CN107937312A - 一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用，所述拮抗菌FJ17‑4分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14642。本发明还公开了所述拮抗菌发酵液在防治黄瓜疫病中的应用。本发明对减少化学农药的使用和减轻农业面源污染具有重要的作用。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用。

背景技术

由瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）侵染引起的黄瓜疫病（CucumberPhytophthora blight）黄瓜生产上的一种毁灭性土传病害，在黄瓜的整个生育期均可发病，为害植株的叶、茎、根和果实。该病害具有传播速速快、侵染力强等特点，若刚发病时疏于防治，一旦流行则很难控制，可造成黄瓜大面积死亡，造成的直接经济损失十分严重，轻者减产30%-50%，严重时全田绝收。近年来，随着我国黄瓜设施栽培技术的迅速发展，设施条件为黄瓜生长提供了适宜的温、湿度，但适宜黄瓜生长的温、湿度条件也适宜黄瓜疫病的发生与流行，因此黄瓜疫病发生呈逐年严重趋势，在全国各地均有不同程度的发生，受害较重的地区为南方地区的春黄瓜和北方地区的秋黄瓜，该病已成为制约黄瓜产量的重要因素之一。目前，黄瓜疫病的防治仍以化学防治为主，化学农药的大量、反复使用，不仅造成了病原菌抗药性的产生，致使化学药剂的防治效果越来越差，而且化学药剂对环境存在一定的危害，可污染水体、大气和土壤，并残留在农产品中，危害人类健康。因此，植物病害的绿色防治技术的开发与利用是现代农业可持续发展所迫切需求的，利用有益微生物防治植物土传病害是植物病害绿色防治关键技术之一，并取得了一定的成果，一些生物农药也相继问世。

本发明从健康黄瓜根部土壤中分离到一株对黄瓜疫病菌具有较高拮抗能力的细菌，经微生物分类学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。本发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，同时对对促进黄瓜产为的健康生产发展、增加瓜农收入、保障消费者健康、减少环境污染和维持农业可持续发展具有重大的理论和生产意义。

发明内容

本发明目的在于针对黄瓜疫病防治中化学农药大量使用造成了病原菌抗药性产生、污染环境和农产品农药残留等一系列问题，提供了一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

从福建福州、福安、霞浦及三明等黄瓜种植地采集健康黄瓜根部土样，采用平板稀释法对所采集土样中的细菌进行分离，所使的培养基为LB（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2）。根据不同菌落形态，对所分离细菌进行纯化，共分离纯化得到326株细菌。然后以黄瓜疫病菌为目标病原菌，采用平板对峙培养法对所纯化细菌对黄瓜疫病菌的拮抗能力进行测定，得到对黄瓜疫病菌具有拮抗作用初筛细菌18株。通过室内盆栽试验，进一步对初筛菌株的防病能力进行评估，最终得到具拮抗作用又有盆栽防治作用的菌株6株。综合拮抗和盆栽防病能力，选取FJ17-4拮抗菌为代表，通过形态学、生理生化及分子生物学16s rDNA鉴定，所分离菌株FJ17-4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），已于2017年9月18日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14642。

上述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在防治黄瓜疫病方面的应用。

所述黄瓜拮抗菌FJ17-4发酵液对黄瓜疫病具有较好的防治效果，黄瓜拮抗菌FJ17-4发酵液制备：将FJ17-4菌株接种种到LB培养液（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2）中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.5～0.8，获得种子液，测定过程中以未接菌的培养液来调零。将种子菌液以1:100体积比加入发酵培养基中扩大培养，培养条件为28℃，180rmp，培养时间为24小时。培养结束后，采用稀释液涂平板计算细菌菌落数法检测发酵中菌体的数量，并将发酵液中菌体浓度调到1×10⁹～10¹⁰CFU/mL，获得所述生防菌剂。发酵培养基为玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉2.0%，黄豆粉2.0%，NaCl 0.5%，MnSO4·H2O 0.8%，其余为水，pH 7.2。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对黄瓜疫病菌具有较低好的拮抗作用，可用于黄瓜疫病的生物防治，对减少化学杀菌剂的使用、降低农药污染和避免病原菌抗性产生及减轻农业面源污染具有重要的作用。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的菌落形态。

图2为拮抗菌FJ17-4菌体的扫描电镜观察图。

图3为菌株FJ17-4基于16SrRNA基因序列比对结果以Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446 (AJ496806)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。

图4为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对黄瓜疫病菌的平板拮抗效果。

图5为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬浮液对黄瓜疫病的室内盆栽防治效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1 拮抗菌FJ17-4获得及鉴定

从福建福州、福安、霞浦及三明等黄瓜种植地采集健康黄瓜根部土样，采用平板稀释法对所采集土样中的细菌进行分离，所使的培养基为LB（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2）。根据不同菌落形态，对所分离细菌进行纯化，共分离纯化得到326株细菌。然后以黄瓜疫病菌为目标病原菌，采用平板对峙培养法（图4）对所纯化细菌对黄瓜疫病菌的拮抗能力进行测定，得到对黄瓜疫病菌具有拮抗作用初筛细菌18株。通过室内盆栽试验，进一步对初筛菌株的防病能力进行评估，最终得到具拮抗作用又有盆栽防治作用的菌株6株。综合拮抗和盆栽防病能力，选取FJ17-4拮抗菌为代表，通过形态学、生理生化及分子生物学16s rDNA鉴定，所分离菌株FJ17-4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。其形态学特征如图1所示：菌株革兰氏染色呈阳性；在LB培养基平板上，菌落表面扁平，粗糙不透明，乳白色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，菌落中央凹状突起（图1）；扫描电镜观察其菌体呈短杆状（图2），最适生长温度为28℃；其生理生化特征如表1-表3所示，其16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示，基于16SrRNA基因序列比对结果系统发育树如图3所示。

