CN116286463A - 一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用，涉及微生物菌剂领域，解决了现有技术中采用化学方法防治烟草黑胫病效果不佳、抗药性增强以及对环境造成污染的问题。本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括菌种活化、种子液的制备和发酵培养的步骤，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF‑17‑0003发酵液用于防治烟草黑胫病，发酵液中的芽孢可抑制土壤烟草黑胫病病原菌的生长和改善土壤微生态环境；另一方面，发酵液安全无毒、无残留、且不会污染环境。本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，可以提高发酵液的芽孢含量，从而提高所得发酵液的生防效果；另一方面，本发明的制备方法还使原料利用率最大化，缩短发酵周期，适于批量生产，提高经济效益。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌。相较于其它微生物而言，芽孢杆菌最突出的特点是可在恶劣的环境中产生抗逆性强的芽孢以度过不良的环境条件，且芽孢杆菌在自然界中普遍存在，对人畜无害，对植物无致病性。
中国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草黑胫病，其分布面积广，危害严重。传统的化学防治方法对抗烟草黑胫病的效果不佳，并且连年使用化学药剂，不仅使黑胫病病菌的抗药性有所增强，而且对环境造成巨大污染。
生物防治安全、无污染、无公害，是对烟草上有害生物进行综合治理的发展方向。因此，有必要提供一种生物菌剂以防治烟草黑胫病病菌。
发明内容
本发明的目的是提出一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用，解决了现有技术中采用化学方法防治烟草黑胫病效果不佳、黑胫病病菌抗药性增强以及对环境造成巨大污染的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
菌种活化：将保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子，挑选所得菌苔作为种子液菌种备用；
种子液的制备：将所挑选的种子液菌种接入含有种子液培养基的种子罐中，在温度为32～37℃，搅拌速度为180～300r/min条件下恒温培养14～20h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液；
发酵培养：将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以3％～6％的接种量接入主发酵液体培养基，在通气量为0.8～1.7vvm，转速为300～500rpm/min，培养温度为35℃～37℃条件下，培养时间24h～36h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其编号为YWF-17-0003，保藏登记号为CCTCC No：M 2022752，保藏日期2022年05月30日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)。
根据一个优选实施方式，菌种活化过程中，LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。
根据一个优选实施方式，种子液制备过程中，种子液培养基的配方为：牛肉膏3～5g/L，细菌学蛋白胨5～8g/L，葡萄糖3～5g/L，甘露醇5～8g/L。
根据一个优选实施方式，发酵培养过程中，主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖15～20g/L，豆粕粉15～20g/L，酵母膏4～8g/L，甘露醇5～8g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，硫酸镁0.5～1g/L。
根据一个优选实施方式，发酵培养过程中，主发酵液体培养基的pH值为6.0～8.0。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌发酵液，所述发酵液是通过本发明中任一项技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液。
根据一个优选实施方式，所述贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液中，贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为94.4×108cfu/ml～113×108cfu/ml。
本发明中任一项技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液在防治烟草黑胫病中的应用。
根据一个优选实施方式，将贝莱斯芽孢杆菌发酵液与水按质量比为1∶100混匀后施用。
根据一个优选实施方式，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液采用灌根的方式施加于烟草根部。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用至少具有如下有益技术效果：
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌发酵液，将其用于防治烟草黑胫病，发酵液中的芽孢可抑制土壤烟草黑胫病病原菌的生长和改善土壤微生态环境，其代谢分泌的抑菌活性物质细胞壁降解酶类(葡聚糖酶和蛋白酶)、脂肽类抗生素(表面活性素、伊枯草菌素和芬荠素)以及聚酮类抗生素可水解烟草黑胫病病源真菌细胞壁、抑制病原真菌分生孢子萌发、芽管生长和附着胞的形成；还可改变细胞质膜的结构和渗透性，引起胞内物质外泄，导致细胞死亡，因此，发酵液对烟草黑胫病致病菌有明显的抑制作用；另一方面，发酵液安全无毒、无残留、且不会污染环境。可见，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌发酵液及其应用，解决了现有技术中采用化学方法防治烟草黑胫病效果不佳、黑胫病病菌抗药性增强以及对环境造成巨大污染的技术问题。
本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，可以提高发酵液的芽孢含量，从而提高所得发酵液的生防效果；另一方面，本发明的制备方法通过对原料(培养基原料)进行合理的配比，使原料利用率最大化，缩短发酵周期，适于批量生产，从而降低人工，设备及水、电、气等运行成本，最终提高经济效益。
另外，本发明优选技术方案还具有如下有益技术效果：
本发明优选技术方案的制备方法，种子液制备过程中，种子液培养基的配方为：牛肉膏3～5g/L，细菌学蛋白胨5～8g/L，葡萄糖3～5g/L，甘露醇5～8g/L，此配方的种子液培养基在进行种子液培养时，可提高种子活性。
本发明优选技术方案的制备方法，发酵培养过程中，主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖15～20g/L，豆粕粉15～20g/L，酵母膏4～8g/L，甘露醇5～8g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，硫酸镁0.5～1g/L，此配方的主发酵液体培养基可明显提升发酵液中的菌量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中不同主发酵液体培养基配方所得发酵液的菌含量统计结果图；
