含有2,5-二酮哌嗪衍生物作为活性成分的农药
背景
技术领域
本发明涉及一种含有能够控制植物病害并促进植物生长的2,5-二酮哌嗪衍生物或其在农业上可接受的盐作为活性成分的农药。
背景技术
2,5-二酮哌嗪具有多种生物活性[Prasad,C.,Peptides1995,16,151-164]。特别地,已知骨架上具有脯氨酸的2,5-二酮哌嗪衍生物可以识别多种受体并调控其活性并且充当多种酶的抑制剂[Wang,H.J.,Med.Chem.2000,43,1577;Houston,D.R.J.,Med.Chem.2004,47,5713]。然而,2,5-二酮哌嗪衍生物通过诱导植物中的病原体抗性基因的表达来抑制病原体增殖的能力从来没有在文献中报道过,而是被本发明的发明人首次发现。
当植物被病原体入侵或被物理性损害时,会产生信号转导分子保护自己[Stout M.J.;Fidantsef,A.L.;Duffey,S.S.;Bostock,R.M.,Physiology andMolecular Plant Pathology,1999,54,115-130]。水杨酸和茉莉酸是代表性的植物信号转导分子。当植物防御机制为抵御外部入侵而启动时,信号转导分子水杨酸触发植物中的基因如PR-1、BGL-2、PR-5、SID-2、EDS-5和PAD-4的表达。同时,茉莉酸诱导基因如PDF1.2、VSP、HEL、THI-2、FAD3、ERS1和ERF1的表达[Dong,X.,Current Opinion in Plant Biology,1998,1,316-323;Glazebrook,J.,Current Opinion in Plant Biology,1999,2,280-286;Bostock,R.M.,Physiology and Molecular Plant Pathology,1999,55,99-109]。特别地,PR-1基因是由水杨酸诱导的与病原体抗性相关的标记基因。PR-1基因的表达是植物中信号转导的明显证据。当产生PR蛋白质时,植物获得对病原体包括细菌的的抗性。此外,PDF1.2基因是植物中由茉莉酸诱导的与病原体抗性相关的标记基因。PDF1.2基因的表达是植物中防御机制的信号转导的明显证据[Reymond,P.;Farmer E.E.,Current Opinion in Plant Biology,1998,1,404-411]。
市售的植物信号转导分子包括苯并-1,2,3-噻唑-7-硫代甲酸-S-甲酯(BTH)。BTH是化学结构类似水杨酸的合成化合物并且被报道在大麦中诱导对引起白粉病的麦白粉病菌(Blumeria graminis)的抗性[Faroro,F.;Maffi,D.;Cantu,D.;Iriti,M.,Biocontrol,2008,53,387-401]和在植物中诱导对臭氧的抗性[Iriti,M.;Rabotti,G.;Ascensao,A.;Faoro,F.,J.Agric Food Chem.2003,51,4308-4314],在葡萄中诱导对引起灰霉病的灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抗性并促进白藜芦醇和花青素的生物合成[Iriti,M.;Rossoni,M.;Borgo,M.;Faoro,F.,J.Agric Food Chem.2004,52,4406-4413],并且在草莓中诱导对白粉菌的抗性和酚类的积累[Hukkanen,A.;Kokko,H.I.;Buchala,A.J.;McDougall,G.J.;Stewart,D.;Karenlamp,S.O.;Karjalainen,R.O.,J.AgricFood Chem.2007,55,1862-1870]。BTH和水杨酸一样诱导PR-1基因的表达,但它不诱导PDF1.2基因的表达。
如上所述,当自身防御信号转导分子如水杨酸和茉莉酸诱导基因如PR-1或PDF1.2表达时,植物能抑制病原体的增殖并耐受物理性损害。也就是说,自身防御能力在植物中被诱导。因此,由于植物无需抗菌剂或杀菌剂的帮助就可以获得对病原体的抗性,所以有能力表达这些基因的物质作为农药具有重大价值。
包括在本发明的农药中作为活性成分的2,5-二酮哌嗪衍生物是在烘焙的咖啡豆(Ginz,M.;Engelhardt,U.H.,J Agric.Food Chem.,2000,48,3528-3532)、可可果实(Stark,T.;Hofmann,T.,J Agric.Food Chem.,2005,53,7222-7231)、啤酒(Gautschi,M.;Schmid,J.P.;Peppard,T.L.;Ryan,T.P.;Tuorto,R.;Yang,X.,J Agric.Food Chem.,1997,45,3183-3189)、煮熟的牛肉(Chen,M.Z.;Dewis,M.L.;Kraut,K.;Merrit,D.;Reiber,L.,Trinnaman,L.;Da Costa,N.C.,J.Food Sci.,2009,74,C100-C105)等中发现的天然物质。因此,很有可能的是,包含2,5-二酮哌嗪衍生物作为活性成分的农药将作为毒性非常低的环境友好的农药使用。
本发明的发明人首次发现2,5-二酮哌嗪衍生物作为植物中的信号转导分子诱导植物病原体抗性基因PR-1和PDF1.2,并显示了即使不直接处理受损部位时,控制植物病害的效果和促进植物生长的效果。
概述
本发明的目的是提供2,5-二酮哌嗪衍生物作为农药的用途。
在其中一个方面,本发明提供了一种包含选自由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物的化合物和其在农业上可接受的盐作为活性成分的农药:
[化学式1]
其中
R1和R6相同或不同,其各自为氢原子或C1-C6的直链或支链烷基;
R2、R3、R4和R5相同或不同,其各自为氢原子或是由选自以下的取代基所取代或未取代的C1-C6的直链或支链烷基,所述取代基选自羟基、巯基、氨基、胍基、氨基甲酰基、羧基、C1-C6烷氧羰基、C1-C6烷硫基、三苯甲硫基、乙酰氨基、苯基、羟基苯基、咪唑基和吲哚基,
其中R2和R3之一可与R1连接以形成5-到7-员的稠环或R4和R5之一可与R6连接以形成5-到7-员的稠环。
因为由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物具有至少一个手性碳,所以本发明的农药可能包含由化学式1表示的作为外消旋体或异构体的化合物。
本发明的农药促进植物的茎、叶、根等的生长。
当对植物进行处理时,本发明的农药通过病原体抗性基因PR-1和PDF1.2的表达诱导植物病害抗性蛋白生产从而显著减少病变并且因此抑制病原体的感染和增殖。也就是说,本发明的农药通过植物的自身防御机制诱导对病原体的抗性。
此外,本发明的农药通过持续地诱导植物的自身防御机制显示了甚至在未处理的部位对植物病害的控制效果。例如,如果将试剂处理在植物的根、茎或叶上,它的效果也表现在果实中。
因为本发明的农药显示出控制由细菌、病毒或真菌引起的植物病害如软腐病、立枯病、纹枯病(blight)、枯萎病(withering)、斑点病或花叶病的优异效果,所以它作为能够代替现有杀微生物剂的环境友好型农药使用。
本发明的农药在茄科(Solanaceae)植物如马铃薯、红辣椒、番茄等,葫芦科(Cucurbitaceae)植物如黄瓜、西瓜、甜瓜等,中国十字花科(ChineseBrassicaceae)植物如白菜、莴苣、萝卜、卷心菜、芹菜等和紫苏、草莓、大葱、大蒜、生姜、洋葱等中显示出优越的功效。
本发明的其它特征和方面将由以下详细的说明书、附图和权利要求体现。
附图的简要说明
将参照在附图中描述的某些示例性的实施方案对本发明的上述及其它目的、特征和优点进行详细描述,所述实施方案仅以举例的方式在下文中给出,因此并没有限制本发明,并且其中:
图1示出在拟南芥(thale cress)中用26、27、24、35、23、43、44和34号化合物处理后的病原体抗性诱导基因PR-1的活性;
图2示出在拟南芥中用29号化合物处理后PR-1和PDF1.2基因的表达;
图3示出在拟南芥中用33号化合物处理后PR-1和PDF1.2基因的表达;
图4示出在烟叶中由胡萝卜软腐欧文氏菌SCC1(Erwinia carotovoraSCC1)引起的软腐病在1、2、3、4和5号化合物处理后的抑制效果;
图5示出在烟叶中由果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)引起的软腐病在25、28、29、30和31号化合物处理后的抑制效果;
图6示出在烟叶中由果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorum SCC1)引起的软腐病在56、57、58、60、61、62、63和67号化合物处理后的抑制效果;
图7示出在烟叶中由果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)引起的软腐病在24、25、26、27、29和68号化合物处理后的抑制效果;
图8示出在烟叶和黄瓜叶中由果胶杆菌SCC1(Pectobacteriumcarotovorum SCC1)引起的病变在3号化合物处理后的抑制效果;
图9示出在红辣椒果实中由炭疽菌(Colletotrichum acutatum)引起的病变在30号化合物处理后的抑制效果;
图10示出在白菜叶中由果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的细菌性软腐病造成的病变在25、26和29号化合物处理后的抑制效果;和
图11示出用100ppm的28、29、26和30号化合物处理后对白菜叶生长的促进效果。
详述
在下文中将详细参照本发明的各种实施方案,其实例在附图中被描述并如下文所述。虽然将结合示例性实施方案对本发明进行描述,但是可以理解的是,本说明书不意图将本发明限制到这些示例性实施方案中。相反地,本发明不仅意图覆盖示例性实施方案,并且还意图覆盖所附权利要求定义的本发明的精神和范围所包括的各种替换,修改,等同形式和其它实施方案。
