CN111172063B - 贝莱斯芽孢杆菌mes861及其应用和产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供微生物菌剂的制备方法，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌MES861经液体培养得到微生物菌剂；所述贝莱斯芽孢杆菌MES861于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16857；所述液体培养的步骤为：在30 m³扩发酵罐中装有20 L液体发酵培养基，115℃‑122℃湿热灭菌35‑40 min后冷却到35℃，将一级种子接种于液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa‑0.07 Mpa，在35℃培养26 h，至芽抱形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到微生物菌剂。该菌株对禾谷镰刀菌拮抗效果明显，能防止或减轻水稻立枯病的发生，促进水稻稳产、增收，改善和提高水稻的产量和品质。

Description

贝莱斯芽孢杆菌MES861及其应用和产品

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体提供贝莱斯芽孢杆菌MES861及其应用和产品。

背景技术

水稻是我国第一大食粮作物，但是目前部分地区还存在秧苗长势差的难题，主要表现为病秧、弱秧。其中，在旱育秧条件下，立枯病成为旱育稀植技术的最大障碍，正常条件下立枯病的发病率在15%左右，因为气候、管理等方面的起因，毁灭性发病情况也时有发生。该病害是由于受多种不利环境的因素影响，导致秧苗的抗病能力降低，从而易被镰刀菌、立枯丝核菌等病菌侵入引起发病。

水稻立枯病属于土传病害，是由多种病原菌侵染而引起的，病原菌主要有半知菌亚门瘤座菌目镰孢菌属Fusarium oxysporium Schelcht（尖孢镰孢菌）、Fusariumgraminearum Schw.（禾谷镰孢菌）、Fusarium equiseti Sacc.（木贼镰孢菌）、Fusariumsolani（Mart.）App. et Wr. （茄腐镰孢菌）、Fusarium moniliforme Scheld（串珠镰孢菌）及无孢目、丝核菌属的Rhizoctonia solani Kühn.（立枯丝核菌）等，还有鞭毛菌亚门霜霉目腐霉菌属的Pythium spp. (腐霉菌) 等真菌。镰孢菌一般以菌丝和厚垣孢子在多种寄主的病残体及土壤中越冬，环境条件适宜时产生分生孢子借气流传播，侵染为害。丝核菌则以菌丝和菌核在寄主病残体上和土壤中越冬，靠菌丝蔓延于幼苗间传播，进行侵染为害。

常规防治方法采用选择疏松通气，保水保肥力强的床土，土壤酸化处理、化学农药等方法防治病害的发生。通常这些操作较为繁琐且化学农药会造成农药残留等问题，降低农产品的质量和品质，同时造成环境污染，不符合绿色可持续性发展的道路和方向。

微生物能有效防治植物病害的发生，同时利用拮抗微生物进行植物病害的防治符合绿色防控的发展方向。然而，目前未见有贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）防治水稻立枯病的报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌MES861，该菌株能拮抗禾谷镰刀菌，防治水稻立枯病。

本发明所提供的的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）MES861，是发明人从国药集团半夏种植基地土壤中分离获得，已于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.16857。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌MES861可用于拮抗禾谷镰刀菌或制备拮抗禾谷镰刀菌产品。

发明人经试验研究发现，贝莱斯芽孢杆菌MES861对强致病力的禾谷镰刀菌具有显著的拮抗效果，拮抗效果达92.8%，而禾谷镰刀菌作为水稻立枯病的主要致病菌，所以本发明的贝莱斯芽孢杆菌MES861对水稻立枯病具有防治作用。

本发明还包括贝莱斯芽孢杆菌MES861在防治水稻立枯病或制备防治水稻立枯病产品中的应用。

发明人通过试验证实贝莱斯芽孢杆菌MES861对水稻立枯病具有显著的防治效果，可以作为防治水稻立枯病的生防菌种，具有广阔的开发利用前景。

本发明还保护一种含有贝莱斯芽孢杆菌MES861微生物菌剂，可以理解的是，该微生物菌剂中还可以含有其他的有利于水稻病害的菌株，与贝莱斯芽孢杆菌MES861可以协同作用，用于水稻种植防治病害，在此不做特定的限定。微生物菌剂的剂型可以为粉末制剂或液体制剂，当为粉末菌剂时，为了防治效果，有效活菌数cfu优选为不小于2.0×10¹⁰个/g。

