CN110205271A - 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110205271A
CN110205271A CN201910496254.XA CN201910496254A CN110205271A CN 110205271 A CN110205271 A CN 110205271A CN 201910496254 A CN201910496254 A CN 201910496254A CN 110205271 A CN110205271 A CN 110205271A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus licheniformis
fermentation
culture
seed
gemma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910496254.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110205271B (zh
Inventor
郑双凤
谭石勇
罗志威
谭武贵
文亚雄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Huigu Agricultural Ecology Research Institute Co.,Ltd.
Original Assignee
Hunan Taigu Ecological Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Taigu Ecological Engineering Co Ltd filed Critical Hunan Taigu Ecological Engineering Co Ltd
Priority to CN201910496254.XA priority Critical patent/CN110205271B/zh
Publication of CN110205271A publication Critical patent/CN110205271A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110205271B publication Critical patent/CN110205271B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/12—Powders or granules
    • A01N25/14—Powders or granules wettable
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用，所述深层发酵方法包括将地衣芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢。所述地衣芽孢杆菌发酵液进行离心处理得到浓缩菌液，再将硅藻土、玉米淀粉、麦芽糊精与上述浓缩菌液混合均匀后进行喷雾干燥，得到干粉菌剂，将十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、β～环糊精、抗坏血酸、γ～聚谷氨酸与上述干粉菌剂混合均匀后粉碎，过筛后得到可湿性粉剂。该方法工艺简单，制备得到的生防地衣芽孢杆菌安全高效、无残留、无毒副作用，能够减少化学农药的使用。

Description

地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用，尤其涉及一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，以及该方法所得地衣芽孢杆菌制备可湿性粉剂的应用。
背景技术
我国每年使用大量的化学农药制剂，但是大量化学农药的使用，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。微生物农药，是指应用活体微生物及其代谢产物对农业病虫害进行防治，其具有选择性强，副作用小，对人、畜、农作物和自然环境无害，不易产生抗药性等特点，因此是一种具有广阔前景的绿色农药。目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。
地衣芽孢杆菌是一种属于芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，在自然界分布非常广泛。研究表明，它对多种植物土传病原菌有很强的抑制作用，如对植物疫霉病菌、结核病病菌、核盘菌、稻瘟病病菌等均具有较强的抑菌活性，在植物土传病害防治中具有较好的防治效果。近年来地衣芽孢杆菌已成为芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，并且其在医药、饲料加工、农药等行业均取得了较好的研究成果。地衣芽孢杆菌发酵后为液体，为了提高芽孢含量、方便运输、提高芽孢稳定性等，而对地衣芽孢杆菌发酵液进行干燥处理得到的粉末。目前，一般采用喷雾干燥，喷雾干燥是将地衣芽孢杆菌发酵液通过喷雾分散成很细的像雾一样的微粒，与热空气接触，在瞬间将大部分水分除去，使物料中的固体物质干燥成粉末。喷雾干燥有压力喷雾干燥法、离心喷雾干燥法和气流式喷雾干燥法。现有的粉剂制备方法效率低、成本高、生产过程发酵液变质、芽孢损失严重，芽孢收率低。