本发明涉及一种作为农药的活性成分,其包括由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物或其在农业上可接受的盐。
如本发明所使用,术语在农业上可接受的盐可包括,例如金属盐、有机碱盐、无机酸盐、有机酸盐、碱性氨基酸盐或酸性氨基酸盐等。合适的金属盐可包括,例如,碱金属盐如钠盐、钾盐等,碱土金属盐如钙盐、镁盐、钡盐等,铝盐等。有机碱盐可包括例如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、2,6-二甲基吡啶盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、环己胺盐、二环己基胺盐、N,N-二苄基乙二胺盐等。无机酸盐可包括例如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。有机酸盐可包括例如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、邻苯二甲酸盐、富马酸盐、草酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。碱性氨基酸盐可包括例如精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐等。酸性氨基酸盐可包括例如天冬氨酸盐,谷氨酸盐等。
特别地,在由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物中,R1和R6相同或不同,其各自为氢原子、甲基、乙基或丙基;R2、R3、R4和R5相同或不同,其各自为氢原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲乙基、1-甲丙基、2-甲丙基、羟甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、咪唑-4-基-甲基、2-甲硫基乙基、苄基、4-羟基苄基、苯乙基、巯基甲基、甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、三苯甲基硫甲基、2-三苯甲基硫乙基、2-乙氧羰基乙基、2-甲氧羰基乙基、甲氧羰基甲基、2-甲氧羰基乙基、乙氧羰基甲基、2-氨基乙基、氨基甲酰基甲基、2-氨基甲酰基乙基、乙酰氨基甲基、2-乙酰氨基乙基、羧甲基、2-羧乙基、咪唑-4-基甲基、2-(咪唑-4-基)乙基、3-胍基丙基、吲哚-3-基甲基或2-(吲哚-3-基)乙基。R2和R3之一可以通过-(CH2)3-连接到R1以形成5员环或R4和R5之一可以通过-(CH2)3-连接到R6以形成5员环。
由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物的具体实例如下:
3-羟甲基-6-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-异丙基-2,5-二酮哌嗪,
3-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-2,5-二酮哌嗪,
3,6-二甲基-2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-6-(2-甲基乙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-巯基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-三苯甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-苄基-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-巯基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-三苯甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-苄基-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(4-羟基苄基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-异丙基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲基丙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(1-甲基丙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(吲哚-3-基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
八氢吡咯并[1,2-a:1’,2’-d]吡嗪-5,10-二酮,
3-羟甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(1-羟乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(4-羟苄基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-氨基甲酰基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲硫基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-氨基甲酰基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-巯基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-甲硫基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-三苯甲硫基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲氧羰基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲氧羰基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-氨基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-羧乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-羧甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(咪唑-4-基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,和
3-(2-乙酰氨基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物的化学结构及其合成方法在文献中已有描述[Akiyama等人,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.11989,235;Gordon等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1995,5,47;Carlsson,A.C.Tetrahedron Lett.2006,47,5199;Lopez-Cobenas,A.Synlett.2005,1158;Boehm等人,J.Org.Chem.1986,51,2307]。并且,本发明的发明人已开发出一种通过环化线性二肽化合物经由一锅法直接合成由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物的方法,所述线性二肽化合物是通过加热到80-180°C时使水溶剂中的两种氨基酸化合物缩合得到的[Kyung Seok Park,Surk Sik Moon,In Seok Hong,第2010-0039551号韩国专利申请(Apr.28,2010)]。
因为由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物或其在农业上可接受的盐能促进植物生长并诱导植物对由细菌、病毒或真菌引起的软腐病、立枯病、纹枯病、枯萎病、斑点病或花叶病等的抗性,因此它作为农药的活性成分是有用的。包括由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物作为活性成分的农药可以用于蔬菜,如马铃薯、红辣椒、甘椒、番茄、黄瓜、烟草、西瓜、甜瓜、莴苣、白菜、芹菜、油菜、花生、卷心菜、大葱、大蒜、生姜、洋葱等。特别地,可以用于双子叶植物,如烟草、白菜、红辣椒、黄瓜、马铃薯、西红柿等。
本发明的农药可以仅包括由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物或其在农业上可接受的盐作为活性成分。供选择地,本发明的农药可以包括0.001-99wt%,特别是0.005-30wt%的活性成分,还可以包括赋形剂作为余量。所述赋形剂可为常规使用的微生物剂、抗菌剂、稀释剂或载体。此外,为了提高功效或扩大应用,除了活性成分,也可以添加市售的或已开发的其它杀微生物剂、杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂或肥料。
本发明的农药中包括的赋形剂或稀释剂可以是在农业中常规使用的。例如,可以使用氧化物如硅藻土、熟石灰等,磷酸盐如磷灰石等,硫酸盐如石膏等,矿物粉末如粘土、高岭土、膨润土、酸性粘土、石英、硅土等。除了这些固体载体,还可包括填充剂、抗凝剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂等。本发明的农药可根据本领域已知的方法配制,以使活性成分可以立即释放、以持续方式或者延迟方式释放。可以通过混合活性成分和通常用于配方的添加剂如表面活性剂、稀释剂、分散剂、辅助剂等将其配制成可湿性粉剂、混悬剂、乳油、乳剂、微乳剂、可溶性液剂、可分散液剂、水分散性颗粒剂、颗粒剂、粉剂、可悬浮液剂、水分散性颗粒剂、漂浮颗粒剂或片剂。
