CN104017749B - 一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用 - Google Patents

Abstract

一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用，包括：(1) Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）野生型菌株NS04的筛选，正突变生防菌株NS04307的紫外线诱变和选育；(2)正突变株NS04307的抑菌稳定性；(3)正突变株NS04307生防菌剂的制备方法；（4）正突变株NS04307防治植物病害的应用。该生防菌剂具有杀菌谱广、效果好、病害不易产生抗药性、对人、畜、农作物安全和环境友好等特点，特别对石榴干腐病的田间防治具有较好的效果。另外对芝麻白绢病 （Sclerotium rolfsii）、苹果霉心病（Trichothecium roseum）、香蕉叶斑病菌喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、芝麻枯萎病（Fusarium oxysporum）、山茱萸褐斑病（Alternaria alternate）等15种不同病原菌的生长有显著的抑制活性。

Description

一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种具有高抗石榴干腐病菌活性的内生枯草芽孢杆菌正突变株NS04307及其制备以及防治石榴干腐病的应用。

背景技术

石榴干腐病是影响石榴产业的重要病害，其病原菌为石榴垫壳孢（Coniella granati (Sacc.)Petr.&Syd）异名：Zythia versoniana Sacc.，属于半知菌亚门（Deuteromycotina）、球壳孢目（Sphaeropsidales）。主要侵染果实和树干，也可以侵染石榴花器、果枝和新梢。病原菌的菌丝或分生孢子能够在病果、病枝、病果台上越冬，致使病果皮、病枝等成为初侵染源。当夏季雨水多时，石榴干腐病发病情况尤其严重，轻者石榴产量受影响，重者石榴树整枝或整株枯死。据统计，一般年份病果率达10%~40%，严重时病果率达到60%~80%，减产一般2~3成，高者达5成以上。此外，若贮藏期间湿度不适宜，造成大量烂果。可见，石榴干腐病严重影响了石榴的经济价值和观赏价值。

目前，国内外对石榴干腐病一般采取以农业防治技术为基础，化学防治技术为主导的综合防治措施。农业防治多采用清园、套袋、加强栽培管理等。化学防治主要喷施化学农药，常使用的农药有甲基托布津（Thiophanate-Methyl），加瑞农可湿性粉剂（Kasumin+Bordeaux）、代森锰锌（Mancozeb）、多菌灵（Carbendazim）、福美砷（Carbendazim）、石硫合剂（Lime sulfur）等。

    化学防治在短期内的确有效，但是化学农药造成的环境污染问题、病原菌抗药性问题和对人类健康的潜在威胁十分严重。我国耕地面积居世界第4位，但每年农药用量高达80～100万t，居世界之首。化学农药对环境的影响和破坏，尤其是对地下水和食品的污染问题已到了令人触目惊心的地步；由于化学农药的不合理使用，导致病原微生物产生抗药性，致使人们更频繁的喷施更多、更毒的农药，产生恶性循环，极大的破坏了生态平衡和生物的多样性。消费者对无公害农产品、绿色食品和有机食品的强烈需求，开发高效、低毒、无残留的生物农药已成为迫切希望。生物农药是指利用生物产生的生物活性物质或生物活体作为农药，以及人工合成的与天然化合物结构相同的农药，是不污染环境的绿色农药，可望成为解决化学农药残留污染的有效途径之一。

但是在微生物防治植物病害的相关研究中，活体微生物农药的有效性受到了田间环境的限制，很难在靶标部位定殖，影响杀菌效果。植物内生菌（Plant endophyte）作为生防菌株发展迅速并已成为当前微生物学研究领域的热点，其独具优势的特性使其成为植物病害生物防治的一类极具应用潜能的新型资源菌。现有研究发现植物内生细菌具有稳定的生存空间，它们与宿主植物之间的关系比宿主与土壤微生物及其附生菌更加密切。一些微生物能够分泌拮抗物质作用于病原菌的细胞膜、细胞壁、能量代谢系统及蛋白质合成系统，从而抑制或杀死病原菌。此外，内生细菌在植物体内占据了一定的生态位点从而阻止了病原菌的入侵和定殖；内生细菌还可以与病原菌竞争养分，使病原菌得不到营养供给而死亡。目前，关于大豆、水稻、小麦、棉花、香蕉、苹果、番茄、辣椒等作物的内生细菌研究的较多。但从植物组织内部筛选的内生菌一般抑菌效果较低，诱变育种是工业微生物育种的重要方向，而其中又以物理诱变方法中的紫外线辐射诱变使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及，因此，可以使用紫外诱变的方法选育高抗活性的正突变株，使内生生防菌在防治植物病害上有更大的应用潜力。目前有关石榴干腐病内生菌细菌的研究在国内外还属于空白。

