CN106676049A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，一种解淀粉芽孢杆菌，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GKT04，CCTCC NO：M2016784，并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌GKT04的筛选方法和在抑制香蕉枯萎病菌中的应用，以及一种解淀粉芽孢杆菌GKT04菌剂。本发明的菌剂对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好，与其他土壤生防菌相比该菌能够在香蕉植株体内稳定定殖，受外界环境影响小，能与病原菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护。申请人还经过试验研究发现该菌还能够明显的促进香蕉植株的生长。
Description
【技术领域】
本发明微生物应用技术领域，具体公布的是一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
在植物病害生防细菌中，应用较多的是芽孢杆菌(Bacillus spp.)。它是一类重要的微生物资源，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线、电磁辐射和有机溶剂的芽孢，可以耐受各种不良的环境条件。田间应用已证实，芽孢杆菌的生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂。并且可以将芽孢杆菌做成粉剂、液剂。粉剂容易储存，便于运输，大规模生产工艺简单，成本较低。因此，芽孢杆菌是目前一种较为理想的生防微生物。
对于植物病害生防菌而言，大多数是从植物根际土壤中分离获得的，但是由于土壤微生物在与土壤习居微生物的竞争中不占优势，且不易长期定殖生存，所以实际防病效果不太理想。植物内生细菌由于其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部，能经受住植物自身的防卫反应，受外界环境影响小，能与病原菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护，是农用有益微生物的重要来源之一，并且对寄主植物具有促生、防病、内生固氮、携带外源基因等多方面的生物学作用。内生的芽孢杆菌由于其在植物体内能够稳定定殖，并在与寄主植物的长期进化中建立了和谐联合关系，因此更有利于其生防作用的发挥。目前还未见有利用内生的解淀粉芽孢杆菌防治香蕉真菌性病害的报道。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种解淀粉芽孢杆菌，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GKT04，CCTCC NO：M2016784；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年12月26日。
在本发明中，进一步说明，所述该菌株在LA培养基或NA培养基上生长良好，菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起，镜检呈杆状，具鞭毛，有芽孢；在pH 5.0-9.0、20℃-50℃的环境下都能够生长；革兰氏染色呈阳性；氧化酶、接触酶测定为阳性；甲基红(M.R)测定呈阴性；在pH 7.0时V-P测定生成红色化合物；3-酮基乳糖检测呈阴性；七叶灵水解检测呈阳性；纤维素水解、淀粉水解检测呈阴性；牛奶水解、糖醇类发酵检测呈阳性；明胶液化试验呈阳性；脲酶反应呈阳性；酯酶反应、精氨酸双水解酶检测呈阴性；在含有2％-5％的NaCl的LA培养基和NA培养基上均能生长。
如上所述一种解淀粉芽孢杆菌在防治植物枯萎病中的应用，或在制备防治植物枯萎病的微生物制剂中的应用。
在本发明中，进一步说明，所述植物为香蕉。
一种微生物制剂，含有如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的全培养液培养物和如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的芽孢。
一种微生物制剂，其是通过以下方法制备而得的：
(1)活化：将解淀粉芽孢杆菌GKT04接种于LA培养基或者NA培养基中，于28-30℃下培养20-24h；
其中，LA培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：将经活化后的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株接种于NA液体培养基中，于28-30℃、150-180r/min下振荡，培养4-8h，得到种子培养液；
(3)发酵：将种子培养液以5％的接种比例接种于装有发酵培养基的发酵罐中，于30-34℃、150-180r/min下培养，通入氖气进行培养，氖气的通入量为发酵罐体积的1/20，直至发酵液中95％以上的菌体产生芽孢，且芽孢的数量超过10亿个/mL，即可得到解淀粉芽孢杆菌GKT04发酵液；