本发明的农药可以根据本领域通常使用的方法施用于植物。对于对植物的施用,可以直接喷涂或施用于植物的叶、茎、枝、根或种子或可以混合到用于育苗的土壤、泥土或介质中。如果植物在水中生长,可以在水上处理以控制病害。特别地,该农药可以通过施用、浸泡、熏蒸或喷涂处理。例如,该农药可以喷洒到泥土或植物的叶、茎、种子、花或果实上。为了对植物施用本发明的农药,可以将其在水或合适的介质中稀释。
为了研究本发明的农药诱导对植物病害的抗性和促进植物生长的能力,进行了各种试验。
首先,在经本发明的2,5-二酮哌嗪化合物处理拟南芥后检测抗真菌基因PR-1和PDE1.2的表达。因为拟南芥丰富的变异有助于理解疾病抗性机制,所以它经常用于疾病抗性研究。在由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪化合物处理过的试验组中观察到抑制植物病害的PR-1和PDE1.2基因的表达显著增加。因此,可以看出,本发明的农药通过抑制病原体的感染和增殖,提供了优异的预防和治疗植物病害的效果。确实,当用本发明的2,5-二酮哌嗪化合物处理具有融合到GUS基因中的PR-1α启动子的烟叶后,PR-1α-GUS的活性与对照组相比显著增加,同时炭疽病与对照组相比降低了50%。此外,为了证实本发明的农药预防植物病害的效果,对烟草、白菜、黄瓜、红辣椒和白菜施用了由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪化合物的溶液,并评估了其对软腐病或炭疽病的抑制效果。当用由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物处理植物后,与未经处理的对照组或经对照剂(BTH)处理的组相比,对植物病害的抑制效果显著提高。此外,可以观察到的是,当以本发明的农药处理植物时,植物生长与对照组相比提高34.9%。本发明的农药抑制植物病害和促进植物生长的效果将在实施例部分更详细地描述。
因此,由于本发明的农药能够诱导植物的疾病抗性并促进植物生长,因此它作为下一代农药具有巨大价值。
实施例
本发明将通过合成实施例和实施例更详细地描述,然而本发明的范围并没有因此被限制。
[合成实施例]
典型合成实施例。2,5-二酮哌嗪衍生物的合成。
将L-或D-氨基酸甲酯盐酸盐(0.5g,3.6mmol)溶解在10ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。然后,加入二异丙基乙胺(DIEA;0.78g,6.0mmol)、各种L-或D-Boc-氨基酸(3.0mmol)和O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU;1.37g,3.6mmol)。在室温下搅拌反应12hr后,在减压下将DMF从反应混合液中去除。剩下的混合物用乙酸乙酯稀释,并用碳酸氢钠和盐水洗涤。在用无水硫酸钠去除水后,在减压下将有机层浓缩。通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷)纯化浓缩物,得到线性的N-Boc-二肽。将线性N-Boc-二肽加到圆底烧瓶中,并且每1mmol的线性N-Boc-二肽加入20ml水。此后,将反应容器固定到装备有压力控制阀的不锈钢灭菌装置中。闭合灭菌装置并将反应混合物的温度维持在130℃下4小时。通过降低温度停止反应后,灭菌装置的压力降低。在减压下去除水后,剩余的浓缩物通过硅胶柱色谱法(甲醇/MC)纯化,得到纯的2,5-二酮哌嗪衍生物。制备的化合物的核磁共振光谱数据在下面给出。它们与从文献中得到的数据一致。
根据典型合成实施例的方法制备的化合物描述于表1中。
表1
1号化合物,白色固体,1H-NMR(CD3OD-d4,400MHz)δ0.95(d,J=6Hz,3H),0.95(d,J=6Hz,3H),1.80(m,2H),1.85(m,1H),3.67(dd,J=4.4Hz和12.8Hz,1H),3.92(m,1H,重叠),3.90(t,J=3.6Hz,1H),3.92(m,1H),13C NMR(CD3OD-d4,100MHz)δ20.6,22.4,23.8,45.0,53.4,57.8,62.7,167.6,170.2。
2号化合物,无色晶体,mp241-244°C,1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.21(1H,s),7.95(1H,s),3.78(2H,d),3.65-3.56(2H,m),1.76-1.72(1H,m),1.52-1.48(1H,t),0.87-0.83(6H,d),13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ169.3,166.9,53.5,44.9,42.8,24.2,23.5,22.4。
3号化合物,白色固体,1H-NMR(CD3OD-d4,400MHz)δ0.93(d,J=6.4Hz,3H),0.94(d,J=6.4Hz,3H),1.23(d,J=6.8Hz,3H),1.72(m,1H),1.85(m,1H),1.86(m,1H重叠),3.71(d,J=2.4Hz,1H),3.87(dd,J=4.0Hz和9.0Hz,1H),4.17(dq,J=6.4Hz,1H),13C NMR(CD3OD-d4,100MHz)δ18.5,20.2,22.2,23.6,45.0,53.2,60.8,67.3,168.0,170.4。
4号化合物1H-NMR(CD3OD-d4,400MHz)δ0.95(d,J=6.4Hz,3H),0.97(d,J=6.8Hz,3H),1.65(m,1H),1.67(m,1H),1.80(m,1H),3.82(d,J=17.6Hz,1H),3.88(m,1H),4.00(d,J=17.6Hz,1H),13CNMR(CD3OD-d4,100MHz)δ20.6,22.0,23.8,42.4,43.8,53.3,167.4,170.1。
5号化合物,白色固体,mp280-284°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ10.92(1H,s),8.09(1H,s),7.75(1H,s),7.53(1H,d),7.31(1H,d),7.04(2H,m),6.93(1H,t),4.00(1H,d),3.32-3.21(2H,dd),2.98(1H,dd),2.76(1H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ168.6,166.3,136.6,128.1,125.2,121.5,119.3,119.1,111.8,109.0,56.1,44.5,29.8。
6号化合物,白色固体,mp210-215°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.98(2H,s),3.68(4H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ166.7(2C),45.0(2C)。
7号化合物,白色固体,mp210-212°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.13(1H,s),7.94(1H,s),3.81(1H,q),3.70(1H,d),1.22(3H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ169.5,166.9,50.3,45.1,19.3。
8号化合物,白色晶体,mp245-247°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.06(2H,s),3.85(2H,q),1.21(6H,d);13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ169.7(2C),50.4(2C),19.1(2C)。
9号化合物,白色固体,mp220-222°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.10(1H,s),7.96(1H,s),3.83(1H,q),3.65(1H,s),2.14-2.10(1H,m),1.24(3H,d),0.91(3H,d),0.80(3H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ169.3,167.3,60.0,50.3,31.7,20.7,19.1,17.5。
10号化合物,白色固体,mp276-280°C(dec),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.23(1H,s),8.01(1H,s),7.95(1H,s),6.89(2H,d),6.62(2H,d),4.05(1H,s),3.56(1H,q),3.01-2.96(1H,dd),2.73-2.68(1H,dd),0.50(3H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ168.3,166.6,156.8,131.9(2C),126.5,115.5(2C),56.2,50.4,38.2,20.4。