由于发酵培养基成分与发酵工艺对地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢产量具有较大的影响，但是目前地衣芽孢杆菌发酵生产存在发酵液中芽孢含量与产孢率低，成本高等问题。如何在保证成本条件下，尽可能提高芽孢含量与芽孢产率与实际应用效果，成为困扰生产生防地衣芽孢杆菌可湿性粉剂实际工业生产的瓶颈问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用，该发酵方法可提高芽孢产率与回收率，提升所得地衣芽孢杆菌的可湿性粉剂的应用效果。
一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，具体步骤如下：
1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基上进行培养；
2)摇瓶一级种子液制备：将步骤1)中活化后的菌种接入摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；
3)种子罐二级种子液制备：将步骤2)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按1～5％的接种量接入二级种子罐中搅拌培养；
4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按体积比为1～5％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中培养；当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用。
进一步地，步骤1)所述菌种活化具体过程为：将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基平板上进行培养，36℃培养12h；然后挑取单菌落划线转接于营养琼脂斜面，36℃培养12h；培养后得活化菌种。
进一步地，步骤2)所述培养条件：温度36℃、摇床转速160r/min、通气量0.8vvm、罐压0.05Mpa、培养时间12h；所述种子培养基中含酵母膏5g/500mL、蛋白胨1g/500mL、葡萄糖1g/500mL，pH 7.0±0.1。
进一步地，步骤3)中，所述二级种子罐中含有酵母膏500g/50L、蛋白胨1000g/50L、葡萄糖1000g/50L，pH 7.0±0.1；所述培养条件：温度36℃、搅拌速率160r/min、种子罐体积100L、装液量50L、通气量0.8vvm、罐压0.05Mpa、培养时间12h。
进一步地，所述发酵培养基：按重量百分比，包括麸皮2～4％、玉米粉1～3％、酵母膏0.2～0.4％、氯化钠0.2～0.5％、CaCO3 0.4～0.8％、KH2PO4 0.06～0.12％、硫酸镁0.1～0.2％、MnCl2 0.03～0.05％，消泡剂0.015％～0.025％，其余为水。优选为，包括麸皮2～3％、玉米粉1～2％、酵母膏0.2～0.3％、氯化钠0.2～0.4％、CaCO3 0.4～0.6％、KH2PO40.06～0.1％、硫酸镁0.1～0.13％、MnCl2 0.03～0.04％，消泡剂0.015％～0.025％，其余为水。
进一步地，步骤4)所述培养的条件：发酵温度控制：33～36℃；
空气流量调整：0h～4h控制在0.4～0.6vvm，4h～8h控制在0.6～0.8vvm，8h～11h控制在0.8～0.9vvm，11h～36h控制在1.0～1.5vvm；
搅拌调整:0h～7h控制在60～80rpm，7h～8h控制在90～110rpm，8h～11h控制在120～150rpm，11h～36h控制在160～200rpm；
发酵罐罐压为0.05～0.06Mpa。
进一步地，所述发酵液中芽孢数达1.5×1010cfu/mL～1.8×1010cfu/mL，芽孢率高于91％以上，菌体形态为芽孢。
另一方面，本发明提供过一种地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，具体步骤如下：
A)将本发明制备的地衣芽孢杆菌发酵液离心浓缩，得浓缩菌液；
B)将所得浓缩菌液、硅藻土、玉米淀粉和麦芽糊精进行混合均匀；
C)将所得混合物进行喷雾干燥得到干粉菌剂；
D)将所得干粉菌剂、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、β～环糊精、抗坏血酸、γ～聚谷氨酸混匀，利用气流粉碎机粉碎，过筛，即得可湿性粉剂。
进一步地，所述步骤A)中，离心浓缩的转速为6000～6600r/min。
进一步地，按重量份数比，所述浓缩菌液、硅藻土、玉米淀粉和麦芽糊精比例为50～80：15～20：5～10：0.5～1.5。优选为，所述浓缩菌液、硅藻土、玉米淀粉和麦芽糊精比例为60：18：6：1。
进一步地，所述喷雾干燥条件为：进风温度230℃、出风温度80～90℃。
进一步地，按重量份数比，所述干粉菌剂、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、β～环糊精、抗坏血酸、γ～聚谷氨酸比例为90～100：1～4：0.3～1：0.2～0.5：0.2～0.5：0.1～0.5；优选比例为96:3:0.5:0.25:0.25:0.4。
进一步地，所述气流粉碎机粉碎的温度在45±5℃，所述过筛是指过400目筛。