(4)将发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，与右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪类化合物、碳酸氢钙混合均匀，即可得到一种微生物制剂；
其中，按照百分质量比计，发酵滤液45％-60％、右旋糖10％-21％、聚丙烯酰胺8％-15％、二酮哌嗪类化合物13％-20％、碳酸氢钙3％-5％。
在本发明中，进一步说明，所述发酵培养基由以下成分制成：淀粉10-20g/L、豆粕粉15-20g/L、葡萄糖5-10g/L、酵母膏1-2g/L、L-谷氨酸钠3-6g/L、硝酸钠1-2g/L、磷酸氢二钾1-2g/L、硫酸镁1-3g/L、氯化钠1-2g/L、吐温-20 1-2g/L，pH 6.8。
在本发明中，进一步说明，所述微生物菌剂是在质量浓度为15％-25％氯化铵溶液活化至解淀粉芽孢杆菌GKT04菌的有效成分含量1×1010CFU/mL-5×1010CFU/mL后使用。
如上所述一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，所述筛选具体包括以下步骤：
A：取香蕉表面消毒后的根部组织在研钵中，加入为香蕉根部组织10倍的无菌水进行研磨，取滤液，稀释至10-1000倍后，取稀释液100μL涂布于LA培养基平板上，于28℃条件下倒置培养3-5天，挑取菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起，镜检呈杆状，具鞭毛，有芽孢的菌落；
B：用平板对峙法从步骤A挑取的菌落中筛选出对香蕉枯萎病菌有抑菌作用的菌株。
在本发明中，进一步说明，在步骤A中，消毒的具体操作是用质量浓度为75％的酒精漂洗1min 30S，无菌水冲洗1次；再放入质量浓度为3.25％的NaClO溶液中浸泡10min，用无菌水冲洗3次；最后放入质量浓度为75％的酒精漂洗30S，无菌水冲洗4次；
在步骤B中，所述平板对峙法具体步骤为：将直径为10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌饼，接种于PDA培养基平板中央，用灭菌的接种环挑取分离的菌落在距菌饼两侧2.5cm处划线，倒置，28℃下培养得到有抑菌作用菌株，转入LA培养基平板上培养保存。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的解淀粉芽孢杆菌GKT04是香蕉内生细菌，对人、畜、农作物安全，对环境友好。现有的生防菌大多数是从土壤中分离得来，由于土壤生防菌在与土壤习居病原微生物的竞争中不占优势，且不易长期定殖生存，所以实际防病效果不太理想。本申请得到的解淀粉芽孢杆菌GKT04是香蕉内生菌株在植物病害防控上的应用，与其他土壤生防菌相比，该菌能够在香蕉植株体内稳定定殖，受外界环境影响小，能与病原菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护。申请人还经过试验研究发现该菌还能够明显的促进香蕉植株的生长。
2、本发明的解淀粉芽孢杆菌GKT04制备得到的一种生物菌剂对香蕉枯萎病菌具有显著的防治效果，盆栽试验可使香蕉枯萎病病情指数降低49.23％；对香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝生长有明显抑制作用，抑菌率达到85.7％，能够使菌丝生长缓慢，出现末端细小，膨大、扭曲，崩溃等畸形症状，具有比化学杀菌剂50％施保功更好的防治效果；且生产周期短，工艺简单，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。
3、本发明的解淀粉芽孢杆菌GKT04制备得到的一种生物菌剂在稀释之后直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其防控作用，并且该菌剂还能够明显的促进香蕉植株的生长。能显著改善香蕉根系环境中微生物群落的合理结构，形成一个生物多样化的香蕉根系土壤微生态环境，从而有效地、持久地控制香蕉枯萎病菌引起的病害。
【附图说明】
图1是本发明解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株对香蕉枯萎病菌FOC4菌落生长平板抑制作用对比图；其中，图1在左边的平板是内生菌GKT04与香蕉枯萎病致病菌FOC4平板对峙图片，右边的平板是只接香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌落形态图；
图2是与本发明解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株平板对峙培养7天后抑菌带边缘FOC4菌丝显微镜下观察菌丝膨大、凸起的形态图；
图3是本发明解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株16S rDNA序列测定及系统发育树；
图4是菌株GKT04对香蕉枯萎病的盆栽防控效果；
图5是经菌株GKT04处理的香蕉组培幼苗(GKT04)与对照组(CK淋空白NA液体培养基)植株对照图；