23号化合物,白色固体,mp147-149°C,Rf0.16(0.5:9.5MeOH/MC),1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.05(2H,d),6.77(2H,d),5.72(1H,s),4.21(1H,dd),4.08(1H,t),3.66-3.59(1H,m),3.56-3.51(1H,m),3.44-3.39(1H,m),2.75(1H,dd),2.29(1H,m),2.02-1.96(1H,m),1.94-1.83(2H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ169.8,165.3,155.6,130.5(2C),127.4,116.3(2C),59.3,56.4,45.6,36.1,28.5,22.7;HR-TOF-ESI-MS(m/z):C14H16N2O3(M+H)+理论值261.1161,测量值261.1226;[α]D=-71.3°(c0.5,MeOH)。
24号化合物,白色固体,Rf0.33(MeOH:MC/0.5:9.5),mp133-135°C,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.36-7.21(5H,m),5.62(1H,s),4.25(1H,dd),4.05(1H,t),3.66-3.54(3H,m),2.74(1H,dd),2.36-2.30(1H,m),2.05-1.87(3H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ169.6,165.2,136.1,129.5(2C),129.3(2C),127.78,59.3,56.3,45.6,36.9,28.5,22.7。
25号化合物,白色固体,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.25(1H,dd,J=9.2,1.6,Hz),4.17(1H,q,J=11.6,6.0Hz),3.51(2H,m),2.30(1H,m),1.96-2.05(3H,m),1.37(3H,d,J=6.8Hz)。
26号化合物,白色固体,mp177-179°C,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.19(1H,brt,J=8.0Hz),4.03(1H,brs,H3),3.46-3.59(2H,m),2.48(1H,m),2.31(1H,m),1.95(1H,m),1.89~2.04(2H,m),1.09(3H,d,J=7.2Hz),0.93(3H,d,J=7.2Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ171.4,166.4,60.3,58.8,45.0,28.7,28.3,22.1,17.6,15.5。
27号化合物,白色固体,mp161-163°C,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.25(1H,brt,J=8.0Hz),4.12(1H,m),3.51(2H,m),2.30(1H,m),2.01(1H,m),1.89-2.01(2H,m),1.88(1H,m),1.85(1H,m),0.96(3H,d,J=6.8Hz),0.95(3H,d,J=6.8Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ171.6,167.7,59.1,53.4,45.2,38.2,27.9,24.6,22.5,22.1,22.0。
28号化合物,mp104-105°C,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.68(1H,s),4.01(1H,t),3.93(1H,s),3.92-3.50(2H,m),2.36-2.25(2H,m),2.02-1.93(2H,m),1.88-1.85(1H,m),1.40-1.36(1H,m),1.21-1.15(1H,m),1.02(3H,d),0.88(3H,t),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.4,165.3,60.7,58.9,45.3,35.5,28.7,24.2,22.5,15.9,12.3。
29号化合物,白色固体,mp152-156°C,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.28(1H,s),4.05(1H,t),4.03(1H,s),3.84(2H,dd),3.61-3.50(2H,m),2.36-2.31(1H,m),2.06-1.98(2H,m),1.91-1.87(1H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.4,163.8,58.7,46.8,45.5,28.6,22.6。
30号化合物,白色固体,Rf0.16(0.5:9.5MeOH/MC),1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.05(2H,d,J=8.4Hz),6.77(2H,d,J=8.4Hz),5.72(1H,s),4.21(1H,d,J=6.4Hz),4.08(1H,t,J=6.8Hz),3.66-3.59(1H,m),3.56-3.51(1H,m),3.44-3.39(1H,m),2.75(1H,dd,J=10.0,14.4Hz),2.29(1H,m),2.02-1.96(1H,m),1.94-1.83(2H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ169.8,165.3,155.6,130.5(2C),127.4,116.3(2C),59.3,56.4,45.6,36.1,28.5,22.7;ESI-MS(m/z):C14H16N2O3(M+H)+理论值261.1161;测量值261.1226;[α]D=-71.3°(c0.5,MeOH)。
31号化合物,白色固体,mp140-141°C,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.10(2H,t),3.45(4H,dd),2.28-2.22(2H,m),2.14-2.09(2H,m),1.94-1.92(2H,m),1.84-1.89(2H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ166.6(2C),60.7(2C),45.3(2C),27.8(2C),23.5(2C)。
32号化合物,白色固体,mp152-156°C,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.40(1H,s),4.10(2H,t),3.97(2H,dd),3.60-3.52(2H,m),2.36-2.30(1H,m),2.06-1.98(2H,m),1.90-1.86(1H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.5,165.2,61.2,59.2,56.7,45.5,28.4,22.7。
33号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.09(1H,s),4.27(1H,dd),4.01(2H,t),3.88(1H,d),3.57-3.50(1H,m),3.47-3.41(1H,m),2.29-2.23(1H,m),2.04-1.90(3H,m),1.86-1.81(1H,m),1.27(3H,d),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.7,165.5,65.8,59.6,59.1,45.5,28.2,22.8。
34号化合物,白色固体,mp148-151°C,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.28-7.31(3H,m),7.18(2H,dd,J=7.2,2.4Hz),4.20(1H,t,J=4.8Hz),3.53(1H,dt,J=12.0,8.4Hz),3.27-3.33(1H,m),3.19(1H,dd,J=14.0,4.8Hz),2.99(1H,dd,J=14.0,4.8Hz),2.60(1H,t,J=6.4Hz),2.02(1H,m),1.90(1H,m),1.67(1H,m),1.61(1H,m),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.1,166.2,135.5,130.1,128.5,127.3,58.6,57.9,45.0,39.8,28.6,21.3。
35号化合物,白色固体,mp144-146°C,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ6.97(2H,d,J=8.4Hz),6.71(2H,d,J=8.4Hz),4.14(1H,t,J=4.4Hz),3.53(1H,dt,J=12.0,8.4Hz),3.30(1H,m),3.10(1H,dd,J=14.0,4.0Hz),2.87(1H,dd,J=14.0,4.0Hz),2.60(1H,dd,J=10.4,6.4Hz),2.05(1H,m),1.90(1H,m),1.65(1H,m),1.64(1H,m),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.2,166.4,157.1,131.1,125.8,115.2,58.7,58.0,44.9,39.0,28.7,21.3。
36号化合物,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(1H,dd,J=10,6.4Hz),3.64-3.57(2H,m),3.48(H,m),2.34(1H,m),2.13(1H,sext,J=6.6Hz),2.01(1H,m),1.86-1.90(2H,m),1.01(3H,d,J=7.2Hz),0.98(3H,d,J=7.2Hz)。