图2是实施例7中无菌水对烟草黑胫病病原菌的拮抗作用结果图；
图3是实施例7中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液对烟草黑胫病病原菌的拮抗作用结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合说明书附图1和2以及实施例1～6对本发明的贝莱斯芽孢杆菌发酵液、制备方法及其应用进行详细说明。
实施例1
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法中的主发酵液体培养基进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。按照如下配方配制六种不同的主发酵液体培养基。将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接入不同配方的主发酵液体培养基，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min，培养温度为35℃条件下，培养时间24h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液。统计不同配方所得的发酵液菌量数。
配方一：黄豆粉18g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏4.5g/L，碳酸钙2.3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，自然pH；
配方二：玉米浆干粉12g/L，蔗糖15.6g/L，蛋白胨6g/L，豆粕粉12g/L，硫酸镁1g/L，氯化镁0.7g/L，自然pH；
配方三：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，自然pH；
配方四：黄豆粉20g/L，玉米粉12g/L，葡萄糖8g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，磷酸二氢钾1g/L，自然pH；
配方五：可溶性淀粉10g/L，豆粕粉18g/L，骨蛋白东6.5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钾0.4g/L，硫酸铁0.3g/L，自然pH；
配方六：豆粕粉20g/L，葡萄糖15g/L，酵母膏4g/L，骨蛋白胨6g/L，硝酸钾1.5g/L，氯化钠1g/L，自然pH。
从图1可知，配方三所得发酵液的菌含量明显高于其余配方。即本发明主发酵液体培养基的配方优选为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L。
实施例2
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。配制3L主发酵液体培养基。主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为自然pH。将配制的主发酵液体培养基装入容量为5L的发酵罐，灭菌降温至35℃，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接种，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min的条件下进行发酵至产孢率≥90％，检测发酵中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为94.4×108cfu/ml。
实施例3
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。配制3L主发酵液体培养基。主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为6.5。将配制的主发酵液体培养基装入容量为5L的发酵罐，灭菌降温至35℃，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接种，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min的条件下进行发酵至产孢率≥90％，检测发酵中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为98.7×108cfu/ml。
实施例4
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。配制3L主发酵液体培养基。主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.0。将配制的主发酵液体培养基装入容量为5L的发酵罐，灭菌降温至35℃，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接种，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min的条件下进行发酵至产孢率≥90％，检测发酵中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为100.4×108cfu/ml。
实施例5
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。配制3L主发酵液体培养基。主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.5。将配制的主发酵液体培养基装入容量为5L的发酵罐，灭菌降温至35℃，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接种，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min的条件下进行发酵至产孢率≥90％，检测发酵中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为110.0×108cfu/ml。
实施例6
本实施例对本发明贝莱斯芽孢杆菌发酵液制备方法进行说明。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：菌种活化。将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子。LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。而后挑选适宜梯度的平板，大概菌落有30个的活化种子，挑取饱满、有光泽的菌苔作为种子液菌种备用。
步骤2：种子液的制备。配制种子液培养基50ml。种子液培养基的配方为：牛肉膏3g/L，细菌学蛋白胨6g/L，葡萄糖4g/L，甘露醇5g/L。将配制的种子液培养基装入500ml三角瓶，灭菌冷却后接种所挑选的种子液菌种，在温度为35℃，搅拌速度为200r/min条件下恒温培养16h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液。
步骤3：发酵培养。配制3L主发酵液体培养基。主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖18g/L，豆粕粉20g/L，酵母膏4g/L，甘露醇5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为8.0。将配制的主发酵液体培养基装入容量为5L的发酵罐，灭菌降温至35℃，将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以6％的接种量接种，在通气量为1.1～1.7vvm，转速为300～400rpm/min的条件下进行发酵至产孢率≥90％，检测发酵中贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为95.0×108cfu/ml。