图6是经菌株GKT04处理的香蕉幼苗与对照组幼苗分别在15d、30d、45d、60d的植株高度的差异数据对比图；
图7是经菌株GKT04处理的香蕉幼苗与对照组幼苗分别在15d、30d、45d、60d的植株假茎围的差异数据对比图；
图8是经菌株GKT04处理的香蕉幼苗与对照组幼苗分别在15d、30d、45d、60d的植株完全展开最大叶面积的差异数据对比图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GKT04，CCTCC NO：M2016784；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年12月26日。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料
香蕉，品种：桂蕉1号，广西香蕉常规主栽品种。
1.1.2供试病原菌
香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4，FOC4)由本实验室自行分离筛选。
1.1.3供试培养基
LA培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12.5g
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g
PDA培养金：去皮的马铃薯块200g，用刀切成小块，加1L水煮沸20min，用3-4层纱布过滤，取其滤液，加入葡萄糖20g，琼脂18g，定容到1L
1.2方法
1.2.1香蕉内生细菌分离、纯化
取自发病蕉园健康香蕉植株的根，采用研磨法分离香蕉内生菌。采用三步消毒法：用质量浓度为75％的酒精漂洗1min 30S，无菌水冲洗1次；再放入质量浓度为3.25％的NaClO溶液中浸泡10min，用无菌水冲洗3次；最后放入质量浓度为75％的酒精漂洗30S，无菌水冲洗4次。取消毒后的香蕉根部1g置于灭菌研钵中，加入10ml无菌水研磨均匀，取其滤液按10-1～10-5进行稀释，取稀释液100μL涂布于LA培养基平板上，同时取香蕉根部表面消毒时最后一次冲洗的无菌水100μL，涂布于LA培养基平板上作为对照，28℃，倒置培养3-5天，挑取菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起，镜检呈杆状，具鞭毛，有芽孢的菌落，在LA培养基平板上划线、纯化、保存。
1.2.2平板对峙试验
用灭菌的打孔器打取直径为10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌饼，接种于PDA培养基平板中央，用灭菌的接种环挑取分离的内生菌在距菌饼两侧2.5cm处划线，倒置，28℃，培养7天，同时以只接FOC4的菌饼作为对照，设置3个重复，观察抑菌效果。
抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
1.2.3内生性测定
利用抗性诱导的方法获得抗利福平标记的菌株GKT04-Rif，接种香蕉幼苗后分别于第3天、5天参照1.2.1的方法在平板上进行菌落回收。
1.2.4菌株稳定性检测
将菌株在LA培养基28℃，传代培养10次，测定菌株对FOC4的抑制率的变化。
1.2.5菌株鉴定：
1.2.5.1形态及生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》。
1.2.5.2 16S rDNA序列测定及系统发育树。
1.2.6盆栽试验设计：选取5～6片长势一致的香蕉砂培幼苗种植于9cm×11cm营养钵中，本试验设计4个处理：处理1：只接20mL空白NA液体培养基的对照；处理2：采用灌根法接种浓度为1×108CFU/mL的菌株GKT04悬浮液20mL；处理3：先用灌根法接种浓度为1×108CFU/mL的菌株GKT04悬浮液20mL，7d后伤根，淋孢子悬浮液浓度为8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL；处理4：接20mL空白NA液体培养基，7d后伤根，淋孢子悬浮液浓度为8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL。每处理10株，重复3次。20天后调查植株发病情况，计算各处理的病情指数和防效。
2结果与分析
2.1内生细菌的分离及平板拮抗效果
从不同区域的香蕉根部组织中筛选到的内生细菌进行划线纯化，其中对FOC4生理小种拮抗效果最好的为菌株GKT04，平板拮抗抑制率达到85.7％(图1)。和菌株GKT04平板对峙培养7天后，抑菌带上FOC4生理小种菌丝发生膨大、凸起变形(图2)。选取抑菌带边缘菌丝转接到新鲜的PDA平板培养基上培养5天，没有菌丝生长。
2.2菌株GKT04的内生性
对菌株GKT04进行抗Rif抗性诱导，经由低浓度到高浓度的逐步诱导筛选，获得一株菌落形态与原始菌株相似的、平板拮抗效果相近的抗Rif的GKT04-Rif突变菌株。将该突变菌株GKT04-Rif重新接种到香蕉幼苗上再进行分离，接种3d后，从香蕉幼苗根部检测到目标菌株的数量为1.6×103CFU/ml，假茎内部也检测到了该目标菌株，数量为2×102CFU/ml。接种5d后，香蕉幼苗根部和假茎内部该目标菌株的数量为5.3×103CFU/ml和1.07×104CFU/ml。表明该菌株GKT04-Rif已在植株体内进行繁殖和转移。