综上所述，筛选有效的内生细菌，开发新型、安全有效的微生物杀菌剂，控制石榴干腐病的发生，是提高石榴产量，减少贮藏期石榴的损失，促进石榴产业经济可持续发展的迫切需要。

发明内容

本发明需要解决的问题是利用植物内生细菌资源开发一种可用于防治石榴干腐病及其它植物病害的广谱、高效、可产业化生产的内生枯草芽孢杆菌正突变株生防菌剂，提供由内生菌Bacillus subtilis NS04菌株为出发菌株选育的正突变菌株NS04307的方法，提供由正突变菌株NS04307制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种内生枯草芽孢杆菌正突变株，其特征是，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NS04307菌株，是一种防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于该菌株为一株植物内生细菌正突变株，由分离自石榴叶片内部组织NS04菌株（已于2014年1月26日日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8812）经紫外线诱变选育得到，编号为：NS04307，已于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8813。

[X1] 一种内生枯草芽孢杆菌正突变株的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（一）野生型内生菌株NS04的筛选

（1）内生菌株的分离和纯化

采集健康的石榴叶片称取3.0 g，自来水洗干净，用无菌水冲洗3次，无菌剪刀剪成4~5 mm见方的小块后，在超净工作台上，依次用75%的酒精浸泡5 s，0.1 %的升汞浸泡50 s，无菌水漂洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液1 mL进行梯度稀释至10^-5，从10^-3、10^-4、10^-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复。在37℃恒温培养箱中倒置培养24~48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24 h，4℃冰箱保存备用；

（2）内生生防菌株的筛选

采用平板对峙法测定内生细菌对石榴干腐病菌( Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先将石榴干腐病菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上28 ℃培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生细菌，以只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃恒温培养箱中培养，待对照皿中病原菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小；

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）；

通过石榴叶片内生菌的分离纯化和筛选，获得了一株对石榴干腐病菌有较好抑菌活性的内生菌菌株，抑制率为55.6%，编号为NS04；

（二）正突变菌株NS04307的制备

（4.1） 野生型菌株NS04生长曲线的测定

将活化后的出发菌株配成浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，取20 μl接入装有10 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，共接18支，置于37 ℃，150 r/min摇床震荡培养，从2 h后开始，每隔2 h取出一支试管放进4 ℃冰箱保存，等全部取完后，用分光光度计在625 nm波长下分别测其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照，每个处理3个重复。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制菌株生长曲线，确定其对数生长期。研究结果表明，NS04菌株的生长曲线呈S型，0~14 h为延滞期，对数生长期为16~24 h，26 h后进入稳定期，30 h后则进入衰亡期。故选择培养20 h对数期的NS04菌悬液进行诱变处理；

（4.2）致死率曲线的测定及野生型菌株的诱变

将NS04菌株接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃培养20 h，4 000 r/min离心10 min去上清，菌体用无菌生理盐水和0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.8)各洗涤一次后，调节菌液浓度约1×10⁸ cfu/mL。取33个培养皿，每皿加入5 mL上述菌悬液，每3个为1组，共11组。选用 20 W (照射距离30 cm)的紫外灯，预热30 min使波长稳定后，分别照射0 s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然后每皿吸取0.1 mL涂平板，37 ℃恒温培养24 h，待平板上长出菌落后计数。以不经紫外线诱变的平板为对照，依据下列公式计算出每个处理的致死率，以照射时间为横坐标、致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。

致死率(%) = [(对照组菌落数－紫外照射后菌落数) /对照组菌落数]×100%

采用紫外照射对细菌NS04进行诱变处理，在紫外灯功率和照射距离(保持30 cm)不变时，致死率仅与照射时间有关，且照射时间越长，诱变致死率越高。近年来研究认为，致死率在70%~80%时诱变效果较好。从致死率突变曲线可知，NS04菌株的诱变时间为260 s时致死率为75.87 %，因此选择260 s为NS04菌株最适诱变时间；