实施例7
本实施例对贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液对烟草黑胫病病原菌的拮抗能力进行详细说明。
试验方法：以实施例5中各培养基的配方和方法，将种子液发酵24h后形成发酵液。所得发酵液使用时，用无菌水按将贝莱斯芽孢杆菌发酵液与水按质量比为1∶100稀释，稀释液中的有效活菌数为1.10×108cfu/ml。
用灭菌打孔器制取直径5mm的烟草黑胫病菌菌饼，菌丝面朝下接种于各个浓度的培养皿中央，处理重复3次。将稀释后的发酵液等量加入PDA培养基中，以加无菌水的PDA培养基作为空白对照。
25℃恒温培养，待空白对照的菌落直径达到6～8cm时，采用十字交叉法测定菌落直径，依照如下公式计算发酵液对病原菌的菌丝生长抑制率。抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。
试验结果：试验结果如图2和图3所示，图2显示了无菌水对烟草黑胫病病原菌的拮抗作用结果图，图3显示了贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液对烟草黑胫病病原菌的拮抗作用结果图。从图2和图3的对比可知：贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液对烟草黑胫病病原菌具有抑制作，以贝莱斯芽孢杆菌发酵液与水按质量比为1∶100稀释后，其抑制效果较为明显。
实施例8
本实施例对本发明中贝莱斯芽孢杆菌发酵液对烟草黑胫病的田间防治效果进行详细说明。
1、试验地点
试验设置在云南省微生物发酵工程研究中心有限公司，试验品种为云烟100。
2、试验材料与方法
2.1、试验材料
烟草品种：云烟100。
供试菌剂：贝莱斯芽孢杆菌。
供试药剂：58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂。
2.2、试验方法
在长势一致的5～6片真叶烟苗移栽成活后，接种烟草黑胫病病原菌，根据发病情况进行不同处理，分别设置以下处理：
A、贝莱斯芽孢杆菌发酵液；
B、58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂(喷施处理)；
C、清水对照。
每个处理10株烟，每个处理重复三次，烟苗移栽于装有灭菌土与基质的体积比3∶1的花盆中，每盆1株，其余管理一致。
2.3、调查方法
在移栽后60天对各处理烟草黑胫病发病情况进行调查和记录。按照烟草黑胫病发病症状进行发病调查(每个处理选择30株进行调查)，并做好记录。
按照上述调查方法得到烟草黑胫病发病率，并比较58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂与清水对照处理间的发病情况，得出结论。
3、试验结果
不同处理烟草黑胫病发病率统计结果表如表1所示。根据表1中的统计结果得出：施用本发明的贝莱斯芽孢杆菌发酵液处理的烟草黑胫病发病率为10％，喷施农药58％的甲霜灵锰锌的发病率为13.67％，与喷施农药处理相比，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的处理效果比农药处理的效果更好，发病率降低3.67个百分点；而与清水对照相比降低36.67个百分点。因此，本发明的贝莱斯芽孢杆菌对盆栽烟草方面，能有效抑制烟草黑胫病的发生。
表1不同处理烟草黑胫病发病率统计结果表
Figure SMS_1
Figure SMS_2
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
菌种活化：将保存的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003甘油管菌种稀释104、105和106倍，在LB固体培养基上，活化培养，得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子，挑选所得菌苔作为种子液菌种备用；
种子液的制备：将所挑选的种子液菌种接入含有种子液培养基的种子罐中，在温度为32～37℃，搅拌速度为180～300r/min条件下恒温培养14～20h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液；
发酵培养：将所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003种子液以3％～6％的接种量接入主发酵液体培养基，在通气量为0.8～1.7vvm，转速为300～500rpm/min，培养温度为35℃～37℃条件下，培养时间24h～36h，得贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，菌种活化过程中，LB固体培养基的配方为：细菌学蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，酵母提取粉5g/L。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，种子液制备过程中，种子液培养基的配方为：牛肉膏3～5g/L，细菌学蛋白胨5～8g/L，葡萄糖3～5g/L，甘露醇5～8g/L。
4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，发酵培养过程中，主发酵液体培养基的配方为：葡萄糖15～20g/L，豆粕粉15～20g/L，酵母膏4～8g/L，甘露醇5～8g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，硫酸镁0.5～1g/L。
5.根据权利要求4所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，发酵培养过程中，主发酵液体培养基的pH值为6.0～8.0。
6.一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述发酵液是通过权利要求1至5中任一项所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法所得的贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液。
7.根据权利要求6所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003发酵液中，贝莱斯芽孢杆菌YWF-17-0003的有效活菌数为94.4×108cfu/ml～113×108cfu/ml。
8.一种权利要求6或7所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液在防治烟草黑胫病中的应用。
9.根据权利要求8所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液在防治烟草黑胫病中的应用，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌发酵液与水按质量比为1∶100混匀后施用。
10.根据权利要求8所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液在防治烟草黑胫病中的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液采用灌根的方式施加于烟草根部。
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