CN106995791A - 一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌bs193及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌菌株BS193及其应用，属于农作物病害防治技术领域。所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS193，已于2017年3月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 13936。该菌株通过产生活性物质抑制马铃薯晚疫病病菌的生长，对马铃薯晚疫病表现出较好的防治效果。应用时可以在马铃薯植株喷雾或灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。本发明所述的枯草芽孢杆菌菌株BS193是从番茄植株体内分离获得，属于内生菌，无毒、无致病性，因此在马铃薯晚疫病的生物防治中具有良好的应用前景。

Description

一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌BS193及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治马铃薯晚疫病的生防菌株枯草芽孢杆菌BS193及其应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术

由晚疫病菌（Phytophthora infestans (Mont)de Bary）引起的晚疫病是马铃薯生产上一种毁灭性的病害，在世界各马铃薯主产区均有发生和流行，严重威胁着马铃薯的生产，其造成的危害、防治难度及对社会影响已超过水稻稻瘟病和小麦条锈病，被视为国际第一大作物病害。晚疫病在我国发生普遍而严重，每年因感晚疫病造成约80亿元人民币的经济损失，已成为限制我国马铃薯生产和实现产业化的第一大障碍。

目前为止，晚疫病防治主要还是培育抗病品种和大量使用化学农药。其中培育抗病品种仍然是防治疫病最成功的措施，但是晚疫病菌毒性组成具多变异性特点，导致利用主抗基因育成的抗病品种抗性丧失，而在短时间内筛选并培育出具有抗新疫病的新品种是非常困难的。化学农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但长期对化学农药的使用会带来许多负面影响。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，还出现生态环境被破坏、人畜和有益生物中毒、化学性物质在粮食和饲料中残留量大大超标，影响人畜生存质量等诸多问题，许多国家和地区已经相继禁止了一些高毒、高残留化学农药的生产和使用。在当今人们越来越关注自己的生存环境，以及越来越提倡绿色生活的时代，探索有效的生防措施无疑具有重大的理论和现实意义。

芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。许多性状优良的天然分离株已成功应用于植物病害的生物防治。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌及卵菌所引起的植物病害。枯草芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌,其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境,能产生多种抗菌素和酶具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。

枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征，而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，并且批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，现已成为一种理想的生防细菌。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前马铃薯晚疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治马铃薯晚疫病的生防枯草芽孢杆菌及其应用方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌菌株BS193，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2017年3月27月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 13936。

所述的枯草芽孢杆菌BS193菌剂的制备过程如下：

将所述的菌株接种于LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min，培养20 h，制成种子液。取10ml种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1L，溶解并调pH为7.0。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量5% ( v /v)、装瓶量200mL /500mL、发酵培养基pH值7.0、37 ℃，200 r/min，培养48 h，制成浓度为10⁸ CFU/ml的BS193菌株发酵液。

所述的枯草芽孢杆菌BS193菌剂在防治马铃薯晚疫病中的应用方法如下：

可在马铃薯植株喷雾或灌根使用。连续使用2-3次，每次间隔7~10天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。

本发明有益效果：

本发明筛选出的枯草芽孢杆菌BS193能够明显抑制马铃薯晚疫病菌的生长。由于该菌株分离自番茄植株体内，属于内生菌，是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染，且能有效防治马铃薯晚疫病。

本发明枯草芽孢杆菌分离自植株体内，容易在体内定植，有利于充分发挥菌株的优势。本发明枯草芽孢杆菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1菌株BS193发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝的影响（光学显微镜下200×）。

图2菌株BS193发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝的影响（电子显微镜7000×）。

图3菌株BS193对马铃薯晚疫病菌的拮抗测定。

图4菌株BS193发酵液对马铃薯晚疫病菌的平板抑菌效果图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一：菌株BS193的鉴定

1、菌株来源

菌株BS193从健康的番茄叶片上分离获得。将番茄叶片用自来水洗净晾干后，选取适量叶片组织，再用蒸馏水清洗3次、75%乙醇消毒3 min，用无菌水清晰3次，升汞处理10-15min，再无菌水清洗3次。在无菌研钵内加入10 mL无菌水和灭菌石英砂，研磨成匀浆，加盖静止30min后，用移液枪吸50 μL上清液于NA培养基上涂板，48 h后长出菌落进行纯化保藏。

