CN105907662A

CN105907662A - 枯草芽胞杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105907662A
Application number: CN201610218211.1A
Authority: CN
Inventors: 王�琦; 张珣; 周莹莹; 李燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2016-08-31

Abstract

本发明公开了一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，其中枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为CGMCC NO.9870。本发明的枯草芽胞杆菌菌株，具有较广的抑菌谱，本发明利用发酵生产的菌剂既能防病，又能保护环境，减少化学农药的残留，在可持续农业发展中应用前景广阔。

Description

枯草芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。

背景技术

葡萄是我国重要的果树树种，我国葡萄种植面积和产量均位居世界前列。但种植现状却不容乐观，特别是病虫害种类多、危害严重，农药使用次数多、使用量大。葡萄霜霉病是鲜食和酿酒葡萄上最为严重的世界性病害。引起葡萄霜霉病的病原菌是Plasmoparaviticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni,属鞭毛菌门、霜霉目、单轴霉属真菌，是专性寄生菌。该病原菌主要侵染葡萄叶片，也可侵染花序和幼果。

化学农药防治仍然是目前防治葡萄霜霉病的主要方法，被果农广泛接受，但施药次数过多带来了许多严重问题。化学防治不仅增加了生产成本，而且造成环境污染和果实残毒，降低了葡萄及其加工产品的品质，也降低了葡萄和葡萄酒质量；随着杀菌剂大量和频繁使用，病菌的抗药性问题在世界各地接连出现；农药在抑制病原菌的同时，也使微生物活动受阻，有益生物量减少。

随着人们对食品安全和环境保护意识的增强，对农药残留、病菌抗药性等问题认识逐渐深入，对寻找和开发安全高效的杀菌剂要求日益迫切。所以生物防治因其对环境和动物有较好的安全性而逐渐成为人们所关注的焦点和热点，尤其是芽胞杆菌在植物病害防治中的应用倍受人们的青睐。

植物内生菌是指，那些生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时的)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生，包括一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生真菌、细菌、防线菌等一类微生物。葡萄内生细菌的研究从20世纪90年代开始陆续有报道，已有研究结果显示，葡萄内生细菌表现出丰富的多样性，具有防病、促生、对环境胁迫抗性等生物学作用。

芽胞杆菌生理特征丰富多样，分布极其广泛，极易分离培养，是土壤和植物体、根际的重要微生物种群。具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用；芽胞杆菌突出的特征是能产生耐热、抗逆的芽胞，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。批量生产上工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种较理想的生防微生物。芽胞杆菌在抑制病原菌的过程中有多种机制参与其中，主要包括抗生作用，竞争作用，诱导抗性及微生态调控等机制。近年来，已有不少文章陆续报道了芽胞杆菌对多种葡萄病原真菌具有拮抗作用，如利用芽胞杆菌防治葡萄灰霉病、白粉病、枝干病害等。筛选有效防治葡萄霜霉病的芽胞杆菌并探究其生防机制为葡萄霜霉病生物防治提供有效的菌株和重要指导意义，为葡萄及葡萄酒的安全生产奠定了一定的基础。

发明内容

本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的目的是提供一种枯草芽胞杆菌GLB191，该枯草芽胞杆菌存在于葡萄叶片中，其无菌代谢液发挥主要生防作用，属于葡萄内生细菌。

根据本发明的一个方面，提供了一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为CGMCC NO.9870。

其中，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191为葡萄内生细菌。

其中，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191可分离于葡萄植株的健康叶片中。

其中，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病菌、葡萄蔓枯病菌、苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、苹果黑腐皮壳菌、粉红单端孢、链格孢果生链核盘菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、胶孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌、茄链格孢菌、棉花黄萎病菌在内的致病菌的拮抗菌。