2.3菌株GKT04的稳定性
菌株GKT04传代10次后对对FOC4生理小种的平板拮抗抑制效果基本保持不变，抑菌率仍稳定在85.7％左右。
2.4菌株GKT04的鉴定
2.4.1菌株GKT04形态学及生理生化特征
菌株GKT04在LA培养基和NA培养基上生长良好，菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起。生理生化特征见表
表1菌株GKT04的生理生化特征
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain GKT04
| 鉴别特征 | 菌株GKT04 | 鉴别特征 | 菌株GKT04 |
| 革兰氏染色 | + | 明胶液化 | + |
| 氧化酶 | + | 酯酶 | - |
| 接触酶 | + | 牛奶水解 | + |
| 甲基红(M.R) | - | 精氨酸双水解酶 | - |
| V-P测定 | + | 脲酶 | + |
| 3-酮基乳糖 | - | PH＜5.6生长 | + |
| 纤维素水解 | - | 5％NaCl生长 | + |
| 七叶灵水解 | + | 4℃生长 | - |
| 淀粉水解 | - | 50℃生长 | + |
| 糖醇类发酵 | + |
注：+：阳性反应；-：阴性反应。
Note:+：Positive reaction；-：Negative reaction.
2.5菌株GKT04的16S rDNA序列分析：
PCR扩增菌株GKT04的16S rDNA序列后送华大测序，得到1445bp的序列，其DNA序列表：SEQ ID NO.1(见说明书的序列表)。将该序列在NCBI上进行BLAST比对，选取同源性较高的模式菌株，用MEGA 4.0软件，利用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图3)。菌株GKT04与Bacillus amyloliquefaciens处在同一分支，NCBI比对相似性为99％。
3、菌株GKT04对香蕉枯萎病的盆栽防控效果
CK为处理4，接空白NA液体培养基，7d后伤根，淋孢子悬浮液浓度为8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL；GKT04为处理3，先接内生菌剂GKT04，7d伤根，淋孢子悬浮液浓度为8.12×106CFU/mL的香蕉枯萎病致病菌FOC4菌液20mL。结果发现，20天后，CK和经菌株GKT04处理的部分植株都开始出现程度不同的发病症状。
并且随着时间的推移，病情指数逐渐升高。到48天后，CK病情指数达到66.67，而处理的病情指数为33.85；与对照相比，病情指数降低了49.23％(图4)。
4.菌株GKT04的促进香蕉植株的生长的研究分析
4.1同一生育阶段(外界种植的条件均相同)，经菌株GKT04处理的香蕉组培幼苗(GKT04)，与对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)相比较，无论是从株高、假茎围还是完全展开的最大叶面积均与对照之间存在着极显著性差异(见图5，经菌株GKT04处理的香蕉幼苗植株高度与对照相比，15d、30d、45d、60d时的增加量分别为32.32％，31.84％，16.6％，18.69％(见图6)。假茎围与对照相比，15d、30d、45d、60d时的增加量分别为16.26％，20.37％，24.33％，24.26％(见图7)。与对照相比，经菌株GKT04处理的香蕉幼苗完全展开最大叶面积在15d、30d、45d、60d时的增加量分别为47.62％，51.43％，39.21％，39.51％(见图8)。
4.2当育苗在60天收获时，经菌株GKT04处理的香蕉幼苗地上部分鲜重比对照组(CK清水处理)增加了34.05％；地上部分干重比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了40.39％；地下部分鲜重比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了61.54％；地下部分干重比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了62.5％；新增根数比对照增加了66.04％；新增叶片数比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了10.77％；最长根的长度比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了39.12％；叶片叶绿素含量比对照组(CK淋空白NA液体培养基处理)增加了36.39％(见表2)。
表2
实施例2：
一种微生物制剂，其是通过以下方法制备而得的：
(1)活化：将解淀粉芽孢杆菌GKT04接种于LA培养基中，于28℃下培养20h；