38号化合物,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.26(1H,dd,J=10,6.0Hz),3.90(1H,ddd,J=17.6,6.4,1.2),3.58(1H,m),3.48(1H,m),2.34(1H,m),2.01(1H,m),1.88-1.94(2H,m),1.43(3H,d,J=7.2Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.0,168.2,59.4,54.6,46.8,30.1,23.1,20.0。
39号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.33(1H,s),4.20(1H,t,J=5.6Hz),4.10(1H,t,J=8.2Hz),3.61-3.48(2H,m),2.69(2H,t,J=7.0Hz),2.41-2.28(2H,m),2.10(3H,s),2.07-1.93(3H,m),1.91-1.84(1H,m)。
40号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.55(1H,s),4.05(2H,m),3.63-3.56(1H,m),3.50-3.44(1H,m),2.65-2.51(2H,m),2.38-2.31(1H,m),2.05(3H,s),2.01-1.80(4H,m),1.80-1.70(1H,m)。
41号化合物,白色固体,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.29(1H,dd,J=10.8,6.4Hz),4.18(1H,ddd,J=12.8,8.8,2.0),3.66(1H,dd,J=2.0,0.8),3.60-3.48(2H,m),2.32(1H,m),2.01(1H,m),1.80-1.94(2H,m),1.23(3H,d,J=7.2Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ172.6,168.0,70.6,64.7,60.2,46.6,30.2,23.0,20.1。
43号化合物,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.23(1H,dd,J=9.8,6.8Hz),3.67(1H,d,J=6.4Hz),3.60(1H,m),3.48(H,m),2.34(1H,m),2.0(1H,m),1.86-1.90(3H,m),1.59(1H,m),1.22,(1H,m),0.99(3H,d,J=7.2Hz),0.94(3H,d,J=7.6Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.4,167.7,62.3,58.5,45.6,39.8,29.1,24.8,21.7,14.5,10.4。
44号化合物,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.25(1H,dd,J=9.2,6.8Hz),3.84(1H,dd,J=9.6,5.2Hz),3.48-3.56(2H,m),2.33(1H,m),1.90-2.04(3H,m),1.76(1H,m),1.67,(1H,ddd,J=14.8,10.0,6.0Hz),1.56(1H,ddd,J=13.6,8.4,5.2Hz),0.98(3H,d,J=6.4Hz),0.96(3H,d,J=6.4Hz),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.4,167.9,58.1,55.9,45.5,42.3,28.7,24.3,21.9,22.1,20.7。
45号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.01-3.96(4H,m),3.34-3.27(2H,m),2.46-2.39(2H,m),2.07-1.98(2H,m),1.94-1.86(2H,m),1.81-1.73(2H,m)。
46号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.30(1H,s),4.09(1H,t),4.05(1H,s),3.91(2H,dd),3.63-3.52(2H,m),2.39-2.33(1H,m),2.08-2.00(2H,m),1.95-1.87(1H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.1,163.6,58.5,46.5,45.2,28.4,22.3。
47号化合物,白色固体,1HNMR(DMSO-d6,,400MHz)δ9.29(1H,s),8.10(1H,d),6.89(2H,d),6.65(2H,d),3.90(1H,dd),3.42(1H,dd),3.20-3.14(1H,m),2.92-2.82(2H,m),2.76(1H,dd),1.98-1.91(2H,m),1.78-1.72(1H,m),1.59-1.54(1H,m),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ168.3,164.8,156.3,130.7(2C),125.8,115.0(2C),58.1,57.1,44.5,38.6,28.5,21.2。
48号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.44(1H,s),4.05(1H,dd,J=8.8,6.4Hz),3.91-3.86(1H,m),3.63-3.56(1H,m),3.53-3.45(1H,m),2.35-2.31(1H,m),2.00-1.93(2H,m),1.89-1.71(2H,m),1.64-1.59(2H,m),0.97(3H,d,J=6.8Hz),0.94(3H,d,J=6.8Hz),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.0,166.7,58.2,56.4,45.7,42.8,29.1,24.6,23.2,22.4,21.6。
49号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.98(1H,s),4.09(1H,t,J=6.8Hz),3.73-3.62(1H,m),3.53-3.47(1H,m),2.41-2.35(1H,m),2.23-2.16(1H,m),2.04-1.96(1H,m),1.94-1.82(2H,m),1.03(3H,d,J=6.8Hz),0.88(3H,d,J=6.8Hz)。
50号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.99(1H,s),4.11-4.08(2H,m),3.61-3.47(2H,m),2.35-2.27(1H,m),2.13-1.82(3H,m),1.45(3H,d,J=6.8Hz),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.8,166.6,59.4,51.3,45.6,28.3,22.9,16.0。
53号化合物,白色固体,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.25(1H,dd,J=9.2,1.6,Hz),4.17(1H,q,J=11.6,6.0Hz),3.51(2H,m,H9),2.30(1H,m),1.96-2.05(3H,m),1.37(3H,d,J=6.8Hz)。
54号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.05(2H,d,J=8.4Hz),6.77(2H,d,J=8.4Hz),5.72(1H,s),4.21(1H,d,J=6.4Hz),4.08(1H,t,J=6.8Hz),3.66-3.59(1H,m),3.56-3.51(1H,m),3.44-3.39(1H,m),2.75(1H,dd,J=10.0,14.4Hz),2.29(1H,m),2.02-1.96(1H,m),1.94-1.83(2H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ169.8,165.3,155.6,130.5(2C),127.4,116.3(2C),59.3,56.4,45.6,36.1,28.5,22.7。
55号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.40(1H,s),4.10(2H,t),3.97(2H,dd),3.60-3.52(2H,m),2.36-2.30(1H,m),2.06-1.98(2H,m),1.90-1.86(1H,m),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.5,165.2,61.2,59.2,56.7,45.5,28.4,22.7。
56号化合物,白色固体,1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.18(1H,d),5.04(1H,d),4.12(1H,dd),3.98-3.95(1H,m),3.43-3.28(3H,m),2.13-2.08(1H,m),1.85-1.79(1H,m),1.77-1.63(2H,m),1.07(3H,d),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ169.1,164.8,67.8,62.6,57.6,44.4,28.3,21.1,19.8。