其中，枯草芽胞杆菌GLB191的16S rRNA基因序列为：

其中，gyrA基因序列为：

根据本发明的另一个方面，提供了一种菌剂，其包含如权利要求1～4的任意一项的枯草芽胞杆菌GLB191。

其中，菌剂包括枯草芽胞杆菌GLB191的发酵液、无菌代谢液中的一种或两种。

根据本发明的第三个方面，提供一种如权利要求1～4的任一项枯草芽胞杆菌GLB191或如权利要求5的菌剂在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、马铃薯病害、草莓病害和棉花病害中的用途。

其中，葡萄病害包括葡萄霜霉病。

本发明具有以下有益效果：

(1)与现有的枯草芽胞杆菌相比，本发明提供的枯草芽胞杆菌菌株GLB191，具有较广的抑菌谱，对葡萄、梨、辣椒、马铃薯、草莓和棉花等多种作物的致病菌均具有较强的拮抗活性。

(2)本发明提供的枯草芽胞杆菌菌株GLB191，特别对葡萄的霜霉病具有良好的生防作用，其对葡萄霜霉病的实验室生防效果可以达到69.0％，田间防效可达82.2％。

(3)本发明提供的菌剂，属于生物防治菌剂，能够减少化学农药的施用，避免环境污染，促进可持续农业的发展。

附图说明

并入到说明书中并且构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且与描述一起用于解释本发明的原理。在这些附图中，类似的附图标记用于表示类似的要素。下面描述中的附图是本发明的一些实施例，而不是全部实施例。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是枯草芽胞杆菌GLB191菌株在LB培养基平板上的培养形态；

图2是枯草芽胞杆菌GLB191与相关菌株的16S rRNA系统发育树；

图3是枯草芽胞杆菌GLB191与相关菌株的gyrA系统发育树；

图4是霜霉病侵染的葡萄植物的离体叶片；

图5是枯草芽胞杆菌GLB191菌株对葡萄霜霉病菌的离体叶片筛选图片；

图6是实验点1的枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病的田间防治效果图；

图7是实验点2的枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病的田间防治效果图；

图8是枯草芽胞杆菌GLB191的发酵液、菌悬液和无菌代谢液对葡萄霜霉病的防治效果对比图。

图9是枯草芽胞杆菌GLB191的发酵液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌发图片；

图10是枯草芽胞杆菌GLB191的无菌代谢液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌发图片；

图11是正常萌发的葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌发图片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例附图，对本发明的技术方案的实施例进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1：枯草芽胞杆菌GLB191的分离及筛选方法

(1)样品采集：

样品采集自全国13个葡萄主产区的主栽葡萄品种叶片，用低温箱保存带回实验室，24小时内完成内生细菌的分离。样品采集地点及时间见表1。

表1样品采集地点及时间

(2)枯草芽胞杆菌菌株GLB191的获得：

表面消毒：取新鲜的葡萄叶片，用无菌水冲洗干净，分别用70％乙醇(20s)、2％次氯酸钠溶液(3min)、70％乙醇(20s)处理，再用无菌水冲洗4次，取100μl第4次漂洗水涂布TSA平板，设3个重复，28℃恒温培养箱中培养4-5天，无菌落形成说明表面消毒彻底。

分离方法：称取表面消毒的葡萄叶片大约2.0g放入已灭菌的研钵中，加8mL无菌水和少量灭菌的石英砂充分研磨，静置1min，吸200uL悬浮液涂布TSA平板，设3个重复，28℃恒温培养箱中培养，待培养基里长出的菌落数平稳后，将菌落形态差异的菌株进行转管纯化并保存于4℃。

TSA培养基：每升培养基中含15g Tryptone(胰蛋白胨)，5g大豆蛋白胨，5g NaCl，15-18g琼脂；pH 7.2-7.4；121℃灭菌20min后备用。

LB液体培养基：每升培养基中含10g NaCl、10gTryptone(胰蛋白胨)和5g YeastExtract(酵母膏)；pH 7.2-7.4；121℃灭菌20min后备用。

LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入15g琼脂粉；121℃灭菌20min后备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL；121℃灭菌20min后备用。