进一步地，所述可湿性粉剂中芽孢含量不低于6.5×1010cfu/g，悬浮率75％以上、润湿时间不高于75s、细度通过率达98％。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，1)其中的发酵培养基的成分直接以麸皮、玉米粉、酵母膏作为培养基的碳氮源，原料简单易得，不仅可以降低生产成本，增加经济效益，还可以提高农业资源的综合利用水平。发酵培养基不仅为地衣芽孢杆菌的生长提供营养，改善地衣芽孢杆菌的生长条件，促使地衣芽孢杆菌快速进入对数生长期，还能延长地衣芽孢杆菌的稳定期，发酵得到高含量的活菌数和芽孢数。2)其中的地衣芽孢杆菌种子液经菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备得到，通过控制种子液与培养基的体积比、发酵过程中温度和空气流量调整(溶解氧浓度是限制地衣芽孢杆菌高密度发酵的关键因素，根据地衣芽孢杆菌生长需氧特点，在不同的发酵阶段，通过控制发酵罐的通气量与搅拌速度来维持不同生长阶段的最适需氧量，可以有效促进地衣芽孢杆菌的生长繁殖，提高芽孢生成量与芽孢率。)，最终得到发酵液中芽孢含量高于1.5×1010cfu/mL，芽孢率高于90.5％，解决了传统液体发酵芽孢产率低的问题，本发明生产的地衣芽孢杆菌发酵液主要为地衣芽孢杆菌芽孢菌体，抗逆性强。3)本发明通过将菌种活化、两级种子液制备，能够高效抑制杂菌，利于后续芽孢产率的提高，既能减少筛选的工作，又能节约时间成本。4)本发明通过在发酵过程中控制发酵条件，不仅能够促使地衣芽孢杆菌快速进入对数生长期，还能延长地衣芽孢杆菌的稳定期，发酵得到高含量的活菌数和芽孢数。
本发明还提供了一种地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，该方法工艺简单，通过离心浓缩和混匀，避免厌氧发酵；通过喷雾干燥，杀死少量未转孢的杆菌；通过与其他辅料混合后，在45±5℃范围内粉碎不仅能防止芽孢复萌发，也能有效抑制生产过程中微生物侵染导致变质。室温下，芽孢含量不低于6.5×1010cfu/g，悬浮率75％、润湿时间不高于75s、细度通过率98％，采用多种芽孢保护工艺，使粉剂室温下贮藏100d存活率达90％。
附图说明
图1发酵罐发酵过程中的DO变化曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
实施例1
地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌划线接种于营养琼脂培养基平板上进行培养，36℃下培养24h，然后挑取单菌落划线转接于营养琼脂斜面，36℃下培养24h后得活化菌种。
(2)摇瓶一级种子液制备：在2个2000mL锥形瓶中分别装入500mL的含酵母膏5g、蛋白胨1g、葡萄糖1g、pH 7.0±0.1的种子培养基，将步骤(1)中活化后的菌种用接种环接入摇瓶种子培养基中，培养条件：温度36℃、摇床转速160r/min、培养时间12h。
(3)种子罐二级种子液制备：将步骤(2)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按2％的接种量接入含有酵母膏500g、蛋白胨1000g、葡萄糖1000g、pH 7.0±0.1的二级种子罐中，培养条件：温度36℃、搅拌速率160r/min、种子罐体积100L、装液量50L、通气量0.8vvm、罐压0.05Mpa、培养时间12h。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按3％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：麸皮3％、玉米粉2％、酵母膏0.3％、氯化钠0.4％、CaCO3 0.6％、KH2PO4 0.1％、硫酸镁0.13％、MnCl2 0.04％，消泡剂0.015％～0.025％。培养条件：发酵温度控制：35℃；空气流量调整：0h～4h控制在0.5vvm，4h～8h控制在0.7vvm，8h～11h控制在0.85vvm，11h～36h控制在1.1vvm；搅拌调整:0h～7h控制在70rpm，7h～8h控制在100rpm，8h～11h控制在140rpm，11h～36h控制在180rpm；发酵罐罐压为0.06Mpa。当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机进行离心，转速6600r/min。
(6)按照浓缩菌液60份、硅藻土18份、玉米淀粉为6份、麦芽糊精为1份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度85℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基硫酸钠为3份，羧甲基纤维素钠为0.5份，β～环糊精0.25份、抗坏血酸为0.25份、γ～聚谷氨酸0.4份混匀，在45℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达1.8×1010cfu/mL，芽孢率高于91％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于6.7×1010cfu/g，悬浮率75％以上、润湿时间不高于75s、细度通过率达98％，采用多种芽孢保护工艺，使粉剂室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实施例2