 (4.3) 突变菌株的筛选

采用琼脂块培养法进行突变株的筛选，采用平板对峙法检测突变株对石榴干腐病病原菌的抑菌活性。当石榴干腐病病原菌长满平皿时，用无菌接种环挑取石榴干腐病病原菌孢子，接在马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在其两侧3 cm处划线接种诱变菌株。在同样条件下接种出发菌株和只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃培养7 d后测病原菌菌落直径，观察平板抑制作用，并计算突变菌株与出发菌株对病原菌的生长抑制率；

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）；

经过筛选得到了正突变菌株NS04307，对石榴干腐病菌的平板抑制作用明显增强，其抑制率为80%，与出发菌株相比，抑制率提高了30.5%；

（4.4）正突变菌株NS04307的抑菌稳定性测定

将NS04307菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上传代，共传10次，并在相同条件下对每一代的菌株做平板对峙实验，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，该菌株对石榴干腐病的抑制率保持稳定，说明NS04307突变菌株对石榴干腐病菌的抑制作用能稳定遗传。

一种内生枯草芽孢杆菌正突变株在防治其他真菌病害中的应用，其特征是：所述的内生枯草芽孢杆菌突变株NS04307在防治芝麻白绢病（Sclerotium rolfsii）、苹果霉心病（Trichothecium roseum）、香蕉叶斑病菌喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、芝麻枯萎病（Fusarium oxysporum）、山茱萸褐斑病（Alternaria alternate）、香蕉褐缘灰斑病（Pseudocercospora musae）、玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、山茱萸叶枯病（Peyronellaea glomerata）、大叶黄杨炭疽病（Colletotrichum sp.）、山茱萸拟盘多毛叶斑病（Pestalotiopsis foedans）、甘蔗凤梨病（Thielaviopsis paradoxa）、玉米穗腐病致病性木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、玉米穗腐病致病串珠镰刀菌（Gibberella moniliformis）、玉米穗腐病致病层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）中的应用。

根据所述内生枯草芽孢杆菌正突变株制备的生防菌剂，其特征是，挑取活化的NS04307菌株，接种到10mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，37 ℃，180 r/min摇床培养，24 h，作为种子液；根据测定结果将种子液按1%（v/v）的比例接种于含200 mL PDB培养基的1L三角瓶中；37 ℃，180 r/min摇床培养，72 h，得到发酵液，将发酵液稀释10倍，浓度为1.3×10⁸ cfu/mL，再在发酵液中添加3%（W/V）表面活性剂OP-10，充分混匀后获得NS04307菌株的生防菌剂。

根据所述的内生枯草芽孢杆菌正突变株及其生防菌剂在防治石榴干腐病中的应用。 

根据所述的内生枯草芽孢杆菌正突变株及其生防菌剂在防治石榴干腐病中的应用，其特征是，包括以下两个方面：

（1）NS04307菌株室内果实离体防效试验：将NS04307生防菌于牛肉膏蛋白胨培养液37 ℃，180 r/min振荡培养72 h，4 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体用无菌水稀释至10⁸个/mL后备用；培养好的病原菌孢子用无菌水稀释至10⁸个/mL；将石榴果实表面用75 %酒精消毒处理并自然晾干；用灭菌的5孔接种针在石榴果实腰部等距离地刺2处伤口，喷雾接种生防菌菌悬液及病原菌孢子悬液；该试验设3个实验组，每组3个处理，处理1：先接病原菌孢子悬液，24 h后再接生防菌菌悬液；处理2：先接生防菌菌悬液，24 h后再接病原菌孢子悬液；处理3：先接病原菌孢子悬液，待伤口晾干后立即接生防菌菌悬液；每处理5个果实，重复4次，以只接病原菌的处理为对照组；待其自然晾干后，将各处理的果实置于28 ℃，RH 90 ％恒温恒湿培养箱中贮存，待接种9 d后观察并统计石榴干腐病的发病情况，用十字交叉法测定病斑直径，最后计算抑制率；结果表明：NS04307生防菌株各处理对石榴干腐病都有很好的防治作用；处理1的抑制率为75.08 ％，处理2和处理3对石榴干腐病的抑制率差异不显著，分别为53.80 ％和58.82 ％，说明NS04307菌株对石榴干腐病有很好的治疗作用和保护作用；