芽胞杆菌GLB191菌株在LB培养基平板上的培养形态见图1。

(3)菌株GLB191的鉴定

通过对菌株GLB191 16SrRNA和gyrA基因序列的分析，如图2和图3所示，鉴定菌株GLB191为枯草芽胞杆菌，并在GenBank(美国国家生物技术信息中心的DNA序列数据库)上获取登录号分别为KR233009、KR233007。

实施例2：枯草芽胞杆菌GLB191的拮抗谱测定

在PDA培养基上相距3cm处分别接入制备好的病原菌饼作对峙培养，以单独接种各供试菌的菌饼为对照，置于培养箱25℃黑暗培养，每处理设3次重复。3d后测量菌落直径，计算供试菌株对病原菌生长的抑制率。结果显示枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄、梨、辣椒、马铃薯、草莓和棉花等多种作物致病菌具有较强的拮抗活性。枯草芽胞杆菌GLB191菌株的抑菌谱见表2。

表2枯草芽胞杆菌GLB191抑菌谱

其中，+,++和+++分别代表在PDA培养基中的抑菌效果的三个档次，即31～50％,51～70％和≥71％，注：表中的实验数据均为三次重复的平均值。

实施例3：枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病的实验室防治实验

从田间采回新鲜的葡萄霜霉病病叶，带回实验室过夜保湿培养，用毛笔将新鲜的孢子囊刷洗配制成1×10⁴个/mL的悬浮液待用。枯草芽胞杆菌GLB191接种LB液体培养基，180rpm摇陪至95％以上菌体产孢。取新鲜的葡萄叶片，打成1.5cm直径的叶盘，用芽胞杆菌菌悬液10倍稀释液浸泡处理30min，取出后在超净工作台晾干。在灭菌的空磁盘内铺4层用无菌水润湿的纱布，将晾干的叶盘放置于磁盘中，每盘放30个叶盘，保鲜膜封口保湿，以无菌水浸泡的叶盘为对照，每个处理设3个重复，20℃放置1天后喷施病原菌，20℃，98％相对湿度培养，从对照发病开始调查，记录各级病叶数及调查总叶数，结果见表4。

葡萄霜霉病调查分级标准见表3(GB/T 17980.122-2004)。

表2葡萄霜霉病分级调查标准

生防效果计算公式：

发病率(％)＝发病叶盘数/调查总叶盘数×100

病情指数＝∑(各级发病叶盘数×相对级数值)/(调查总叶盘数×9)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数－处理区病情指数)/对照区病情指数×100。

表4枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病离体叶片防效测定

处理	发病率/％	病情指数	防治效果/％
				GLB191	60.3	13.6	69.0
葡萄霜霉病菌	96.7	44.1	/

注：数据为三次重复的平均值

枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病的作用见图4和图5的对比。

实施例4：枯草芽胞杆菌GLB191田间防治试验

试验中所用到的生防菌剂芽胞杆菌GLB191在中农绿康(北京)生物技术有限公司发酵生产。

试验点1：天津市武清区天津农科院林果所，品种为鲜食葡萄玫瑰香，该果园葡萄霜霉病相对比较严重，选树龄在3年左右产量稳定的果树，每个处理约30棵果树。

试验点2：河北省怀来县中法庄园。品种为酿酒葡萄赤霞珠，该果园葡萄霜霉病每年都发生，选树龄在8年左右产量稳定的果树，每个处理约50棵果树。

处理：每个处理选树势大小一致的果树，设4个重复小区。在葡萄展叶后开始喷洒，叶片正反面喷雾处理，滴水为度，生防菌剂芽胞杆菌GLB191芽胞量为1×10⁸CFU/mL，生长季共喷施处理8次，间隔10天。

从对照发病开始调查，每隔7-8天调查一次，每个小区调查中间连续的 3株树，每株在上、中、下三个部位各选择1个枝条，调查全部叶片，记录各级病叶数及调查总叶数，葡萄霜霉病调查分级标准见表5(GB/T 17980.122-2004)，其中，试验点1的防治效果见图6和表6，试验点2的防治效果见图7和表6。