地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化同实施例1。
(2)摇瓶一级种子液制备同实施例1。
(3)种子罐二级种子液制备同实施例1。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按1％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：麸皮2％、玉米粉1％、酵母膏0.2％、氯化钠0.2％、CaCO30.4％、KH2PO40.06％、硫酸镁0.1％、MnCl20.03％，消泡剂0.015％。培养条件：发酵温度控制：33℃；空气流量调整：0h～4h控制在0.4vvm，4h～8h控制在0.6vvm，8h～11h控制在0.8vvm，11h～36h控制在1.0vvm；搅拌调整:0h～7h控制在60rpm，7h～8h控制在90rpm，8h～11h控制在120rpm，11h～36h控制在160rpm；发酵罐罐压为0.05Mpa。当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机进行离心，转速6000r/min。
(6)按照浓缩菌液50份、硅藻土15份、玉米淀粉为5份、麦芽糊精为0.5份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度80℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基硫酸钠为1份，羧甲基纤维素钠为0.3份，β～环糊精0.2份、抗坏血酸为0.2份、γ～聚谷氨酸0.1份混匀，在30℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达1.5×1010cfu/mL，芽孢率高于91％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于6.5×1010cfu/g，悬浮率75％以上、润湿时间不高于75s、细度通过率达98％，采用多种芽孢保护工艺，使粉剂室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实施例3
地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化同实施例1。
(2)摇瓶一级种子液制备同实施例1。
(3)种子罐二级种子液制备同实施例1。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按5％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：麸皮4％、玉米粉3％、酵母膏0.4％、氯化钠0.5％、CaCO3 0.8％、KH2PO4 0.12％、硫酸镁0.2％、MnCl2 0.05％，消泡剂0.025％。培养条件：发酵温度控制：36℃；空气流量调整：0h～4h控制在0.6vvm，4h～8h控制在0.8vvm，8h～11h控制在0.9vvm，11h～36h控制在1.5vvm；搅拌调整:0h～7h控制在80rpm，7h～8h控制在110rpm，8h～11h控制在150rpm，11h～36h控制在200rpm；发酵罐罐压为0.06Mpa。当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机进行离心，转速6600r/min。
(6)按照浓缩菌液80份、硅藻土为20份，玉米淀粉为10份、麦芽糊精为1.5份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度90℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基硫酸钠为4份，羧甲基纤维素钠为1份，β～环糊精0.5份、抗坏血酸为0.5份、γ～聚谷氨酸0.5份混匀，在50℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达1.7×1010cfu/mL，芽孢率高于91％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于6.6×1010cfu/g，悬浮率75％以上、润湿时间不高于75s、细度通过率达98％，采用多种芽孢保护工艺，使粉剂室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实验例4
发酵罐溶氧对地衣芽孢杆菌发酵的影响
(1)菌种活化、摇瓶种子液制备、发酵罐种子液制备、发酵培养基配制同实例1。
(2)溶解氧对发酵的影响，其中溶解氧控制通过通气流量和搅拌速度来调节控制。
(3)实验设计：
处理1：发酵温度35℃；空气流量1vvm，搅拌160rpm；发酵罐罐压0.06Mpa。测定发酵过程中的DO值与发酵结束后发酵液中的活菌与芽孢产量(DO值由溶氧电极测定)；
处理2：发酵温度控制：35℃；空气流量调整：0h～4h控制在0.5vvm，4h～8h控制在0.7vvm，8h～11h控制在0.85vvm，11h～36h控制在1.1vvm；搅拌调整:0h～7h控制在70rpm，7h～8h控制在100rpm，8h～11h控制在140rpm，11h～36h控制在180rpm；发酵罐罐压为0.06Mpa。测定发酵过程中的DO值与发酵液中的活菌与芽孢产量。
(4)实验结果：
表1发酵液中的活菌与芽孢检测结果