57号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.55(1H,s),4.05(2H,m),3.63-3.56(1H,m),3.50-3.44(1H,m),2.65-2.51(2H,m),2.38-2.31(1H,m),2.05(3H,s),2.01-1.80(4H,m),1.80-1.70(1H,m)。
58号化合物,白色固体,1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.28-7.31(3H,m),7.18(2H,dd,J=7.2,2.4Hz),4.20(1H,t,J=4.8Hz),3.53(1H,dt,J=12.0,8.4Hz),3.27-3.33(1H,m),3.19(1H,dd,J=14.0,4.8Hz),2.99(1H,dd,J=14.0,4.8Hz),2.60(1H,t,J=6.4Hz),2.02(1H,m),1.90(1H,m),1.67(1H,m),1.61(1H,m),13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ170.1,166.2,135.5,130.1,128.5,127.3,58.6,57.9,45.0,39.8,28.6,21.3。
59号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.1(1H,s),4.08(1H,dd),3.77(1H,dd),3.70-3.63(1H,m),3.51-3.46(1H,m),2.40-2.34(1H,m),2.03-1.82(4H,m),1.59-1.50(1H,m),1.25-1.18(1H,m),1.00(3H,d),0.92(3H,t),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ169.8,165.5,63.0,58.5,45.8,39.8,29.5,24.7,22.1,15.4,11.5。
61号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.56(1H,s),4.10(1H,t,J=8.4Hz),3.99(1H,dd,J=9.2,3.6Hz),3.60-3.47(2H,m),2.32-2.27(1H,m),2.11-1.94(3H,m),1.90-1.85(1H,m),1.82-1.73(1H,m),1.53-1.46(1H,m),0.97(3H,d,J=6.8Hz),0.92(3H,d,J=6.8Hz),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.6,166.5,59.2,53.6,45.6,38.7,28.2,24.8,23.4,22.9,21.4。
62号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.17(1H,s),4.08(1H,t,J=8.0Hz),3.92(1H,s),3.66-3.59(1H,m),3.55(1H,m),2.65-2.58(1H,m),2.39-2.33(1H,m),2.08-1.98(2H,m),1.93-1.83(1H,m),1.07(3H,d,J=7.2Hz),0.88(3H,d,J=7.2Hz)。
63号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.30(1H,s),4.29(1H,dd),4.05(2H,t),3.89(1H,d),3.57-3.50(1H,m),3.47-3.41(1H,m),2.29-2.23(1H,m),2.04-1.90(3H,m),1.86-1.81(1H,m),1.28(3H,d),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.5,165.6,65.7,59.7,59.1,45.4,28.2,22.7,19.4。
64号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ6.57(1H,s),4.04(1H,t),3.93(1H,s),3.63-3.47(2H,m),2.35-2.24(2H,m),2.02-1.93(2H,m),1.88-1.85(1H,m),1.43-1.35(1H,m),1.22-1.15(1H,m),1.04(3H,d),0.90(3H,t),13CNMR(CDCl3,100MHz)δ170.3,165.3,60.7,58.9,45.3,35.5,28.7,24.2,22.5,15.9,12.0。
68号化合物,白色固体,Rf0.26(1.0:9.0MeOH/MC),1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.96(1H,s),7.41(1H,s),6.90(1H,s),4.34(1H,t,J=6.2Hz),4.18(1H,t,J=7.8Hz),3.40-3.35(1H,m),3.29-3.27(1H,m),2.70(1H,dd,J=5.6,16Hz),2.28(1H,dd,J=6.4,16Hz),2.15-2.08(1H,m),1.91-1.74(3H,m),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ172.1,170.4,166.2,59.2,52.1,45.5,35.3,28.2,23.0。
70号化合物,白色固体,1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.33(1H,s),4.20(1H,t,J=5.6Hz),4.10(1H,t,J=8.2Hz),3.61-3.48(2H,m),2.69(2H,t,J=7.0Hz),2.41-2.28(2H,m),2.10(3H,s),2.07-1.93(3H,m),1.91-1.84(1H,m)。
80号化合物,白色固体,1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.29(1H,s),8.10(1H,d,J=3.2Hz),6.89(2H,d,J=8.4Hz),6.65(2H,d,J=8.0Hz),3.90(1H,d,J=4.4Hz),3.42-3.58(1H,m),3.20-3.14(1H,m),2.92-2.82(2H,m),2.76(1H,dd,J=13.6,4.8Hz),1.98-1.91(2H,m),1.80-1.72(1H,m),1.61-1.52(1H,m),13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δ168.3,164.8,156.3,130.7,125.8,115.0,58.1,57.1,44.5,38.6,28.5,21.2。
[实施例]
实施例1拟南芥中病原体抗性相关基因PR-1和PDF1.2的表达
在用本发明的2,5-二酮哌嗪化合物处理拟南芥后,如下所述测量抗真菌抗性诱导基因的表达。
试验中使用野生型(Col-0)和转化型(用nahG基因抑制PR基因的表达)拟南芥。拟南芥获得自Ohio State University Stock Center(Ohio StateUniversity,Columbus,Ohio,USA)。已知的是,NahG转化的植物编码水杨酸脱氢酶并降解水杨酸(SA)。将拟南芥的种子表面灭菌(浸入70%的乙醇中2min后浸入1%的次氯酸钠中20min)。将种子用无菌蒸馏水洗涤4次后,放入含有0.8%琼脂和1.5%蔗糖(pH5.7)的Murashige-Skoog(MS)培养基(GibcoBRL)的陪替氏培养皿中。在4°C的阴凉处放置2天以允许种子发芽。将得到的幼苗放入人工培养箱中,在40瓦的荧光灯下设置为12hr/12hr亮/暗循环。分别将相对湿度和温度维持在50%-60%和22±1°C。2周后,将幼苗移植到60ml的盛有盆栽土的盆中,所述盆栽土用蒸汽灭菌两次,间隔24hr,每次1hr。进一步地,将植物栽培到维持在70%相对湿度并具有9hr/15hr亮(200的μE/m2s,24°C)/暗(20°C)循环的培养箱中。每隔一天对植物浇水并且每周一次用改良的的半强度Hoagland营养液处理。2周后,通过土壤浸润将0.1、1.0或10ppm的试验化合物施用于该拟南芥。通过土壤浸润将试验化合物施用于拟南芥12hr或24hr后,从植物中取得叶组织用于RNA分析。通过用等体积的提取缓冲液(0.35M甘氨酸,0.048M NaOH溶液,0.34M氯化钠,0.04M EDTA,4%(重量/体积)SDS)对至少2g的冰冻组织进行匀浆以提取拟南芥的总RNA。随后,用苯酚和氯仿萃取得到的均质悬浮液后,用LiCl沉淀RNA。根据Kishimoto的方法[Kishimoto,K.等人,2005.PlantCellPhysiol,46:1093-1102]使用Ex Taq聚合酶(Takara Biomedicals,日本)进行RT-PCR。将0.1μg cDNA、各10pmol的正向引物和反向引物、250nmol的dNTP和0.5U的Ex Taq聚合酶加入到20μL缓冲液中制得反应混合物。使用PTC-100(MJ Research,美国)进行PCR。在94℃下变性5min后,进行94℃下1min和57°C下1min的25个循环。在72℃下进行最后的延伸10min。对于PDF1.2基因,5'-TGCGGTAACACCGAACCATAC-3'(SEQID NO:1)用作正向引物并且5'-CGACAGTTGCATTGGTCCTCT-3'(SEQ IDNO:2)用作反向引物。对于PR-1a基因,5'-AACCGCCAAAAGCAAACGCA-3'(SEQ ID NO:3)用作正向引物并且5'-TCACGGAGGCACAACCAAGTC-3'(SEQ ID NO:4)用作反向引物。扩增的PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶(LAS-3000,Fuji Photo Film Co.Ltd.,Japan)上分析。其结果在图1-3中示出。