、形态特征观察

将菌株BS193划线接种在LB培养基(10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水溶解并调pH为7.0-7.2，补加双蒸水定容至1000 ml,高压灭菌备用。)上，30℃培养48 h 后进行形态特征观察：菌株BS193 革兰氏阳性，杆状，末端圆；（0.6～0.8）×（1.5～3.0）微米；无荚膜，不成链，能运动；芽孢椭圆形至柱状，中生或次端生，（0.6～0.9）×（1.0～1.5）微米，椭圆形，中生或次端生。菌落粗糙，不透明，粘着，扩展。

、序列分析与分子鉴定

基因组提取试剂盒提取菌株BS193基因组DNA后，采用通用引物进行 16S rDNA 的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1509 bp（SEQ ID No.1）。将所得序列提交到GenBank 数据库进行BLAST分析比对，发现与BS193同源性较高的菌株均属于枯草芽孢杆菌，并结合形态学特征和培养特征，将菌株BS193鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。

实施例二：菌株BS193拮抗测定

采用平板对峙培养法，将菌株BS193对马铃薯晚疫病菌作拮抗测定，首先在黑麦培养基平板中央接入马铃薯晚疫病菌菌丝块，待马铃薯晚疫病菌菌落长至3cm时，在菌落4周点接上菌株BS193，25℃下培养15天后测量菌株BS193对大豆疫霉菌的抑菌带宽度，实验结果筛选测定表明菌株BS193对马铃薯晚疫病菌具有较好的拮抗作用（图3）。

实施例三：菌株BS193发酵液防效试验

BS193菌株发酵液（10⁸cfu / mL），8000r/min离心20min，分别收集其菌体沉淀和上清液。菌体沉淀利用无菌水清洗多次后，再用无菌水配成与原发酵菌液等体积的菌体悬浮液。马铃薯播种于盛有无菌土壤的营养钵中，每盆种植四株。分别用20 mL 菌株培养液、菌体悬浮液、无菌滤液灌根处理，24 h后接种10 mL 疫霉菌孢子悬浮液液（孢子囊浓度1×10⁴/mL）。每处理重复3次，以清水和LB培养基处理后接种马铃薯晚疫病霉菌为对照，保湿处理。接种3 d后调查发病情况。

病情分级标准如下：

0级：接种部位无变化或稍变褐；

1级：接种部位产生病斑，病斑面积占茎部面积的1/4以下；

3级：接种部位病斑面积占茎部总面积的1/4～1/2左右；

5级：接种部位病斑占茎部面积的1/2以上；

7级：接种部位病斑连片，已形成绕茎现象，但植株并没萎蔫或枯死；

9级：植株萎蔫或枯死。

病情指数（%）=[（病级数×该病级植株数)／(最高病级数×总植株数)]×100%

防治效果（%）=[(对照病情指数－处理病情指数)／对照病情指数]×100%（对照指清水对照处理）

实验结果表明（表1），供试菌株BS193发酵液能够显著降低马铃薯晚疫病的病情指数，防治效果高达75.51%，温室盆栽实验结果说明，菌株BS193能够有效防治马铃薯晚疫病，展现出良好的应用潜力。

表1 菌株BS193处理后不同间隔时间接种马铃薯晚疫病菌的防病效果

注：表中数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌BS193及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌BS193的16SrDNA序列

<400> 1

agagttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60

gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120

ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa 180

ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc 240

attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg 300

gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 360

aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc 420

ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg 480

acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg 600

atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag 660

aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 720

gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 780

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt 840

ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900

agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg 1020

acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1140

gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200

tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa aggcagcgaa 1260

accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 1320

gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1380

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttc gtaacacccg aagccggtga 1440

ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac 1500

aaggtaacc 1509

Claims (5)

1.一种防治马铃薯晚疫病的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS193，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年3月27日，保藏号为CGMCC No. 13936。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株制备的生防菌剂。

3.权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：将所述的菌株接种于LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min，培养20 h，制成种子液；取10ml种子液接种于发酵培养基中；发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000mL，并调pH为7.0，发酵条件为：接种量5% ( v /v)、装瓶量200mL /500mL、发酵培养基pH值7.0、37 ℃，200 r/min，培养48 h，制成浓度为10⁸ CFU/ml的BS193菌株发酵液。

4.根据权利要求2所述生防菌剂的应用，其特征在于，所述菌剂在马铃薯植株喷雾或灌根使用，连续使用2-3次，每次间隔10天；或将菌剂与有机肥混合制成菌肥使用。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在马铃薯晚疫病生物防治中的应用。