（2）NS04307生防菌剂大田防治石榴干腐病试验：于6月底7月初开始防治石榴干腐病，在所选的石榴园将上述制备好的生防菌剂进行喷施。试验采用随机化完全区组设计进行，从田间东、南、西、北和中部五个点选各取9株石榴果树，分为3组，每3棵树为1组，其中1组喷施NS04307生防菌剂，1组喷施60%代森锰锌可湿性粉剂，一组喷施清水作为对照。每隔10 d重复施药，连续3次，最后一次施药后第15d调查果实发病情况，对病害进行分级，计算病情指数和发病率。结果显示：NS04307菌株生防菌剂在大田对石榴干腐病的防效可达65.15%，极显著优于果农田间目前使用的化学药剂代森锰锌6.17%。

本发明采用的细菌是以分离自植物石榴叶片组织的内生细菌Bacillus subtilis NS04菌株为野生型菌株，按照常规方法以野生型NS04菌株为出发菌株，经紫外线诱变进行选育得到了高抗的正突变菌株，编号为NS04307。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期为2014年1月26日，保藏号为CGMCC NO 8813。

本发明按照常规方法制备，以正突变株NS04307作为生产菌株，通过液体发酵和在发酵液中添加表面活性剂，制备NS04307菌株的生防菌剂；通过室内平板实验，评价其对其它植物病原真菌菌丝生长的抑制作用；通过石榴果实离体防效试验、大田试验，评价其对石榴干腐病的防效。

本产品发明的优点及效果：本发明具有稳定的、高活性的内生正突变细菌—Bacillus subtilis NS04307，该菌株培养方法简单；NS04307菌株发酵过程所用原料主要为马铃薯和蔗糖，成本较低；由NS04307菌株发酵制备的生防菌剂方法简单，完全没有因化学农药使用所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，对人畜无害、对农作物无药害，绿色环保，且大田中对石榴干腐病有显著防效，对其它15种病原菌引起的植物病害也有较好的抑制作用。

附图说明

图1为 NS04菌株生长曲线。

图2为 NS04菌株的致死率曲线。

图3 为NS04307菌株对石榴干腐病病菌的平板抑制作用。图3中A：石榴干腐病病原菌； B：野生型菌株NS04对石榴干腐病的平板抑制作用；C：突变菌株NS04307对石榴干腐病的平板抑制作用。

图4 NS04307菌株的抑菌稳定性。

具体实施方式

本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NS04307菌株，是一种防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于该菌株为一株植物内生细菌正突变株，由分离自石榴叶片内部组织NS04菌株（于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8812）经紫外线诱变选育得到，编号为：NS04307，己于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8813。

所述的NS04菌株作为野生型菌株，通过紫外线诱变选育得到该菌株的正突变株NS04307，该突变株的抗石榴干腐病菌活性可达71.95%~80%，比野生型菌株的抗石榴干腐病活性提高了30.5%。

所述的内生枯草芽孢杆菌的突变株NS04307的制备方法，其特点是先根据野生型菌株NS04的生长曲线，研究出该菌株的致死率曲线，得出最佳诱变条件，再通过紫外线诱变和产量型突变菌株的筛选方法得到突变菌株NS04307。

所述的内生枯草芽孢杆菌突变株NS04307抑菌性能的稳定性，其特点是该突变菌株对石榴干腐病菌的抑菌性能稳定，连续移接培养10代，其抑菌活性没有发生变化。

所述的内生枯草芽孢杆菌的突变株NS04307的生防菌剂的制备方法。

所述的生防菌剂在防治石榴干腐病中的应用。

所述的内生枯草芽孢杆菌突变株NS04307在防治芝麻白绢病 （Sclerotium rolfsii）、苹果霉心病（Trichothecium roseum）、香蕉叶斑病菌喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、芝麻枯萎病（Fusarium oxysporum）、山茱萸褐斑病（Alternaria alternate）、香蕉褐缘灰斑病（Pseudocercospora musae）、玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、山茱萸叶枯病（Peyronellaea glomerata）、大叶黄杨炭疽病（Colletotrichum sp.）、山茱萸拟盘多毛叶斑病（Pestalotiopsis foedans）、甘蔗凤梨病（Thielaviopsis paradoxa）、玉米穗腐病致病性木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、玉米穗腐病致病串珠镰刀菌（Gibberella moniliformis）、玉米穗腐病致病层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）中的应用。