本发明还保护该微生物菌剂在拮抗禾谷镰刀菌或制备拮抗禾谷镰刀菌产品中的应用，以及，在防治水稻立枯病或制备防治水稻立枯病产品中的应用。

本发明还提供上述任一种微生物菌剂的制备方法，贝莱斯芽孢杆菌MES861经液体培养得到微生物菌剂。

在一些实施方式中，具体步骤如下：

（1）一级种子培养：将经试管斜面活化的贝莱斯芽孢杆菌MES861进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为NB培养基。

NB培养基配方为：蛋白胨8-13克，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度 22℃-30℃，培养24 h。

（2）发酵:在30 m³扩发酵罐中装有20 L液体发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40 min后冷却到35℃，将一级种子接种于液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26 h。

液体发酵培养基的原料及用量为:葡萄糖2%，酵母浸粉0.5%，氯化钾0.75%，pH值为7.0-7.5。

（3）至芽抱形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到微生物菌剂。

可选步骤如下：

（4）将液体发酵液在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，装入包装袋内。

（5）检测计数，贝莱斯芽孢杆菌产品有效活菌数（CFU）≥2.0×10¹⁰个/g。

本发明贝莱斯芽孢杆菌MES861对引起水稻立枯病菌的禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）拮抗效果明显，能防止或减轻水稻立枯病的发生，促进水稻稳产、增收，改善和提高水稻的产量和品质。

将本发明的微生物菌剂用在秧苗期盆栽防治水稻立枯病，防效明显，防治效果达80%以上，并且属于绿色环保制剂、安全无残留、降低农药使用量及降低农业生产成本、大面积推广使用的前景十分广阔。本发明提供的微生物菌剂为粉末制剂，在使用时，可按菌粉和种子比1：10-1：50的比例拌种使用，也可在定植时沟施、穴施拌肥基施，稀释100-500倍后进行沟施、穴施、灌根，每亩用量2-5kg。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3中贝莱斯芽孢杆菌MES861对禾谷镰刀菌的拮抗效果，其中，A图为实验组，B图为对照组。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1 菌株的分离与鉴定

国药集团半夏种植基地土壤经稀释、划线培养、在28℃培养24小时后，经5次纯化后制成斜面菌种，挑取2支斜面送农村农业部微生物质检机构鉴定，确定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），在4℃和-80℃冰箱保藏。

经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rDNA测序比对，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，命名为MES861，16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株革兰氏染色阳性细菌，内生孢子椭圆形，属于芽孢杆菌属。

部分生理生化反应结果为：过氧化氢酶阳性，接触酶阳性，脂酶阳性，明胶液化阳性，不能运动，吲哚阳性，V-P反应阴性，分解淀粉，以及，不分解纤维素。

16S rDNA具体序列如下：

TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAA（SEQ ID NO.1）。

得到的贝莱斯芽孢杆菌MES861于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16857。

实施例2 微生物菌剂的制备

（1）一级种子培养：将经试管斜面活化的贝莱斯芽孢杆菌MES861进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为NB培养基。

NB培养基配方为：蛋白胨8-13克，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度 22℃-30℃，培养24 h。

（2）发酵:在30 m³扩发酵罐中装有20 L液体发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40 min后冷却到35℃，将一级种子接种于液体发酵培养基中，控制罐压在0.02 Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26 h。

液体发酵培养基的原料及用量为:葡萄糖2%，酵母浸粉0.5%，氯化钾0.75%，pH值为7.0-7.5。

（3）至芽抱形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到微生物菌剂。

（4）将液体发酵液在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，装入包装袋内。

（5）检测计数，贝莱斯芽孢杆菌产品有效活菌数（CFU）≥2.0×10¹⁰个/g。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌MES861对水稻立枯病的抑菌试验

（1）供试菌种来源

水稻立枯病菌BYJ-03分离自黑龙江二道河农场水稻病种子，经公司研发人员培养、分离、纯化，经16S rDNA最终鉴定为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），经致病力测定鉴定为强致病力。