其中，LA培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：将经活化后的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株接种于NA液体培养基中，于29℃、170r/min下振荡，培养4h，得到种子培养液；
(3)发酵：将种子培养液以5％的接种比例接种于装有由淀粉15g/L、豆粕粉16g/L、葡萄糖7g/L、酵母膏1.5g/L、L-谷氨酸钠5g/L、硝酸钠1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁2g/L、氯化钠1.5g/L、吐温-20 1.5g/L，pH 6.8制成的发酵培养基的发酵罐中，于32℃、165r/min下培养，通入氖气进行培养，氖气的通入量为发酵罐体积的1/20，直至发酵液中95％以上的菌体产生芽孢，且芽孢的数量超过10亿个/mL，即可得到解淀粉芽孢杆菌GKT04发酵液；
(4)将发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，与右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪类化合物、碳酸氢钙混合均匀，即可得到一种微生物制剂；
其中，按照百分质量比计，发酵滤液50％、右旋糖16％、聚丙烯酰胺12％、二酮哌嗪类化合物18％、碳酸氢钙4％。
微生物菌剂是在质量浓度为20％氯化铵溶液活化至解淀粉芽孢杆菌GKT04菌的有效成分含量1×1010CFU/mL后使用。
实施例3：
一种微生物制剂，其是通过以下方法制备而得的：
(1)活化：将解淀粉芽孢杆菌GKT04接种于NA培养基中，于29℃下培养23h；
其中，LA培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：将经活化后的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株接种于NA液体培养基中，于28℃、150r/min下振荡，培养8h，得到种子培养液；
(3)发酵：将种子培养液以5％的接种比例接种于装有由淀粉10g/L、豆粕粉15g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏1g/L、L-谷氨酸钠3g/L、硝酸钠1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁1g/L、氯化钠1g/L、吐温-20 1g/L，pH 6.8制成的发酵培养基的发酵罐中，于30℃、150r/min下培养，通入氖气进行培养，氖气的通入量为发酵罐体积的1/20，直至发酵液中95％以上的菌体产生芽孢，且芽孢的数量超过10亿个/mL，即可得到解淀粉芽孢杆菌GKT04发酵液；
(4)将发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，与右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪类化合物、碳酸氢钙混合均匀，即可得到一种微生物制剂；
其中，按照百分质量比计，发酵滤液45％、右旋糖21％、聚丙烯酰胺15％、二酮哌嗪类化合物14％、碳酸氢钙5％。
微生物菌剂是在质量浓度为15％氯化铵溶液活化至解淀粉芽孢杆菌GKT04菌的有效成分含量3×1010CFU/mL后使用。
实施例4：
一种微生物制剂，其是通过以下方法制备而得的：
(1)活化：将解淀粉芽孢杆菌GKT04接种于LA培养基或者NA培养基中，于30℃下培养24h；
其中，LA培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g，pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：将经活化后的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株接种于NA液体培养基中，于30℃、180r/min下振荡，培养6h，得到种子培养液；
(3)发酵：将种子培养液以5％的接种比例接种于装有由淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、葡萄糖10g/L、酵母膏2g/L、L-谷氨酸钠6g/L、硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L、氯化钠2g/L、吐温-20 2g/L，pH 6.8制成的发酵培养基的发酵罐中，于34℃、180r/min下培养，通入氖气进行培养，氖气的通入量为发酵罐体积的1/20，直至发酵液中95％以上的菌体产生芽孢，且芽孢的数量超过10亿个/mL，即可得到解淀粉芽孢杆菌GKT04发酵液；
(4)将发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，与右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪类化合物、碳酸氢钙混合均匀，即可得到一种微生物制剂；
其中，按照百分质量比计，发酵滤液60％、右旋糖10％、聚丙烯酰胺10％、二酮哌嗪类化合物17％、碳酸氢钙3％。
微生物菌剂是在质量浓度为25％氯化铵溶液活化至解淀粉芽孢杆菌GKT04菌的有效成分含量5×1010CFU/mL后使用。