下面结合附图和实施例来进一步讲述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：野生型内生菌株NS04的筛选

1. 内生菌株的分离和纯化

采集健康的石榴叶片称取3.0 g，自来水洗干净，用无菌水冲洗3次，无菌剪刀剪成4~5 mm见方的小块后，在超净工作台上，依次用75%的酒精浸泡5 s，0.1 %的升汞浸泡50 s，无菌水漂洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液1 mL进行梯度稀释至10^-5，从10^-3、10^-4、10^-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复。在37℃恒温培养箱中倒置培养24~48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24 h，4℃冰箱保存备用。

2. 内生生防菌株的筛选

采用平板对峙法测定内生细菌对石榴干腐病菌( Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先将石榴干腐病菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上28 ℃培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生细菌，以只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃恒温培养箱中培养，待对照皿中病原菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小。

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）。

通过石榴叶片内生菌的分离纯化和筛选，获得了一株对石榴干腐病菌有较好抑菌活性的内生菌菌株，抑制率为55.6%，编号为NS04。

3. 内生生防菌株NS04的鉴定

3.1 NS04菌株的形态学、生理生化特性

NS04菌株在NA平板培养基上菌落直径约为0.76 cm，白色，不透明，不规则状，隆起，边缘裂叶状，随培养时间延长菌落表面出现褶皱。NS04单个细胞呈短杆状，0.63~0.87×1.75~2.51 μm，单生或对生，革兰氏染色阳性，有椭圆形或柱状芽孢。NS04菌株和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的生理生化特性基本一致（表1）。

表1 内生生防菌NS04菌株生理生化特征

3.2 NS04菌株的16S rDNA序列分析

生防菌株NS04基因组DNA的提取采用反复冻融法，采用16S rDNA通用引物，委托生工生物工程（上海）有限公司合成：

上游引物为F27 ：5′－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3′

下游引物为R1492：5′－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3′

PCR反应体系（总体系为25 μL）为：premix Taq 12 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，双蒸水10 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环后72 ℃延伸10 min。扩增得到16S rDNA 1 500 bp。将产物用试剂盒纯化后送到生工生物工程（上海）有限公司测序获得NS04的16S rDNA序列1449 bp，在GenBank已登录，登录号为JX126865。利用BLAST程序进行序列同源性比对分析，结合形态学、生理生化特性并查阅相关资料，将NS04菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

实施例2：正突变菌株NS04307的制备方法

2.1 野生型菌株NS04生长曲线的测定

将活化后的出发菌株配成浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，取20 μl接入装有10 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，共接18支，置于37 ℃，150 r/min摇床震荡培养，从2 h后开始，每隔2 h取出一支试管放进4 ℃冰箱保存，等全部取完后，用分光光度计在625 nm波长下分别测其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照，每个处理3个重复。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制菌株生长曲线，确定其对数生长期。研究结果表明，NS04菌株的生长曲线呈S型，0~14 h为延滞期，对数生长期为16~24 h，26 h后进入稳定期，30 h后则进入衰亡期（图1）；诱变处理的菌株一般要求处于对数生长期，此时群体生长状况比较同步，代谢活性高而稳定，生活力强，易变异，重复性较好，所以选用对数期的细胞进行处理。故选择培养20 h的NS04菌悬液进行诱变处理。

2.2 致死率曲线的测定及野生型菌株的诱变

将NS04菌株接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃培养20 h，4 000 r/min离心10 min去上清，菌体用无菌生理盐水和0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.8)各洗涤一次后，调节菌液浓度约1×10⁸ cfu/mL。取33个培养皿，每皿加入5 mL上述菌悬液，每3个为1组，共11组。选用 20 W (照射距离30 cm)的紫外灯，预热30 min使波长稳定后，分别照射0 s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然后每皿吸取0.1 mL涂平板，37 ℃恒温培养24 h，待平板上长出菌落后计数。以不经紫外线诱变的平板为对照，依据下列公式计算出每个处理的致死率，以照射时间为横坐标、致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率(%) = [(对照组菌落数－紫外照射后菌落数) /对照组菌落数]×100%

