CN110878271A - 地衣芽孢杆菌mes816及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌MES816及其产品和应用。本发明从河北保定土壤里分离获得的一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）MES816，该菌株对棉花立枯病致病菌Rhizoctonia solani Kohn有强烈的抑制作用，防止棉花立枯病的发生，促进棉花增产、增收。

Description

地衣芽孢杆菌MES816及其产品和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及地衣芽孢杆菌MES816及其产品和应用。

背景技术

棉花立枯病又称烂根、黑根病，是棉花苗期的主要病害，多发生在幼苗出土至真叶期。染病一周左右棉苗枯死。在我国各主要棉区都有发生，而且每年均可在田间出现，发病率一般为5％-40％，常造成缺苗断垄。重发生年份，某些地区的发病率可达50％以上，可使棉苗成片死亡，甚至造成毁种。

棉花立枯病病原有性态为瓜亡革菌[Thanate.pephorus cucumeris(Frank)Donk]，属担子菌亚门亡革菌属；无性态为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kohn)，属半知茵亚门丝核菌属。其有性态仅在高温酷暑、高湿的条件下生成，一般不易发现。病菌以菌丝体或菌核在土壤中或病残体上越冬，在土壤中形成的菌核可存活数月至几年。立枯丝核菌可抵抗高温、冷冻、干旱等不良环境条件，适应性很强，一般能存活数年，且耐酸碱，在pH值2.4-9.2范围内均可生长。因此.该菌的寄主范围极其广泛，分布很广。

棉花生产在中国棉业发展中具有举足轻重的地位。加强棉花病害的防治具有积极重要的意义。目前棉苗立枯病的防治仍以化学防治为主，使用含有化学杀菌剂为主的种衣剂进行拌种防治。同时为了防治苗期虫害，市场上的种衣剂还含有化学杀虫剂作为复配剂。但在生产实践中，种衣剂拌种时如不按技术规程严格执行，容易造成种子发生药害，从而加重了棉田烂种、烂芽和死苗率的发生。另外，化学种衣剂的长期使用能破坏土壤根际微生物的种群数量，造成微生物代谢功能下降等后果(杨永华等，2000)。而国外对于立枯病的防治多以轮作、选育抗病品种和生物防治等对多种环境友好的方法值得我们借鉴，其中生物防治由于成本低、周期短、见效快等特点具有巨大潜在利用优势。

利用微生物防治作物土传病害是最有效的防治措施之一，经检索，目前尚未发现用地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)防治棉花立枯病的报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株地衣芽孢杆菌MES816。

本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MES816，保藏编号为CGMCC NO.15744。

上述地衣芽孢杆菌MES816于2018年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.15744。

本发明的另一个目的在于提供地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。

本发明提供了地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在防治棉花立枯病中的应用。

本发明还提供了地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备防治棉花立枯病的产品中的应用。

本发明还保护地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在抗菌和/或抑菌中的应用。

本发明还保护地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备抗菌和/或抑菌的产品中的应用。

上述应用中所述菌为立枯丝核菌。

本发明还有一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分包括上述地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。

产品具有如下(a)或(b)所述的功能：

(a)防治棉花立枯病；

(b)抗菌和/或抑菌。

一种地衣芽孢杆菌MES816的发酵方法，具体如下：

(1)摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养。

摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，酵母膏0.2％-2％，氯化钠0.3-0.5％，培养基pH为6.0-7.5)。

培养条件为：转速180-230r/min，温度32-37℃，培养10-12h。

(2)一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，116℃-121℃湿热灭菌20-35min，取1mL地衣芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h.