（2）平板拮抗实验

制备PDA固体平板，用无菌接种针挑取少量的禾谷镰刀菌放在培养皿中间，烧红接种针，等接种针冷却后蘸取少量的贝莱斯芽孢杆菌MES861接种在距接种病原菌菌斑2.0厘米的四周，设置不接种贝莱斯芽孢杆菌只接种禾谷镰刀菌的处理为空白对照，每个处理设置三次重复。28℃恒温培养，待空白对照菌丝长满整个培养皿时，测量仅接种禾谷镰刀菌的对照菌落面积（菌落半径）和接种MES861后病原菌的菌落面积（抑制菌落半径），用拮抗效果表示（拮抗效果（%）=（对照菌落面积-处理菌落面积）/对照菌落面积×100）。

（3）拮抗效果

通过本实验发现贝莱斯芽孢杆菌MES861对禾谷镰刀菌的拮抗效果达92.8%；对照平均菌落半径为4.5 cm（图1中的B图），接种贝莱斯芽孢杆菌的平均菌落半径为1.4 cm（图1中的A图）。说明贝莱斯芽孢杆菌MES861对禾谷镰刀菌具有明显的抑制作用，具有防治水稻立枯病的生防潜力。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌MES861对水稻立枯病的盆栽防治效果

（1）微生物菌剂

实施例2制备的MES861固体制剂，用水分别按比例稀释1:10、1:20、1:30、1:50倍；

（2）化学药剂

70%敌克松可湿性粉剂700倍液（50 g药兑水35 kg）（山东天威农药有限公司）。

（3）空白对照

设置清水处理为空白对照。

（二）试验方法

处理设置：水稻品种为垦21，自带病菌，实验设置5个处理，分别为菌种比1:10、1:20、1:30、1:50和不加菌的对照处理。

实验方法：准确称取1g水稻，放入培养皿里，加入10 mL纯水浸没种子，在30℃培养箱里浸种4 h后，按照预先设计好的菌种比例准确称取复合功能菌粉，小心均匀地撒在浸过种的水稻种子上，混匀后在30℃培养箱里培养一天，待水稻种子露白后种植在水稻育秧基质中生长，观察变化。每隔3天浇40 mL自来水或者40 mL各浓度菌液，均匀浇在植株根部。30天后观察效果。

（四）结果

试验结果见表1，从结果可以看出，添加贝莱斯芽孢杆菌MES861菌粉的处理病情指数（8.16-8.35）显著低于空白对照处理后的病情指数（87.78），而与化学药剂处理后的病情指数（7.29）差异不显著，MES861对水稻立枯病的防治效果达83.89%-85.28%。说明贝莱斯芽孢杆菌MES861可作为防治水稻立枯病的生防菌种，具有广阔的开发利用前景。

表1 不同处理对水稻立枯病的防治效果

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SEQUENCE LISTING

<110> 天津开发区坤禾生物技术有限公司

<120> 贝莱斯芽孢杆菌MES861及其应用和产品

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1492

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌MES861 16S rDNA

<400> 1

tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60

gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120

actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc 180

agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240

ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360

atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420

ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa 480

ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540

gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600

cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660

ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720

gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 840

agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900

caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960

cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc 1020

gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080

aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140

ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200

atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260

taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380

tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440

atggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac aa 1492

Claims (2)

1.一种微生物菌剂在拮抗禾谷镰刀菌或制备拮抗禾谷镰刀菌产品中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂通过贝莱斯芽孢杆菌MES861经液体培养得到；

所述贝莱斯芽孢杆菌MES861于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16857；

所述液体培养的步骤为：在30 m³扩发酵罐中装有20 L液体发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40 min后冷却到35℃，将一级种子接种于液体发酵培养基中，控制罐压在0.02Mpa-0.07 Mpa，在35℃培养26 h，至芽抱形成比例大于等于90%时，结束发酵，放罐，得到微生物菌剂；

所述一级种子的培养步骤为：将经试管斜面活化的贝莱斯芽孢杆菌MES861进行安碚瓶培养，安瓿 瓶培养基为NB培养基；

所述NB培养基配方为：蛋白胨8-13克，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5，培养条件为：温度22℃-30℃，培养24 h。

2.权利要求1所述的微生物菌剂在防治水稻立枯病或制备防治水稻立枯病产品中的应用。

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