采用紫外照射对细菌NS04进行诱变处理，在紫外灯功率和照射距离(保持30 cm)不变时，致死率仅与照射时间有关，且照射时间越长，诱变致死率越高（图2）。近年来研究认为，致死率在70%~80%时诱变效果较好。从致死率突变曲线可知，NS04菌株的诱变时间为260 s时致死率为75.87 %，因此选择260 s为NS04菌株最适诱变时间。

2.3 突变菌株的筛选

采用琼脂块培养法（周德庆.微生物学教程第3版.北京:高等教育出版社,2011,4: 212~213）进行突变株的筛选，采用上述实施例1中所述平板对峙法检测突变株对石榴干腐病病原菌的抑菌活性。当石榴干腐病病原菌长满平皿时，用无菌接种环挑取石榴干腐病病原菌孢子，接在马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在其两侧3 cm处划线接种诱变菌株。在同样条件下接种出发菌株和只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃培养7 d后测病原菌菌落直径，观察平板抑制作用，并计算突变菌株与出发菌株对病原菌的生长抑制率。

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）。

经过筛选得到了正突变菌株NS04307，对石榴干腐病菌的平板抑制作用明显增强(图3)，其抑制率为80%，与出发菌株相比，抑制率提高了30.5%。

2.4 NS04307的抑菌稳定性测定

将NS04307菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上传代，共传10次，采用上述实施例1中所述平板对峙法在相同条件下对每一代的菌株进行抑菌实验，研究表明NS04307菌株的抑菌率在71.95%~80.00%，该菌株对石榴干腐病的抑制率保持稳定，说明NS04307突变菌株对石榴干腐病菌的抑制作用能稳定遗传（图4）。

3．NS04307菌株的抑菌谱

采用上述实施例1中所述平板对峙法测定NS04307菌株对供试的15种病原真菌的抑菌率（表1）结果表明：NS04307菌株对15种病原真菌都有抑制作用，其中对芝麻白绢病和苹果霉心病抑制效果最好，分别为93.5%和92.4%。因此该菌株有广泛的应用前景。

表1 NS04307菌株的抑菌谱

实施例3：NS04307菌株生防菌剂的制备方法

1.通气量对NS04307菌株生长及抑菌性能的影响

用250ml的三角瓶，分别装入50 ml、75 ml、100 ml、125 ml、150 ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，以装液量的1%接种，在37 ℃，180 r/min对NS04307菌株分别进行摇床培养，24 h后测发酵液OD₆₂₅值。再采用实施例2中所述的抑菌圈法将发酵液与石榴干腐病菌做拮抗实验，测定各通气量下发酵液的抑菌情况，并测量抑菌圈大小。结果显示在加入50 ml NS04307菌株生长最好，此时的装液量为20%，但装液量对石榴干腐病的抑菌作用差异不显著。

2. NS04307菌株生防菌剂的制备方法

挑取活化的NS04307菌株少许，接种到10mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，37 ℃，180 r/min摇床培养，24 h，作为种子液；根据上述2的测定结果将种子液按1%（v/v）的比例接种于含200 mL PDB培养基的1L三角瓶中，37 ℃，180 r/min摇床培养，72 h，得到发酵液，将发酵液稀释10倍，浓度为1.3×10⁸ cfu/mL，再在发酵液中添加3%（W/V）表面活性剂OP-10，充分混匀后获得NS04307菌株的生防菌剂。

实施例4：NS04307菌株防治石榴干腐病的应用

1. NS04307菌株室内果实离体防效试验

将NS04307生防菌于牛肉膏蛋白胨培养液37 ℃，180 r/min振荡培养72 h，4 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体用无菌水稀释至10⁸个/mL后备用。培养好的病原菌孢子用无菌水稀释至10⁸个/mL。将石榴果实表面用75 %酒精消毒处理并自然晾干。用灭菌的5孔接种针在石榴果实腰部等距离地刺2处伤口，喷雾接种生防菌菌悬液及病原菌孢子悬液。该试验设3个实验组，每组3个处理，处理1：先接病原菌孢子悬液，24 h后再接生防菌菌悬液；处理2：先接生防菌菌悬液，24 h后再接病原菌孢子悬液；处理3：先接病原菌孢子悬液，待伤口晾干后立即接生防菌菌悬液。每处理5个果实，重复4次，以只接病原菌的处理为对照组。待其自然晾干后，将各处理的果实置于28 ℃，RH 90 ％恒温恒湿培养箱中贮存，待接种9 d后观察并统计石榴干腐病的发病情况，用十字交叉法测定病斑直径，最后计算抑制率。