实施例5：
解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株得到的生物菌剂对植物枯萎病病害的田间防治试验
对引起香蕉枯萎病的防治试验于2015年安排在南宁武鸣县培桂基地实验用地进行，试验用地为缓坡地块，土壤为林地土壤。香蕉于3月1日前移栽，分5个小区，每个小区种有香蕉50株，且5次重复；分别于4月12日和5月26日喷施两次，每小区种的一组实验里每10株香蕉各喷施实施例2、实施例3、实施例4制备得到解淀粉芽孢杆菌GKT04生物制剂(活化至相应的有效成分的菌量的状态)，以50％施保功1500倍无菌水稀释液为药剂对照，以无菌水为空白对照，至8月16日和9月3日各调查一次病情指数，
病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100。
表3防治效果试验情况表
由上表可知，采用本申请的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株得到的生物菌剂对香蕉枯萎病有较好的防效，且防治效果与上述病害主用对照药剂拥有更好的防治效果。
本发明中使用了右旋糖能提供糖份作为能源物质，也能改善土壤的结构，防止土壤板结，使得土壤疏松，增加土壤的透气性，降低植株本体产生温度过高或者过湿，能有效的降低引起发病的因子；聚丙烯酰胺作为保水剂，能使得酸不溶物的土壤颗粒与高分子化合物的极性集团或带电基团作用，颗粒与高分子化合物结合，形成体积庞大的团粒结构，因为高分子化合物的极性或带电荷的基团很多，能够在短时间内使土壤形成团粒结构，使土壤疏松，增加土壤的透气性，两者结合是从根部解决植株内部温度来调控发病的影响因子。二酮哌嗪类化合物能够降低解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株的活性，从而将解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株在一定时间段降低活性，防止解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株不断进行分裂到达对数期后走向衰亡期，产生大量的内毒素，从而降低活性和有效成分；在得到的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株的发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，也是为了能清除内毒素，从而减少菌剂本身还有的内毒素的量；碳酸氢钙作为条件菌种的生长环境的酸碱度的调节剂，能保证菌株具有一定的活性，在使用的时候，能快速的激活其活性。综上所述，两种物质的调控使得菌种具有适当的活性，既不积极的不断进行分裂之后产生大量内毒素，也不失活性，能快速被调控激活活性，在喷施作物时发挥菌株的最佳活性，从而大大的提高防治病菌的效率。这四种物质从植株体本身和菌株发挥活性的调控相结合来调控防病的作用，效果显著，具有极大的推广性和可行性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 解淀粉酶芽孢杆菌
<400> 1
cggggggggt gctataatgc agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120
ccggggctaa taccggatgg ttgtctgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg 180
gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420
aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540
aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct 1260
gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt atggagccag ccgccgaagg 1440
tgaac 1445
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：该菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GKT04，CCTCC NO：M2016784；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年12月26日。
2.根据权利要求书1所述一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述该菌株在LA培养基或NA培养基上生长良好，菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起，镜检呈杆状，具鞭毛，有芽孢；在pH 5.0-9.0、20℃-50℃的环境下都能够生长；革兰氏染色呈阳性；氧化酶、接触酶测定为阳性；甲基红(M.R)测定呈阴性；在pH 7.0时V-P测定生成红色化合物；3-酮基乳糖检测呈阴性；七叶灵水解检测呈阳性；纤维素水解、淀粉水解检测呈阴性；牛奶水解、糖醇类发酵检测呈阳性；明胶液化试验呈阳性；脲酶反应呈阳性；酯酶反应、精氨酸双水解酶检测呈阴性；在含有2％-5％的NaCl的LA培养基和NA培养基上均能生长。