表5葡萄霜霉病分级调查标准

病级	分级标准
		0级	无病斑
1级	病斑面积占整个叶面积的5％以下
		3级	病斑面积占整个叶面积的6％-25％
5级	病斑面积占整个叶面积的26％-50％
		7级	病斑面积占整个叶面积的51％-75％
9级	病斑面积占整个叶面积的76％以上

生防效果计算公式：

病情指数＝∑(各级发病叶片数×相对级数值)/(调查总叶片数×9)×100

防治效果(％)＝(对照区病情指数－处理区病情指数)/对照区病情指数×100

表6枯草芽胞杆菌GLB191对葡萄霜霉病的田间防效

其中，需要说明的是，试验点1处理18d和试验点2处理19d的防效较低，是因为当时处于园间修剪期，对照组病枝被修剪，病情指数降低，防效降低，属特殊因素，不计为正常实验结果数据。

实施例5：枯草芽胞杆菌GLB191抑菌效果对比实验

制备枯草芽胞杆菌GLB191的无菌代谢液：将枯草芽胞杆菌GLB191接种LB液体培养基，180rpm摇陪发酵至95％以上菌体产孢，离心培养液，收集菌体和上清液，上清液过滤灭菌获得无菌代谢液。

制备枯草芽胞杆菌GLB191的菌悬液：将上一过程的得到的菌体用无菌水重悬获得菌悬液。

取新鲜的葡萄叶片，打成1.5cm直径的叶盘，分别用发酵液、无菌代谢液、菌悬液的10倍稀释液浸泡处理30min，取出后在超净工作台晾干。在灭菌的空磁盘内铺4层用无菌水润湿的纱布，将晾干的叶盘放置于磁盘中，每盘放30个叶盘，保鲜膜封口保湿，以无菌水浸泡的叶盘为对照，每个处理设3个重复，20℃放置1天后喷施病原菌孢子囊悬浮液，浓度1×10⁴个/mL，20℃，98％相对湿度培养，从对照发病开始调查，记录各级病叶数，计算病情指数，三种菌液对葡萄霜霉病的防治对比如图8所示。

由图8可以看出，在实验进行的第4～6天，发酵液和无菌代谢液均对葡萄霜霉病产生了明显的防治效果，而菌悬液则对葡萄霜霉病完全没有防治效用。

并且，根据扫描电镜进一步的观察发现，GLB191发酵液和无菌代谢液可以抑制孢子囊萌发，具体分别如图9和图10所示，图11为正常的孢子囊萌发的电镜图片，根据以上三幅电镜图片和上述实验结果的对比，大致可以推断，枯草芽胞杆菌GLB191防治葡萄霜霉病的原理，应该与GLB191分泌的某些胞外物质能够抑制病原菌Plasmopara viticola的孢子囊萌发有关。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

最后应说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为CGMCC NO.9870。

2.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌GLB191，其特征在于，

所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191为葡萄内生细菌。

3.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌GLB191，其特征在于，

所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191可分离于葡萄植株的健康叶片中。

4.如权利要求1所述的枯草芽胞杆菌GLB191，其特征在于，

所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病菌、葡萄蔓枯病菌、苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、苹果黑腐皮壳菌、粉红单端孢、链格孢果生链核盘菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、胶孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌、茄链格孢菌、棉花黄萎病菌在内的致病菌的拮抗菌。

5.一种菌剂，其包含如权利要求1～4的任意一项所述的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)GLB191。

6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，

所述菌剂包括所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191的发酵液、无菌代谢液中的一种或两种。

7.如权利要求1～4任一所述的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)GLB191或如权利要求5所述的菌剂在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、马铃薯病害、草莓病害和棉花病害中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，

所述葡萄病害包括葡萄霜霉病。