从图1-3中看出,在野生型拟南芥中,与对照组相比,用本发明的化合物处理的试验组显示出抗真菌基因PR1和PDF1.2表达增强。同时,在不能表达PR基因的nahG-转化的拟南芥中,用本发明的化合物处理的试验组显示未表达PR1基因,但是PDF1.2基因与对照组相比表达增强。在用浓度为1.0ppm的本发明的化合物处理的试验组中基因表达增强最多。
实施例2烟叶中的PR-1α-GUS活性
使用注射器将每种试验化合物的稀释液100μL注入培养3周的烟草幼苗的第二片叶中,所述烟草幼苗具有与GUS基因融合的PR-1α启动子(Xanthinc)。3天以后,用软木塞钻孔器从邻近的叶取内径5毫米的样品。将样品放入1.5mL的Eppendorf管,加入20μL的GUS萃取缓冲液后研磨并在8000g下离心3min。将等体积的2mM4-甲基伞形酮酰基-β-葡萄糖苷酸(MUG)溶液加入到上清液后,在37℃下反应1hr。加入960μL的终止缓冲液(0.2M碳酸钠)制成1ml溶液,使用TKO100荧光计(Hoefer ScientificInstruments,美国)测定荧光。使用4-甲基伞形酮(MU)作为校正荧光强度的标准试剂并且按MU-mM/10mg样品/小时测定GUS活性。结果在表2示出。
表2
对烟叶的炭疽(anthractic)病变数目和PR-1α-GUS活性的效果
实施例3抑制植物病害的效果
使用本发明的2,5-二酮哌嗪化合物处理植物后,如下所述对抑制植物病害的效果进行评估。
将12个烟草或黄瓜的种子种植到塑料盆中(直径10cm×高13cm),并放入黄色的箱子。将100μL的试验化合物注入黄瓜或烟草最先发芽的子叶中。在处理前将试验化合物溶解在20%的甲醇中制备成原液(5000),并将原液稀释到1、10和100ppm的浓度。
7天后,将在TSA培养基中培养27hr的引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorum SCC1)以108cfu/mL的浓度喷洒到植物叶片上。在30℃下培养植物3天后,将在GBA(绿豆琼脂)培养基中培养约2-3周以诱发孢子的引起炭疽病的炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)以105个细胞/mL的浓度喷洒并在26°C下培养植物1天。当第四片叶或第五片叶萌发时,将200μL的每种试验化合物注入第三片叶中。7天后,以108cfu/mL的浓度将致软腐病的细菌喷洒到植物的叶片上后,在30°C下培养植物3天。
目视检查后,从0到100%评估软腐病变的面积,并对炭疽病变的数目进行计数。
对烟草软腐病抑制效果的试验结果在表3-5和图4-6中给出。
表3
对烟叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
表4
对烟叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
表5
对烟叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
对黄瓜软腐病的抑制效果的试验结果在表6-8和图7中给出。
表6
对黄瓜叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
表7
对黄瓜叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
表8
对黄瓜叶中引起软腐病的果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorumSCC1)引起的病变的抑制效果
|
1ppm |
10ppm |
100ppm |
56号化合物 |
5 |
80 |
70 |
57号化合物 |
70 |
72.5 |
60 |
58号化合物 |
75 |
57.5 |
80 |
59号化合物 |
30 |
32.5 |
80 |
60号化合物 |
50 |
60 |
27.5 |
61号化合物 |
5 |
70 |
75 |
63号化合物 |
82.5 |
42.5 |
50 |
64号化合物 |
50 |
55 |
65 |
BTH |
100 |
100 |
100 |
对照 |
100 |
100 |
100 |
LSD(p=0.05) |
42.3 |
53.2 |
39.9 |
对黄瓜炭疽病的抑制效果的试验结果在表9中给出。
表9
对黄瓜的第一片叶和第二片叶中由炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)引起的炭疽病变的抑制效果
从表3-9中可见,与对照组相比,用2,5-二酮哌嗪化合物处理的试验组显示出对软腐菌或炭疽菌(Colletotrichum acutatum)在烟草和黄瓜中引起的植物病害的极佳抗性。特别地,10-100 ppm浓度处理的试验组显示出非常优异的抗病性。
并且,从图4-8中可见,与对照组或使用对照剂苯并-1,2,3-噻唑-7-硫代甲酸-S-甲酯(BTH)处理的那些相比,用2,5-二酮哌嗪化合物处理的试验组显示出对植物病害的优异抗性。
表9示出测试第一片叶和第二片叶以研究试剂的效果是否在某段时间内保持的试验结果。观察到的是,与对照试剂(BHT)相比,本发明的农药的效果在第二片叶上保持相对较高。因此,可以看出,本发明的农药的效果保持很长时间。
实施例5.在红辣椒果实中抑制炭疽病的效果
为了研究本发明的农药诱导的对植物病害的抗性的系统效果,进行了以下实验。
用0.1、1.0或10.0ppm的试验化合物通过土壤浸润处理30cm高的红辣椒幼苗(6周)。10天后,将红辣椒果实摘下并放入潮湿的塑料箱中。为了诱导炭疽病,将10μL炭疽菌(Colletotrichum acutatum)的孢子悬浮液(1x105个分生孢子/mL)滴加到每个红辣椒果实的表面。在28°C的潮湿条件下一周后,检查到炭疽病的出现。
红辣椒果实中对炭疽病的抑制效果的实验结果在表10和图9中给出。
表10
对红辣椒果实中引起炭疽病的炭疽菌(Colletotrichum acutatum)引起的病变的抑制效果
从表10中看出,与对照组相比,经本发明的化合物处理的试验组显示炭疽病的出现明显更低。从图9中看出,在对照组中能观察到炭疽病变,而在经30号化合物处理的组中很难观察到。因此,可以看出,即使本发明的农药施用于土壤中,它的效果也能在果实中观察到。
实施例6夏天溶液培养的白菜中软腐病的抑制效果
为了研究本发明的化合物是否对细菌性软腐病有效而进行以下试验。
将试验化合物喷洒到溶液培养的白菜上,一周后检查到自然产生的软腐病。白菜是低温蔬菜,并且在炎热的夏季显示非常差的生长以及由果胶杆菌SCC1(Pectobacterium carotovorum SCC1)引起的严重的细菌性软腐病。因此,不需要人工诱导软腐病,而是研究了3-4片叶的叶片病变面积以确保统计均一性。
在白菜叶中对细菌性软腐病的抑制效果的试验结果在表11和图10中给出。
表11
在夏天溶液培养的白菜中对由果胶杆菌SCC1(Pectobacteriumcarotovorum SCC1)引起的软腐病的抑制效果
试验化合物 |
出现的软腐病(%) |
25号化合物(20ppm) |
19 |
28号化合物(20ppm) |
49 |
29号化合物(20ppm) |
14 |
对照 |
58 |
LSD(p=0.05) |
7 |
从表11和图10中看出,本发明的化合物在白菜中示出显著抑制软腐病的效果。特别地,25号化合物和29号化合物在白菜中示出非常优异的对软腐病的抑制效果。因此,可以看出,本发明的化合物对生长环境非常差的植物也是有用的。
实施例7促进植物生长的效果
为了证实本发明的化合物促进植物生长的效果,进行了以下实验。
将植物叶片用试验化合物浸泡。七天后,测量叶片的宽度并接种植物致病性病原体。3-5天后,再次测量叶片的宽度并与对照组比较叶片的生长。
对黄瓜叶的植物生长促进效果的实验结果在表12中给出。对白菜叶的植物生长促进效果的实验结果在图11中示出。
表12
黄瓜叶生长的促进效果
从表12中看出,与对照组相比,本发明的化合物对植物生长的促进高达34.9%。因此,因为本发明的化合物不仅诱导对植物病害的抗性并且促进植物生长,所以它作为农药具有重大价值。
[配方实施例]
以下提供了包括由化学式1表示的化合物作为活性成分的农药用于不同目的的典型的配方实施例。
配方实施例1可湿性粉剂
将10g化学式1表示的化合物、10g NK250L(表面活性剂)、10g白炭和70g叶蜡石(稀释剂)混合并研磨来制备可湿性粉剂。
配方实施例2乳油
将10g化学式1表示的化合物、10g DDY2000(表面活性剂)和80g二甲苯混合来制备乳油。
配方实施例3可悬浮液剂
将10g化学式1表示的化合物、10g HY1910(表面活性剂)、5g丙二醇、0.2g黄原胶、0.15g KM-73(防泡剂)、0.2g杀菌剂LS(防腐剂)、0.1g KNP(增稠剂)和74.35g水(稀释剂)混合并在球磨机中研磨来制备可悬浮液剂。
配方实施例4漂浮颗粒剂
将5g化学式1表示的化合物、7.5g石蜡油、2g烷基磺酸基琥珀酸钠(表面活性剂)、3g白炭、1.2g黄原胶、0.8g聚丙烯酸钠和80.5g氯化钾混合并用往复式挤压机制粒,然后干燥来制备漂浮颗粒剂。
配方实施例5颗粒剂
将5g化学式1表示的化合物、2.5g HY1910(表面活性剂)、0.2g NK250L(表面活性剂)、0.5g苏打灰、2.0g糊精、25g膨润土和64.8g滑石粉用水捏合,并用往复式挤压机制粒后干燥来制备颗粒剂。
配方实施例6组合试剂
组合试剂通过用市售的并且为化学式1表示的化合物的重量的20wt%以内的杀菌剂、杀虫剂、除草剂或其混合物替换配方实施例1-5中用作活性成分的由化学式1表示的化合物来制备。
如上详述,由于本发明的农药显示出控制由细菌、病毒或真菌引起的植物病害如软腐病、立枯病、纹枯病、枯萎病、斑点病或花叶病的优异效果,并且当施用于各种植物如红辣椒、黄瓜、马铃薯、番茄等时可以促进植物生长,因此它可以用作能够显示这些效果的农药,即使不直接施用于病变部位。