抑制率（％）＝（对照病斑总面积－处理病斑总面积）／对照病斑总面积×100 ％

研究结果表明：NS04307生防菌株各处理对石榴干腐病都有很好的防治作用。处理1的抑制率最好为75.08 ％，处理2和处理3对石榴干腐病的抑制率差异不显著，分别为53.80 ％和58.82 ％， 说明NS04307菌株对石榴干腐病有很好的治疗作用和保护作用（表2）。

表2  NS04307菌株对离体果实石榴干腐病的防治

2. NS04307生防菌剂大田防治石榴干腐病试验

6月底7月初开始防治石榴干腐病，在所选的石榴园将上述制备好的生防菌剂进行喷施。试验采用随机化完全区组设计进行，从田间东、南、西、北和中部五个点选各取9株石榴果树，分为3组，每3棵树为1组，其中1组喷施NS04307生防菌剂，1组喷施60%代森锰锌可湿性粉剂，一组喷施清水作为对照。每隔10 d重复施药，连续3次，最后一次施药后第15d调查果实发病情况，对病害进行分级，计算病情指数和发病率。

石榴干腐病根据果实发病严重度分为7级（表3）：

表3 石榴干腐病果实发病分级标准

结果显示：NS04307菌株生防菌剂在大田对石榴干腐病的防效可达65.15%，极显著优于果农田间目前使用的化学药剂代森锰锌6.17%（表4）。

表4 NS04307菌株大田防治石榴干腐病效果

数值后的小写字母表示差异显著性（P<0.05），数值后的大写字母表示差异显著性（P<0.01）

上述研究均可看出，NS04307生防制剂对石榴果实干腐病有良好的防治效果，室内离体果实防效可达75.08 ％，大田防治效果可达65.15%，优于化学药剂代森锰锌，且该菌株对15种不同病原菌引起的植物病害都有不同的抑制效果，有较宽的抑菌谱，因此该菌株有较大的潜力开发成商业化的生防制剂。

Claims (4)

1.一种内生枯草芽孢杆菌正突变株，其特征是，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NS04307菌株，是一种防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于该菌株为一株植物内生细菌正突变株，由分离自石榴叶片内部组织已于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8812的NS04菌株经紫外线诱变选育得到，编号为：NS04307，已于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8813。

2.根据权利要求1所述的一种内生枯草芽孢杆菌正突变株在防治其他真菌病害中的应用，其特征是：所述的内生枯草芽孢杆菌突变株NS04307在防治芝麻白绢病（Sclerotium rolfsii）、苹果霉心病（Trichothecium roseum）、香蕉叶斑病菌喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、芝麻枯萎病（Fusarium oxysporum）、山茱萸褐斑病（Alternaria alternate）、香蕉褐缘灰斑病（Pseudocercospora musae）、玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、山茱萸叶枯病（Peyronellaea glomerata）、大叶黄杨炭疽病（Colletotrichum sp.）、山茱萸拟盘多毛叶斑病（Pestalotiopsis foedans）、甘蔗凤梨病（Thielaviopsis paradoxa）、玉米穗腐病致病性木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、玉米穗腐病致病串珠镰刀菌（Gibberella moniliformis）、玉米穗腐病致病层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）中的应用。

3.根据权利要求1所述内生枯草芽孢杆菌正突变株制备的生防菌剂，其特征是，挑取活化的NS04307菌株，接种到10mL马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中，37 ℃，180 r/min摇床培养，24 h，作为种子液；根据测定结果将种子液按1%（v/v）的比例接种于含200 mL PDB培养基的1L三角瓶中；37 ℃，180 r/min摇床培养，72 h，得到发酵液，将发酵液稀释10倍，浓度为1.3×10⁸ cfu/mL，再在发酵液中添加3%（W/V）表面活性剂OP-10，充分混匀后获得NS04307菌株的生防菌剂。

4.根据权利要求1或3所述的内生枯草芽孢杆菌正突变株及其生防菌剂在防治石榴干腐病中的应用。