一级种子培养所用培养基的原料及用量为:牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，酵母膏0.2％-2％，氯化钠0.3-0.5％，营养琼脂1.5％-2.0％，培养基pH为6.0-7.5。

(3)二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃-122℃湿热灭菌20-40min，将100-300mL一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养8-12h。

二级种子培养所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％-3％，豆饼粉0.5％-1％，磷酸氢二钾1‰-3‰，消泡剂0.2‰-2‰，培养基pH调为6.0-7.5。

(4)发酵：在5m³或30m³扩发酵罐中装有或4000L或20m³地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌20-40min，将150L或200L二级种子接种于地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h。

发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3％-2％，玉米粉1％-5％，豆粕粉1％-5％，磷酸氢二钾1‰-3‰，消泡剂0.2‰-2‰，培养基pH调为6.0-7.5。

(5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵。

本发明最后一个目的是提供一种防治或辅助防治棉花立枯病的方法。

本发明提供的防治或辅助防治棉花立枯病的方法包括如下步骤：用上述地衣芽孢杆菌MES816或产品中的菌悬液喷洒棉花幼苗。

上述方法中，所述菌悬液中地衣芽孢杆菌MES816的浓度为不低于4×10⁸cfu/ml。

本发明从河北保定土壤里分离获得的一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MES816，该菌株对棉花立枯病致病菌Rhizoctonia solani Kohn有强烈的抑制作用，防止棉花立枯病的发生，促进棉花增产、增收。该菌株的防治效果显著，防治效果达80％以上，并且无公害、无污染、低成本、便于大面积使用。在棉花立枯病的上午防治方面具有巨大的应用潜力，为研制和开发微生物农业提供了优良的基础菌株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3中地衣芽孢杆菌MES816对立枯丝核菌的防治效果试验。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1菌株的分离与鉴定

河北保定土壤经过无菌水梯度稀释，平板划线于37℃培养12h，挑取单菌落制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落，经结晶紫染色，镜检，经农业部菌种检测机构鉴定为地衣芽孢杆菌。

经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rDNA测序比对，鉴定为地衣芽孢杆菌，命名为MES816。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MES816为革兰氏阳性菌，可在厌氧条件下生长。细菌呈直杆状，单个、成对或短链排列。有芽孢，芽孢近椭圆形，中生，芽孢囊不膨大。在营养琼脂培养基上的菌落微黄色，形态不规则，扁平，不透明，在光照下菌落边缘较中央略透明，表面湿润、有光泽，向边缘扩张。部分生理生化反应结果为：利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖均产酸，明胶液化试验呈阳性。

地衣芽孢杆菌16S rDNA的序列如下所示：

GCGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTGCAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGA(SEQ ID NO.1)。

得到的地衣芽孢杆菌于2018年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15744。

实施例2微生物菌剂的制备

(1)摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养。

摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，酵母膏0.2％-2％，氯化钠0.3-0.5％，培养基pH为6.0-7.5)。

培养条件为：转速180-230r/min，温度32-37℃，培养10-12h。

(2)一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，116℃-121℃湿热灭菌20-35min，取1mL地衣芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h.

一级种子培养所用培养基的原料及用量为:牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，酵母膏0.2％-2％，氯化钠0.3-0.5％，营养琼脂1.5％-2.0％，培养基pH为6.0-7.5。

(3)二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃-122℃湿热灭菌20-40min，将100-300mL一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养8-12h。

二级种子培养所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％-3％，豆饼粉0.5％-1％，磷酸氢二钾1‰-3‰，消泡剂0.2‰-2‰，培养基pH调为6.0-7.5。

(4)发酵：在5m³或30m³扩发酵罐中装有或4000L或20m³地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌20-40min，将150L或200L二级种子接种于地衣芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h。

发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖0.3％-2％，玉米粉1％-5％，豆粕粉1％-5％，磷酸氢二钾1‰-3‰，消泡剂0.2‰-2‰，培养基pH调为6.0-7.5。

(5)至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵。

(6)地衣芽孢杆菌产品cfu不少于3.0×10¹⁰个。

(7)尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。

实施例3地衣芽孢杆菌MES816对立枯丝核菌的拮抗作用试验

(1)供试棉花立枯病病菌来源：棉花立枯病菌采自河北省保定市高阳县棉花立枯病株，经公司研究人员分离纯化，鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kohn)，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板对峙实验：