3.根据权利要求书1所述一种解淀粉芽孢杆菌在防治植物枯萎病中的应用，或在制备防治植物枯萎病的微生物制剂中的应用。
4.根据权利要求书3所述的应用，其特征在于：所述植物为香蕉。
5.一种微生物制剂，其特征在于：含有如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的全培养液培养物和如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的芽孢。
6.根据权利要求5所述的一种微生物制剂，其特征在于：其是通过以下方法制备而得的：
(1)活化：将解淀粉芽孢杆菌GKT04接种于LA培养基或者NA培养基中，于28-30℃下培养20-24h；
其中，LA培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉12.5g，pH 7.0，121℃灭菌20min；
NA培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖4g，琼脂粉12.5g，pH 7.0，121℃灭菌20min；
(2)种子培养：将经活化后的解淀粉芽孢杆菌GKT04菌株接种于NA的液体培养基中，于28-30℃、150-180r/min下振荡，培养4-8h，得到种子培养液；
(3)发酵：将种子培养液以5％的接种比例接种于装有发酵培养基的发酵罐中，于30-34℃、150-180r/min下培养，通入氖气进行培养，氖气的通入量为发酵罐体积的1/20，直至发酵液中95％以上的菌体产生芽孢，且芽孢的数量超过10亿个/mL，即可得到解淀粉芽孢杆菌GKT04发酵液；
(4)将发酵液通过聚酰胺微孔滤膜进行过滤分离取发酵滤液，与右旋糖、聚丙烯酰胺、二酮哌嗪类化合物、碳酸氢钙混合均匀，即可得到一种微生物制剂；
其中，按照百分质量比计，发酵滤液45％-60％、右旋糖10％-21％、聚丙烯酰胺8％-15％、二酮哌嗪类化合物13％-20％、碳酸氢钙3％-5％。
7.根据权利要求书6所述的一种微生物制剂，其特征在于：所述发酵培养基由以下成分制成：淀粉10-20g/L、豆粕粉15-20g/L、葡萄糖5-10g/L、酵母膏1-2g/L、L-谷氨酸钠3-6g/L、硝酸钠1-2g/L、磷酸氢二钾1-2g/L、硫酸镁1-3g/L、氯化钠1-2g/L、吐温-20 1-2g/L，pH6.8。
8.根据权利要求书6所述的一种微生物制剂，其特征在于：所述微生物菌剂是在质量浓度为15％-25％氯化铵溶液活化至解淀粉芽孢杆菌GKT04菌的有效成分含量1×1010CFU/mL-5×1010CFU/mL后使用。
9.根据权利要求书1所述的一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：所述筛选具体包括以下步骤：
A：取香蕉表面消毒后的根部组织在研钵中，加入为香蕉根部组织10倍的无菌水进行研磨，取滤液，稀释至10-1000倍后，取稀释液100μL涂布于LA培养基平板上，于28℃条件下倒置培养3-5天，挑取菌落呈淡黄色，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起，镜检呈杆状，具鞭毛，有芽孢的菌落；
B：用平板对峙法从步骤A挑取的菌落中筛选出对香蕉枯萎病菌有抑菌作用的菌株。
10.根据权利要求书9所述的一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：在步骤A中，消毒的具体操作是用质量浓度为75％的酒精漂洗1min 30S，无菌水冲洗1次；再放入质量浓度为3.25％的NaClO溶液中浸泡10min，用无菌水冲洗3次；最后放入质量浓度为75％的酒精漂洗30S，无菌水冲洗4次；
在步骤B中，所述平板对峙法具体步骤为：将直径为10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌饼，接种于PDA培养基平板中央，用灭菌的接种环挑取分离的菌落在距菌饼两侧2.5cm处划线，倒置，28℃下培养得到有抑菌作用菌株，转入LA培养基平板上培养保存。
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Application publication date: 20170517 Assignee: Guangxi Zhongnong Food Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980045914 Denomination of invention: A Bacillus subtilis for starch hydrolysis and its application Granted publication date: 20200714 License type: Common License Record date: 20231108 |