由图1和表1结果可知，随着菌体生长繁殖，在发酵初期，需氧量较低，在菌体大量生长繁殖阶段，需氧量逐渐增加，根据地衣芽孢杆菌发酵的需氧特点，采取分段控制发酵过程中的搅拌与通气量，可缩短发酵时间，提高发酵液中的有效活菌含量与芽孢率。
实验例5地衣芽孢杆菌可湿性粉剂对辣椒疫霉病的盆栽防效试验
(1)可湿性粉剂制备：按照本发明制备可湿性粉剂。
(2)辣椒疫霉病菌悬液制备：挑取辣疫霉病菌单菌落接种于PDB液体培养基中，于30℃,160r/min振荡培养72h，然后用无菌水将菌液稀释至1.0×106cfu/mL。
(3)盆栽处理：辣椒品种选用湖南省农业科学院蔬菜研究所提供的茄门甜椒，每盆种植辣椒1株。选取4～6叶期的辣椒苗进行试验处理，处理方式为灌根+喷施。试验共设2个处理，每个处理各20株苗，每个处理各3次重复。
处理1：在移栽7天后用稀释1000倍的可湿性粉剂，进行灌根处理，每株50mL，然后每隔7天进行喷施1次稀释1000倍的可湿性粉剂，每次用量20mL，喷施共2次。
处理2：即空白对照组，与处理1相同的方法操作，用清水代替地衣芽孢杆菌可湿性粉剂。
在罐根处理7天后喷洒稀释后的辣椒疫霉病孢子菌悬液，每株20mL。将辣椒置于28±2℃，光照周期14h/10h温室条件下培养，常规水肥管理维持辣椒正常生长。待对照发病且病情稳定后，观察并记录病情等级，计算病情指数和防治效果。
病情分级：
0级：植株健康无症状；
1级:土面茎基部缢缩并变褐色，病斑面积占整个植株1/4以下，叶片有轻微萎蔫；
2级:茎基部缢缩，褐腐斑面积延伸至整个植面积的1/3，叶片萎蔫；
3级:茎基部缢缩，病斑占茎部和主根总面积的1/2以上，叶片严重萎蔫；
4级:整个植株变褐色，地上部萎蔫或枯死。
病情指数＝[∑(各级发病植株数×病级数)/(4×植株总数)]×100
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100
(4)实验结果：
在可湿性粉剂第1次处理60天后的调查结果，由结果可知，可湿性粉剂对辣椒疫霉病的防治效果达到72.28％(表2)。
表2地衣芽孢杆菌可湿性粉剂对辣椒疫霉病的防效
病情指数 防治效果
处理1 17.6 72.28
处理2(CK) 63.5 －
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基上进行培养；
2)摇瓶一级种子液制备：将步骤1)中活化后的菌种接入摇瓶种子培养基中，进行摇瓶培养，得到一级种子液；
3)种子罐二级种子液制备：将步骤2)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按1～5％的接种量接入二级种子罐中搅拌培养；
4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按体积比为1～5％的接种量接入发酵罐的发酵培养基中培养；当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用；
步骤4)所述培养的条件：发酵温度控制：33～36℃；
空气流量调整：0h～4h控制在0.4～0.6vvm，4h～8h控制在0.6～0.8vvm，8h～11h控制在0.8～0.9vvm，11h～36h控制在1.0～1.5vvm；
搅拌调整:0h～7h控制在60～80rpm，7h～8h控制在90～110rpm，8h～11h控制在120～150rpm，11h～36h控制在160～200rpm；
发酵罐罐压为0.05～0.06Mpa。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，步骤1)所述菌种活化具体过程为：将地衣芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基平板上进行培养，36℃培养12h；然后挑取单菌落划线转接于营养琼脂斜面，36℃培养12h；培养后得活化菌种。
3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，步骤2)所述培养条件：温度36℃、摇床转速160r/min、通气量0.8vvm、罐压0.05Mpa、培养时间12h；所述种子培养基中含酵母膏5g/500mL、蛋白胨1g/500mL、葡萄糖1g/500mL，pH 7.0±0.1。
4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，步骤3)中，所述二级种子罐中含有酵母膏500g/50L、蛋白胨1000g/50L、葡萄糖1000g/50L，pH7.0±0.1；所述培养条件：温度36℃、搅拌速率160r/min、种子罐体积100L、装液量50L、通气量0.8vvm、罐压0.05Mpa、培养时间12h。
5.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基：按重量百分比，包括麸皮2～4％、玉米粉1～3％、酵母膏0.2～0.4％、氯化钠0.2～0.5％、CaCO3 0.4～0.8％、KH2PO4 0.06～0.12％、硫酸镁0.1～0.2％、MnCl2 0.03～0.05％，消泡剂0.015％～0.025％，其余为水。
6.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的深层发酵方法，其特征在于，所述发酵液中芽孢数达1.5×1010cfu/mL～1.8×1010cfu/mL，芽孢率高于91％以上，菌体形态为芽孢。
7.一种地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