先将棉花立枯病菌接种在营养琼脂培养基平皿中央，再蘸取少量活化后的地衣芽孢杆菌MES816接种在病原菌的两侧约2cm处，同时设置只接种棉花立枯病菌的为空白对照。30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉花立枯病病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种MES816后的抑制生长半径)，用拮抗作用抑菌率(抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100)表示。

(3)结果(图1)地衣芽孢杆菌MES816对立枯丝核菌的抑菌带宽达8mm，抑菌率为88.35％。说明地衣芽孢杆菌MES816对立枯丝核菌具有明显的抑制作用，具有防治棉花立枯病的生防潜力。

实施例4地衣芽孢杆菌MES816对棉花立枯病的防治效果试验

(一)试验药剂

(1)微生物菌剂：实施例2制备的MES816液体制剂，用水稀释500倍；

(2)化学药剂：50％多菌灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)，用水稀释800倍。

(3)空白对照：清水。

(二)试验方法：将棉花种子催芽后播种至口径为30cm的塑料花盆中，每个处理5盆(每盆3株)，重复三次。采用随机区组排列方法放置。棉苗出来后用50％多菌灵可湿性粉剂800倍沿棉苗主茎喷雾，使药液顺主茎滴入土壤，每3-5天一次，连续3次，同时也将实施例2制备的MES816液体制剂分2次均匀喷洒在供试植株叶片及植株茎，化学药剂对照和空白对照清水处理同上。24小时后均匀喷雾接种棉花立枯病病菌(将实施例3中棉花立枯病病菌接种于PDA培养基上培养挑取菌体后加无菌水制成菌悬液)，接种浓度为20-100个菌核/mL；接种后在28-30℃培养箱中保湿培养6-8天，待空白对照充分发病时调查发病情况，并计算病情指数和防治效果。

(三)结果(见表1)地衣芽孢杆菌MES816液体制剂处理后，病情指数(8.25)显著低于空白对照处理后的病情指数(87.32)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.86)差异不显著，MES816对棉花立枯病的防治效果达89.63％，说明地衣芽孢杆菌MES816及其微生物菌剂对棉花立枯病防治效果较好。

表1地衣芽孢杆菌MES816对棉花立枯病防效对比试验结果

处理	病情指数	防效(％)
			MES816液体制剂	8.25b	89.63
化学药剂	7.86bc	91.89
			空白对照	87.32a	0.00

SEQUENCE LISTING

<110> 天津开发区坤禾生物技术有限公司

<120> 地衣芽孢杆菌MES816及其产品和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌MES816 16S rDNA

<400> 1

gcgggtgcta tacatgcagt cgagcggacc gacgggagct tgctccctta ggtcagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120

gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc atggttcaat cataaaaggt ggcttttagc 180

taccacttgc agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240

gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360

aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa 420

gtaccgttcg aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540

gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600

attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac 720

gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgcagca aacgcattaa 840

gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960

acatcctctg acaaccctag agatagggct tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg 1020

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200

tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaagc cgcgaggcta agccaatccc acaaatctgt 1260

tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320

ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380

gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taaccttttg gagccagccg ccgaaggtga 1440

caga 1444

Claims (9)

1.地衣芽孢杆菌MES816，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌于2018年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 15744。

2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在防治棉花立枯病中的应用。

3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备防治棉花立枯病的产品中的应用。

4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在抗菌和/或抑菌中的应用；

优选地，所述菌为立枯丝核菌。

5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备抗菌和/或抑菌的产品中的应用；

优选地，所述菌为立枯丝核菌。

6.一种产品，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品具有如下（a）或（b）所述的功能：

（a）防治棉花立枯病；

（b）抗菌和/或抑菌。

8.一种防治或辅助防治棉花立枯病的方法，其特征在于，用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MES816或权利要求6或7所述的产品中的菌悬液喷洒棉花幼苗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌悬液中地衣芽孢杆菌MES816的浓度为不低于4×10⁸cfu/ml。

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