本发明参照其特定实施方案详细描述。然而,本领域技术人员将会理解,在不偏离所附权利要求和其等同方式所限定的本发明的原则和精神所定义的本发明原则和精神的前提下,这些实施方案中可进行各种变化和修改。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种农药,所述农药包括选自由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物的化合物和其在农业上可接受的盐作为活性成分:
[化学式1]
其中,
R1和R6各自为氢原子;
R2、R3、R4和R5相同或不同,其各自为氢原子或是由选自以下的取代基所取代或未取代的C1-C6的直链或支链烷基,所述取代基选自羟基、巯基、氨基、胍基、氨基甲酰基、羧基、C1-C6烷氧羰基、C1-C6烷硫基、三苯甲硫基、乙酰氨基、苯基、羟基苯基、咪唑基和吲哚基;
其中R2和R3之一可与R1连接以形成5-到7-员的稠环,或R4和R5之一可与R6连接以形成5-到7-员的稠环。
2.根据权利要求1所述的农药,其中所述由化学式1表示的2,5-二酮哌嗪衍生物是外消旋体或异构体。
3.根据权利要求1所述的农药,其中:
R1和R6各自为氢原子;
R2、R3、R4和R5相同或不同,其各自为氢原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲乙基、1-甲丙基、2-甲丙基、羟甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、咪唑-4-基-甲基、2-甲硫基乙基、苄基、4-羟基苄基、苯乙基、巯基甲基、甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、三苯甲基硫甲基、2-三苯甲基硫乙基、2-乙氧羰基乙基、2-甲氧羰基乙基、甲氧羰基甲基、2-甲氧羰基乙基、乙氧羰基甲基、2-氨基乙基、氨基甲酰基甲基、2-氨基甲酰基乙基、乙酰氨基甲基、2-乙酰氨基乙基、羧甲基、2-羧乙基、咪唑-4-基甲基、2-(咪唑-4-基)乙基、3-胍基丙基、吲哚-3-基甲基或2-(吲哚-3-基)乙基,
其中R2和R3之一通过-(CH2)3-连接到R1以形成5员环,或R4和R5之一通过-(CH2)3-连接到R6以形成5员环。
4.根据权利要求1所述的农药,所述农药包括选自以下的2,5-二酮哌嗪化合物或其在农业上可接受的盐作为活性成分:
3-羟甲基-6-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-甲基丙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-异丙基-2,5-二酮哌嗪,
3-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-2,5-二酮哌嗪,
3,6-二甲基-2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-6-(2-甲基乙基)-2,5-二酮哌嗪,
3-甲基-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-巯基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(2-三苯甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-苄基-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(1-羟乙基)-6-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-巯基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(2-三苯甲硫基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-苄基-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(4-羟基苄基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(2-甲丙基)-6-(吲哚-3-基甲基)-2,5-二酮哌嗪,
3-(4-羟基苄基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-异丙基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲基丙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(1-甲基丙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(吲哚-3-基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
八氢吡咯并[1,2-a:1’,2’-d]吡嗪-5,10-二酮,
3-羟甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(1-羟乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(4-羟苄基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-苄基六氢吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-氨基甲酰基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲硫基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-氨基甲酰基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-巯基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-甲硫基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-三苯甲硫基甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲氧羰基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-甲氧羰基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-氨基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-羧乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(2-羧甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,
3-(咪唑-4-基甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,和
3-(2-乙酰氨基乙基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
5.根据权利要求1所述的农药,还包括一种或多种选自以下的物质作为活性成分:杀微生物剂、杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂和肥料。
6.根据权利要求1所述的农药,将所述农药配制成可湿性粉剂、混悬剂、乳油、乳剂、微乳剂、可溶性液剂、可分散液剂、水分散性颗粒剂、颗粒剂、粉剂、可悬浮液剂、水分散性颗粒剂、漂浮颗粒剂或片剂。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的农药,所述农药促进植物生长、提供抵御植物病害的诱导性系统抗性(ISR)或两者兼具。
8.根据权利要求7所述的农药,其中所述植物病害为软腐病、立枯病、纹枯病、枯萎病、斑点病或花叶病。
9.根据权利要求7所述的农药,其中所述植物为双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的农药,其中所述双子叶植物选自烟草、白菜、红辣椒、黄瓜、马铃薯和番茄。
11.一种用于促进植物生长的方法,所述方法包括使用根据权利要求1到6中任一项所述的农药处理植物。
12.根据权利要求11所述的用于促进植物生长的方法,其中所述植物为双子叶植物。
13.根据权利要求12所述的用于促进植物生长的方法,其中所述双子叶植物选自烟草、白菜、红辣椒、黄瓜、马铃薯和番茄。
14.一种用于预防或抑制植物病害的方法,所述方法包括使用根据权利要求1到6中任一项所述的农药处理植物。
15.根据权利要求14所述的用于预防或抑制植物病害的方法,其中所述植物为双子叶植物。
16.根据权利要求15所述的用于预防或抑制植物病害的方法,其中所述双子叶植物选自烟草、白菜、红辣椒、黄瓜、马铃薯和番茄。
17.根据权利要求14所述的用于预防或抑制植物病害的方法,其中所述植物病害为软腐病、立枯病、纹枯病、枯萎病、斑点病或花叶病。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
修改说明
1.申请人于2012年2月18日收到关于PCT/KR2011/005198的检索报告,并在PCT19条下作出修改。
2.国际检索报告声明本发明不能取得专利,由于D1(US04140790)公开了一种2,5-二酮哌嗪衍生物作为用于预防番茄病害的化合物(表1中描述的化合物20)。
3.因此,申请人对权利要求1和3描述的取代基R1和R6的范围进行了如下缩小,以使本发明涉及具有D1未公开的新型结构的化合物和含有该化合物的农药。
4.我们认为该修改在在国际申请时提交的原始说明书的范围内,并且该修改未扩大或改变权利要求的范围。
HALLA Patent&Law Firm