表1 菌株FJ17-4 生理生化特性-酶活、碳源氧化

+：阳性反应； -：阴性反应；W：弱阳性反应

表2 菌株FJ17-4 生理生化特性-利用碳源产酸

+：阳性，-：阴性，w：弱阳性

表3 菌株FJ17-4 生理生化特性-碳源利用

+：阳性，-：阴性，w：弱阳性

实施例2：FJ17-4菌株对黄瓜疫病菌的拮抗活性

用对峙培养法，将保存于4℃中的黄瓜疫病菌接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为5 mm的圆形菌块。将菌丝块接种在改良的NB培养基平板（蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH=7.2）中央，在其四周距中心约25mm处分别接种FJ17-4，试验以清水为对照组。25℃培养，待菌丝长满平板后观察并记录抑菌圈的大小。

根据抑菌圈的大小对FJ17-4拮抗黄瓜疫病菌的活性进行评估：0 mm，无抑制作用；＜2mm，有轻微的抑制作用；2-5mm，中等抑制作用；＞5mm，较强的抑制作用。根据病原菌在拮抗菌方向上的生长直径，计算FJ17-4对黄瓜疫病菌的抑制率，抑制率算法如下：抑制率=[(50-R)/50]×100%，其中，因为黄瓜疫病菌菌丝块接种于平板中央，而拮抗菌接种点离菌丝块的距离为25mm，在拮抗菌没有任何拮抗作用的条件下，病原菌生长至拮抗菌接种点的菌落直径应为50mm，R为病原菌在细菌方向的菌落半径。

检测结果见图4。由图4可见，生防菌FJ17-4对黄瓜疫病菌生长具有较强的抑制效果，抑制带为13mm，菌丝抑制率为48%。与阴性对照清水处理组相比，拮抗效果十分明显。

实施例3： FJ17-4菌株对黄瓜疫病的防治效果

1）生防菌剂的制备

将FJ17-4菌株接种到LB培养液（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2）中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.7，获得种子液，测定过程中以未接菌的培养液来调零。将种子菌液以1:100体积比加入发酵培养基中扩大培养，培养条件为28℃，180rmp，培养时间为24小时。培养结束后，采用稀释液涂平板计算细菌菌落数法检测发酵中菌体的数量，并将发酵液中菌体浓度调到1×10¹⁰CFU/mL，获得所述生防菌剂。发酵培养基为玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉2.0%，黄豆粉2.0%，NaCl 0.5%，MnSO₄·H₂O 0.8%，其余为水，pH 7.2。

）室内盆栽试验防治效果

将津研4号黄瓜品种播种于育苗盘中，将出苗后每穴留1株，待黄瓜苗开至4片真叶时，拔起黄瓜苗，并尽量将根部土壤抖尽，然后将根浸于孢子囊浓度为1×10⁶ 个/mL的黄瓜疫病菌孢子悬浮液中5min后，即获得了接种黄瓜疫病菌的黄瓜苗，将已接种的黄瓜苗移栽于内径为90mm的花盆中，每盆种2株，24小时后，将FJ17-4菌株发酵液（菌体浓度为1×10¹⁰CFU/mL）浇灌于已接种黄瓜疫病菌的黄瓜苗根部，每株50mL，以58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液为处理对照，即一组处理为将700倍58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂液体浇灌于已接种黄瓜疫病菌的黄瓜苗根部，每株50 mL；以不作任何处理的已接种黄瓜疫病菌的黄瓜苗为空白对照。6天后，统计各处理组的发病率，计算防治效果。发病率（%）=（发病株数/总调查株数）×100%，防治效果（%）=[（空白对照发病率-处理发病率）/空白对照发病率]×100%。

由图5和表4可见，FJ17-4菌株菌悬液和58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液液对室内盆栽试验的黄瓜疫病具有一定的防治效果，防治效果分别为76.00%和73.00%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果高于58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液的防治效果。

表4 拮抗菌FJ17-4菌悬液对黄瓜疫病的室内盆栽防治效果

3）大田防治效果

大田防治试验选择在往年黄瓜疫病发生较为严重的福州市闽清县云龙乡官庄村进行。在黄瓜（品种：津研4号）疫病发病初期进行喷雾处理，试验设计与室内盆栽试验基本相同，设为3组，第1组使用FJ17-4菌株菌悬液进行喷雾处理，施药量以叶片滴水为准，第2组使用58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液进行喷雾处理，施药量以叶片滴水为准，第3组使用清水喷雾为对空白对照。每隔7天施用1次，时间分别为2017年5月12日、5月19日和5月26日，共3次，最后1次结束12天后（2017年6月7日）调查田间黄瓜疫病的发率株数，根据病发株数，计算发病率和各个处理的防治效果。

从表5可见，贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌株菌悬液和58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液对田间（大田）的黄瓜疫病也具有一定的防治效果，防治效果分别为69.44%和62.40%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果高于58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂700倍液的防治效果，显示出较好的应用前景。

表5 拮抗菌FJ17-4菌悬液对黄瓜疫病的田间防治效果

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> 16s rDNA序列

<400> 1

gggcggcgtg cctatacatg cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc 1260

tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt taggagccag ccgccgaagt 1440

ggaccta 1447

Claims (2)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌在防治黄瓜疫病中的应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）FJ17-4，已于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14642。