A)将权利要求1～6任一项制备的地衣芽孢杆菌发酵液离心浓缩，得浓缩菌液；
B)将所得浓缩菌液、硅藻土、玉米淀粉和麦芽糊精进行混合均匀；
C)将所得混合物进行喷雾干燥得到干粉菌剂；
D)将所得干粉菌剂、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、β～环糊精、抗坏血酸、γ～聚谷氨酸混匀，利用气流粉碎机粉碎，过筛，即得可湿性粉剂。
8.根据权利要求7所述的地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中，离心浓缩的转速为6000～6600r/min；
按重量份数比，所述浓缩菌液、硅藻土、玉米淀粉和麦芽糊精比例为50～80：15～20：5～10：0.5～1.5。
9.根据权利要求7所述的地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥条件为：进风温度230℃、出风温度80～90℃；
按重量份数比，所述干粉菌剂、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、β～环糊精、抗坏血酸、γ～聚谷氨酸比例为90～100：1～4：0.3～1：0.2～0.5：0.2～0.5：0.1～0.5；
所述气流粉碎机粉碎的温度在45±5℃，所述过筛是指过400目筛。
10.根据权利要求7所述的地衣芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述可湿性粉剂中芽孢含量不低于6.5×1010cfu/g，悬浮率75％以上、润湿时间不高于75s、细度通过率达98％。
CN201910496254.XA 2019-06-10 2019-06-10 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用 Active CN110205271B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910496254.XA CN110205271B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910496254.XA CN110205271B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110205271A true CN110205271A (zh) 2019-09-06
CN110205271B CN110205271B (zh) 2021-02-09

Family

ID=67791603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910496254.XA Active CN110205271B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110205271B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234631A (zh) * 2021-05-20 2021-08-10 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其发酵方法与应用
CN113786377A (zh) * 2021-08-31 2021-12-14 武汉中博绿亚生物科技有限公司 修复皮肤微生态平衡的组合物、护理浴液及其制备方法
CN114164155A (zh) * 2021-12-22 2022-03-11 清远一生自然生物研究院有限公司 一种芽孢杆菌的发酵培养基及其发酵工艺
CN114195574A (zh) * 2021-11-05 2022-03-18 安徽儒商生物科技有限公司 一种含有腐植酸的微生物菌剂复合肥料及其生产工艺

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074289A (zh) * 2013-02-01 2013-05-01 东北制药（沈阳）科技发展有限公司 一种促进地衣芽孢杆菌bl63516生长的发酵培养基及发酵培养方法
CN104894083A (zh) * 2015-05-22 2015-09-09 徐州工程学院 一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
CN109402006A (zh) * 2018-11-08 2019-03-01 湖南泰谷生态工程有限公司 短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法
CN109554319A (zh) * 2019-01-31 2019-04-02 中国科学院微生物研究所 一种芽孢杆菌菌株及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074289A (zh) * 2013-02-01 2013-05-01 东北制药（沈阳）科技发展有限公司 一种促进地衣芽孢杆菌bl63516生长的发酵培养基及发酵培养方法
CN104894083A (zh) * 2015-05-22 2015-09-09 徐州工程学院 一种地衣芽孢杆菌深层液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
