、相同率９９．８％でバチルス・プミルスＤＳＭＺ２７の１６ＳｒＲＮＡと高い相同性を示した。
これより、ＫＳ−Ｃ４菌株は、バチルス・プミルス (Bacillus pumilus) に帰属すると推定された。

ＫＳ−Ｃ４菌株は、平成１８年８月２日より、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−２０９７８で寄託されている。

ＫＳ−Ｃ４菌株は、通常、バチルス・プミルスの培養に用いられる方法により培養することができる。例えば、培養温度は１０〜４０℃で行うことができるが、通常は３０〜３５℃で培養することが好ましい。また、培養方法は、往復動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
培養に用いる培地成分も特に制限されず、動物性又は植物性の何れを用いてもよく、例えば、ふすま、コメヌカ、麦、乳製品等を含む資材を用いることができる。さらに、炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類、また窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等を添加することができる。

また、ＫＳ−Ｃ４菌株の菌体を保存するためには、胞子の状態とし、乾燥させて保存することが品質安定性の観点から好ましい。胞子を形成させる場合は、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整すればよい。

本発明の植物残渣の分解・減容資材は、ＫＳ−Ｃ４菌株及び／又は植物の残渣を分解・減容する能力を有するＫＳ−Ｃ４菌株の変異株の菌体、若しくはその菌体培養物を有効成分として含有することを特徴とする。「菌体培養物」とは、菌体を培養して得られる培養物をいう。
本発明に用いるＫＳ−Ｃ４菌株の変異株は、植物残渣を分解・減容する能力を有し、かつ該能力が維持されている菌株を用いることができる。
ＫＳ−Ｃ４菌株の変異株は、ＫＳ−Ｃ４菌株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異処理して得られた菌株から、ＫＳ−Ｃ４菌株の植物残渣を分解・減容する能力が、ＫＳ−Ｃ４菌株と同等又は増強されている菌株を選抜することにより得ることができる。また、さらに他の好ましい性質が維持されている菌株を選抜することも好ましい。
また、本発明においては、ＫＳ−Ｃ４菌株の組換え株を用いることもできる。このような組換え株は、例えば、植物残渣を分解・減容する能力に関与する遺伝子の発現が増強されるように、該遺伝子の発現を調節する遺伝子を改変し、ＫＳ−Ｃ４菌株に導入することにより得ることができる。また、上記能力以外の他の好ましい性質が増強又は付与されるように改変してもよい。
なお、本明細書においては、上記ＫＳ−Ｃ４菌株の変異株を含めて、単に、「ＫＳ−Ｃ４菌株」という場合もある。

本発明の植物残渣の分解・減容資材に含まれるＫＳ−Ｃ４菌株の菌体は、胞子の状態であってもよいし、栄養細胞の状態であってもよい。通常は、保存性の観点から胞子の状態であることが好ましい。

本発明の植物残渣分解・減容資材におけるＫＳ−Ｃ４菌株の菌濃度は、植物残渣に投入する際に菌体が死滅せず、増殖可能な濃度であれば特に制限されないが、通常は、１×１０⁴〜１×１０¹¹ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１×１０⁷〜１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｇとすることが好ましい。

また、本発明の植物残渣の分解・減容資材は、上記バチルス属細菌の増殖を促進するための栄養源をさらに含んでいることが好ましい。栄養源を添加することにより、本発明の植物残渣の分解・減容資材の植物残渣への投入後、上記バチルス属細菌の増殖が促進されるため、より迅速な植物残渣の分解・減容が可能となる。
栄養源の種類は、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、通常バチルス属細菌の増殖に用いられるものを選択することができる。

本発明の植物残渣の分解・減容資材は、ＫＳ−Ｃ４菌株を培養して得た培養物からＫＳ−Ｃ４株の菌体を含む少なくとも一部をそのまま、又は他の任意成分と混合して製造することができる。
例えば、固体培地を用いて培養を行う場合には、得られた培養物の少なくとも一部を乾燥、粉砕して植物残渣の分解・減容資材の製造に用いることができる。また、液体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、得られた培養物をそのまま用いることもできるし、得られた培養物を遠心分離することにより菌体を分離した後、スプレー乾燥や凍結乾燥により乾燥して用いることもできる。

本発明の植物残渣の分解・減容資材は、製品としての品質安定性、保存性を高めるために乾燥させることが好ましい。乾燥は、植物残渣の分解・減容資材の水分含有量が１０質量％以下となるように行うことが好ましい。乾燥方法は特に制限されず、自然乾燥、通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、この中でも噴霧乾燥及び通風乾燥が好ましく用いられる。乾燥する際には、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類などの保護剤を用いることができる。糖類を用いる場合は、グルコースやトレハロースを用いることができる。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、細菌を長期間生きたまま保存することが可能となる。

また、本発明の植物残渣の分解・減容資材は、ＫＳ−Ｃ４菌株の菌体又は菌体培養物に、液体担体、固体担体、界面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）、補助剤などの任意の物質を加えて加工することもできる。これらの任意の物質は、環境上安全なものであれば特に制限されず、通常土壌散布剤、肥料などに用いられているものを用いることができる。
液体担体としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、パリゴルスカイト（アタパルジャイト）、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられる。また、界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン・脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルフォネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖などが挙げられる。

本発明の植物残渣の分解・減容資材は、植物残渣に投入して使用する。投入方法は、対象とする植物残渣が存在する場所や面積などに応じて、適当な方法をとることができる。例えば、ゴルフ場、庭、田畑などの植物残渣に使用する場合は、粉剤を散布したり、粉剤
を水などの液体により例えば１０００倍程度に希釈して散布したりする方法が挙げられる。また、生ゴミ、家畜排泄物、食品産業廃棄物などに使用する場合には、粉剤や液剤を投入した後に、混合する方法が挙げられる。

本発明の植物残渣の分解・減容資材の投入量は、ＫＳ−Ｃ４菌株が死滅せず増殖可能な菌体数を有している限りにおいて特に制限されない。例えば、乾燥粉末に換算した場合の濃度が、通常は０．１〜５０ｇ／ｍ²、好ましくは０．５〜１０ｇ／ｍ²、又は０．１〜１００ｇ／ｍ³、好ましくは０．５〜２０ｇ／ｍ³となるように投入することが好ましい。
また、本発明の植物残渣の分解・減容資材は、通常植物の生育において用いられる無機肥料、有機肥料、除草剤などと共に用いることができる。

（１）ＫＳ−Ｃ４菌株の分離
埼玉県のゴルフ場のサッチ部分を含む土壌にコウライ芝の刈草と水を混合し、２５℃で３０日間放置した。次に、この土壌からカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含有する寒天プレートで大きなハロー（クリアゾーン）を形成するバチルス菌類を１０株分離した。この中から、コウライ刈芝を分解する能力が最も高い菌株を選抜し、ＫＳ−Ｃ４菌株とした。

（２）植物残渣の分解・減容資材の製造
上記で得られたＫＳ−Ｃ４菌株をブイヨン培地（肉エキス、ペプトン、ＫＨ₂ＰＯ₄、ＭｇＳＯ₄を含む液体培地）を用いて３０℃で２日間培養し、得られた液体培養物を実施例１の植物残渣の分解・減容資材とした。この液体培養物の菌濃度は、１×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌであった。また、バチルス・プミルスＮＢＲＣ１２０９２菌株及びバチルス・ズブチリスＢＳＴＨ−１菌株についても同様に培養を行い、得られた液体培養物をそれぞれ比較例１及び比較例２の資材とした。
次に、これらの液体培養物を種菌として、固体培養物の基材である丸ダイズ（オートクレーブ１２１℃、３０分間滅菌）に接種し、３０℃で２日間培養した。ここで得られたそれぞれの菌株の固体培養物を室温で風乾した後、ミルを用いて粉砕した。この粉砕物に粘土鉱物と界面活性剤（ソルポール５０８２：東邦化学工業社製）を混合し、菌濃度を５×１０⁸ＣＦＵ／ｇに調整したものを、それぞれ実施例２の植物残渣の分解・減容資材、比較例３、比較例４の資材とした。
なお、バチルス・プミルスＮＢＲＣ１２０９２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に登録されている株である。また、バチルス・ズブチリスＢＳＴＨ−１菌株は、本発明者らが千葉県内の畑土壌から見出した菌株であって、高いセルロース分解能を有する菌株であり、平成１７年９月１３日より、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号Ｐ−２０６６３で寄託されている。

（３）刈芝の分解・減容試験
上記で得た実施例１の植物残渣の分解・減容資材について、ゴルフ場のコウライ刈芝の分解試験法を用いて刈芝の分解・減容能力を評価した。ゴルフ場フェアウェイのコウライ芝の刈芝を５〜１０ｍｍに切断したものを、天日で１０日間十分に乾燥させ、所定量（１ｇ）ずつフラスコに取った。それぞれのフラスコに水１０ｍｌを添加し、オートクレーブにて滅菌した後、実施例１の植物残渣の分解・減容資材、比較例１、比較例２の資材を１００μｌ（１×１０⁸ＣＦＵ）ずつ添加し、２８℃で１４日間静置した。１４日後にフラスコ内の刈芝を二重にしたガーゼで回収し、軽く水で洗浄した後、７０℃で２４時間乾燥させ、残存重量を測定した。この残存重量の、植物残渣の分解・減容資材の投入前の植物残渣の乾燥重量に対する割合（分解率（％））を算出した。
結果を表１に示す。

表１に示すように、実施例１の植物残渣の分解・減容資材は、１４日間の処理によって、コウライ刈芝を３０％分解した。一方比較例１の資材の分解率は７．５％であり、比較例２の資材の分解率は４．１％であった。これより、ＫＳ−Ｃ４菌株は、同種に属する他の菌株、同属に属する他の菌株に比べて非常に強い刈芝の分解・減容能力を持つことが判明した。

（４）サッチの分解・減容試験
上記で得た実施例２の植物残渣の分解・減容資材について、サッチ分解・減容能力を評価した。評価には、千葉県内のゴルフ場のグリーン（ベントグリーン）を用いた。実施例２の植物残渣の分解・減容資材、比較例３、比較例４の資材をそれぞれ水で１０００倍に希釈した後、グリーン１ｍ²当たり１ｇ資材（５×１０⁸ＣＦＵ）となるように散布した。散布６０日後に、ソイルカッターで芝の一部を各処理区当たり３サンプル回収し、根部の土壌を流水で洗浄した後、芝の茎葉部の下に残るサッチ部分の厚みを測定した。また、各処理区のサッチ部分の厚みの平均値を算出し、無処理区との差をサッチ減少率（％）として評価した。
結果を表２に示す。

表２のように、実施例２の植物残渣の分解・減容資材による処理区は、６０日後には無処理区と比較してサッチ部分の厚みが２３．２％減少していることが分かった。一方、比較例３の資材による処理区のサッチ減少率は１４．１％、比較例４の資材による処理区のサッチ減少率は１０．８％にとどまっていた。これより、ＫＳ−Ｃ４菌株は、同種に属する他の菌株、同属に属する他の菌株に比べて非常に強いサッチの分解・減容能力を持つことが判明した。

（５）刈草の分解・減容試験
上記で得た実施例１の植物残渣の分解・減容資材の刈草の分解・減容能力を、（３）と同様の方法で評価した。評価に用いた刈草の植物種を表３に示す。これらの植物は、河川堤防等に繁茂する雑草に由来するものである。これらの刈草を、天日で１０日間十分に乾燥させた後、５〜１０ｍｍに切断し、所定量（２ｇ）をフラスコに取った。このフラスコに水３０ｍｌを添加し、オートクレーブにて滅菌した後、実施例１の植物残渣の分解・減容資材を１００μｌ（１×１０⁸ＣＦＵ）ずつ添加し、２８℃で１４日間静置した。１４日後に（３）と同様にして乾燥重量を測定し、分解・減容の程度を評価した。
［評価基準］
◎：５０％以上減少
〇：２０〜５０％減少
結果を表３に示す。

表３に示すように、ＫＳ−Ｃ４菌株は、各種雑草、特に広葉雑草への高い分解・減容能力を示した。これより、本発明の植物残渣の分解・減容資材は、刈草の分解・減容にも好適に用いることができることが判明した。

（６）農作物残渣の分解・減容試験
上記で得た実施例２の植物残渣の分解・減容資材について、イチゴ収穫後の土壌中の根部残渣の分解・減容能力を評価した。イチゴの収穫後、根部残渣が残るイチゴ圃場に、実施例２及び比較例４の植物残渣の分解・減容資材を水で１０００倍に希釈した後、１ｍ²当たり５ｇ資材（２．５×１０⁹ＣＦＵ）となるように散布した。散布３０日後に、各処理区当たり３ヶ所の土壌を一定量採取し、風乾した。次に風乾した土壌を篩（目開き２ｍｍ）にかけ、篩上に残った根、茎等の根部残渣を回収して重量を測定し（残渣含有量）、無処理区との差を残渣減少率（％）として算出した。
結果を表４に示す。

表４に示すように、実施例２の植物残渣分解・減容資材による処理区は、３０日後には無処理区と比較して根部残渣が４２．６％減少していることが分かった。一方、比較例４
の資材による処理区の残渣減少率は、２９．６％にとどまっていた。これより、ＫＳ−Ｃ４菌株は、同属に属する他の菌株に比べて非常に強い農作物残渣の分解・減容能力を持つことが判明した。

Claims

植物の残渣を分解・減容する能力を持つバチルス・プミルス (Bacillus pumilus) ＫＳ−Ｃ４菌株（ＦＥＲＭＰ−２０９７８）。
請求項１に記載の菌株の菌体、若しくはその菌体培養物を有効成分として含有する植物残渣の分解・減容資材。
請求項２に記載の植物残渣の分解・減容資材を植物残渣に投入することを特徴とする、植物残渣の分解・減容方法。