CN109402006A (zh) * 2018-11-08 2019-03-01 湖南泰谷生态工程有限公司 短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法
CN109554319A (zh) * 2019-01-31 2019-04-02 中国科学院微生物研究所 一种芽孢杆菌菌株及其应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234631A (zh) * 2021-05-20 2021-08-10 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其发酵方法与应用
CN113786377A (zh) * 2021-08-31 2021-12-14 武汉中博绿亚生物科技有限公司 修复皮肤微生态平衡的组合物、护理浴液及其制备方法
CN114195574A (zh) * 2021-11-05 2022-03-18 安徽儒商生物科技有限公司 一种含有腐植酸的微生物菌剂复合肥料及其生产工艺
CN114164155A (zh) * 2021-12-22 2022-03-11 清远一生自然生物研究院有限公司 一种芽孢杆菌的发酵培养基及其发酵工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN110205271B (zh) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110205271A (zh) 地衣芽孢杆菌的深层发酵方法及其应用
CN101875571B (zh) 增强型液体微生物有机肥料的制备方法
CN105601356B (zh) 一种食用菌菌渣综合利用的方法
CN109182172A (zh) 一种促根养根、增产提质复合微生物菌剂及其制备方法
CN109896900A (zh) 一种复合微生物菌剂和生物有机复合肥的制备及应用
CN104877937A (zh) 一种促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用
CN107711891B (zh) 一种防治枸杞根腐病死树的方法
CN103756930B (zh) 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用
CN103004884B (zh) 西瓜生物种衣剂及其制备和应用
CN105670973B (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用
CN104017749B (zh) 一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用
CN107646616A (zh) 一种花卉栽培基质的制备方法
CN105567615A (zh) 一种花生慢生根瘤菌及其应用
CN107297388A (zh) 一种消除连作障碍的土壤微生态环境修复方法
CN106676049A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN106146194B (zh) 一种抗重茬菌剂
CN106834192A (zh) 蜡样芽孢杆菌固体发酵方法及其发酵产物和应用
CN107006331A (zh) 一种蔓越莓与红豆杉套种的立体种植方法
CN101463339B (zh) 一种防治苹果真菌病害并促增产的菌剂及其专用菌株与应用
CN106701619B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌高密度发酵方法及其菌剂制备方法
CN104273176B (zh) 一种植物有机物-枯草芽孢杆菌混合菌剂、制备方法及应用
CN107164241A (zh) 一种白僵菌固体培养基及其制备方法
CN107114411A (zh) 用于水稻育秧的棘孢木霉dq3复合粉剂yby及应用
CN102219567B (zh) 一种以沼液为基础培养基发酵生产生物有机肥的方法
CN107467075B (zh) 一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210326

Address after: Room 310-3, headquarters building, Changsha Zhongdian Software Park Co., Ltd., No. 39, Jianshan Road, Changsha hi tech Development Zone, Changsha, Hunan 410000

Patentee after: Hunan Huigu Agricultural Ecology Research Institute Co.,Ltd.

Address before: 1504 and 1505, Lugu Yuyuan venture building, 27 Wenxuan Road, Changsha high tech Development Zone, Changsha City, Hunan Province, 410000

Patentee before: HUNAN TAIGU ECOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd.