CN107624768B

CN107624768B - 环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用

Info

Publication number: CN107624768B
Application number: CN201710717668.1A
Authority: CN
Inventors: 邓音乐; 宋施豪; 付书娜; 孙秀云; 邓海飞; 神方芳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-08-21
Also published as: CN107624768A

Abstract

本发明公开了环二肽cyclo‑((S)‑pro‑(R)‑Ile在防治青枯病中的应用。本发明发明人首次发现了环二肽cyclo‑((S)‑pro‑(R)‑Ile对青枯菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。本发明提供的环二肽cyclo‑((S)‑pro‑(R)‑Ile的制备方法，是以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ‑34为菌种，经过培养、分离和提纯得到；该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。

Description

环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治领域，特别涉及环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用。

背景技术

植物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的一种维管束毁灭性土传细菌性病害，在亚热带、热带和温带地区发生普遍系统侵染的毁灭性土传病害，俗称“植物瘟病”。青枯劳尔氏菌寄主广泛，可侵染54个科的450余种植物。目前，细菌性青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严重，尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严重损失。

青枯菌有很多小种，根据青枯菌的寄主范围分为5个生理小种，小种1主要危害多数茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子和烟草等，还危害其他科植物；小种2能侵染香蕉、海里康(Heliconais)和大蕉等植物；小种3主要危害马铃薯，也可弱侵染烟草和番茄；小种4侵染姜以及弱侵染马铃薯等其他植物。另有研究人员将从我国南方桑树上分离到的青枯病菌株命名为小种5。侵染马铃薯的青枯病菌主要是小种l和小种3。

目前，青枯病的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难以有效控制青枯病发生，抗性材料的选育耗时长，而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。

因此，有必要寻找一种更为高效的防治青枯病的化合物。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其中，环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile的结构式如式I所示：

所述的环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile通过如下步骤制备得到：

(1)将大肠埃希氏菌GZ-34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离；在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜去除不溶物，得到含活性成分的有机溶液I；

(2)用葡聚糖凝胶LH-20装柱，将含活性成分的有机溶液I上样，通过葡聚糖凝胶LH-20吸附活性成分；再用甲醇洗脱，每收集250ml甲醇洗脱液为一个组分；收集第4个组分，经过旋转蒸发后溶解在甲醇中，过0.22μm的滤膜去除不溶物。

(3)对步骤(2)去除不溶物的馏分4进行半制备高效液相层析；其中，溶剂A相为0.1％(v/v)甲酸，溶剂为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯乙腈；洗脱程序为：30％B，0-30min；30％B到100％B，30-30.1min；100％B，30.1-42min；100％B到30％B，42-42.1min；30％B，42.1-50min；流速为3.0mL min^-1，收集第26-29min的洗脱液，冻干，得到环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile。

步骤(1)中所述的大肠埃希氏菌GZ-34，保藏编号为CCTCC NO:M 2016353，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 105969707 A公开。

步骤(1)中所述的发酵所用的发酵培养基优选为LB培养基。

所述的LB培养基的组成如下：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0～7.2。

步骤(1)中所述的发酵的条件优选为于35～37℃，200～250rpm发酵；更优选为于37℃、220rpm发酵。

步骤(1)中所述的发酵的程度优选为达到大肠杆菌的对数生长期或稳定期；更优选为OD₆₀₀＝3。

步骤(1)中所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的离心的条件优选为8000～12000×g离心10～20min；更优选为10000g离心15min。

步骤(1)中所述的乙酸乙酯的用量优选为与所述的上清液等体积。

步骤(2)中所述的用葡聚糖凝胶LH-20装柱中的柱子优选为柱高1.0m，柱直径5cm。

步骤(3)中所述的半制备高效液相层析中的柱子优选为C18半制备柱Phenomenex,Gemini-NX 5μm C18 110A,250×10.0mm。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发明人首次发现了环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile对青枯菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。

(2)本发明提供的环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile的制备方法，是以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ-34为菌种，经过培养、分离和提纯得到；该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。

附图说明

图1是环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile的质谱图。

图2是环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile的核磁图。

图3是环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile对青枯菌的抑制效果图。

图4是环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile对青枯菌的MIC的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、菌种和培养基

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ-34，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016353，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 105969707 A公开。

青枯菌GMI1000，购买自ATCC。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH 7.0-7.2。121℃灭菌20分钟。

LB液体培养基：与LB固体培养基的区别仅在于：不含琼脂。

TTC固体培养基的配制：胰蛋白胨10g，酸水解酪蛋白1g，葡萄糖5g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH6.8-7.2；121℃灭菌20分钟，得到基本培养基。TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)用蒸馏水配成0.1％(w/v)溶液并用细菌过滤器过滤灭菌，在基本培养基倒平板前(冷却至约45℃)，每100mL基本培养基加入0.5mL 0.1％(w/v)TTC溶液。

TTC液体培养基：不含琼脂。

2、实验步骤

2.1培养基配制

配制如步骤1的培养基。

2.2大肠埃希氏菌GZ-34活化

取-80℃保存的大肠埃希氏菌GZ-34在LB平板上划线活化，37℃培养箱过夜培养。

2.3大肠埃希氏菌GZ-34发酵

LB固体培养基活化的大肠埃希氏菌GZ-34菌株，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，37℃、220r/min振荡培养，至OD₆₀₀达到3.0，10000×g离心15min去除菌体，收集上清液。

2.4环二肽的提取

向上清液中加入等体积的乙酸乙酯，混合均匀后倒入分液漏斗中静置分层，放出下层水相，从上面倒出上层有机相，旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，加入1mL甲醇溶解，过0.22μm的有机滤膜去除不溶物，得到粗提物，4℃保存。

2.5环二肽的初步分离

称取葡聚糖凝胶LH-20于干净三角瓶中，加入色谱甲醇浸泡24h后装柱，柱高1.0m，柱直径5cm，用3倍于葡聚糖凝胶的色谱甲醇冲洗干净后上样(即2.4得到的粗提物)，然后再用色谱甲醇洗脱，每250mL洗脱液收集到一个干净的三角瓶中为一个馏分，旋转蒸发仪蒸干甲醇后，再溶于0.5mL色谱甲醇中，过0.22μm的有机滤膜去除不溶物，然后分别检测每部分的抑菌活性。

2.6抑菌活性检测

抑菌活性的检测采用琼脂扩散法，取-80℃保存的青枯菌GMI1000在TTC平板上划线活化，28℃培养3天，挑取单菌落接种在10mL TTC液体培养基中，28℃220r/min振荡培养一天，再将青枯菌菌液加入到融化的TTC固体培养基中(冷却到45℃左右)倒成平板，凝固后用无菌打孔器(直径8mm)在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入10μl待测溶液，吹干后28℃倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈，发现第4个馏分有活性。

2.7环二肽的二次分离

对有抑菌活性的馏分4进行半制备高效液相层析(反相半制备柱反相C18半制备柱Phenomenex,Gemini-NX 5μm C18 110A,250×10.0mm；溶剂A相为0.1％(v/v)甲酸，溶剂为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯乙腈；洗脱程序为：30％B，0-30min；30％B到100％B，30-30.1min；100％B，30.1-42min；100％B到30％B，42-42.1min；30％B，42.1-50min；流速为3.0mL min^-1，收集26-29min得到化合物。

2.8环二肽的ESI-MS和NMR检测

ESI-MS检测：将化合物溶解于适量色谱甲醇中并过滤，ESI-MS分析(超高效液相四极杆串联飞行时间质谱联用仪)。

NMR检测：化合物的溶剂挥发干，溶解于氘代甲醇中，再转移到干净的核磁管中，进行NMR测定。测定类型包括：1H NMR,13C NMR，Dept135。

2.9结果

通过ESI-MS(见图1)和NMR检测(见图2)，确定化合物为环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile，相对分子质量226，其结构如式I所示。

实施例2：环二肽对青枯菌的抑菌活性测定

1、培养基

TTC培养基：同实施例1。

TTC液体培养基：同实施例1。

2、实验步骤

2.1培养基配制

同实例1。

2.2菌种活化

同实例1。

2.3活性检测

挑取青枯菌单菌落接种在10mL TTC液体培养基中，28℃220r/min振荡培养一天，再将0.1Ml的青枯菌菌液加入到10mL融化的TTC固体培养基中(冷却到45℃左右)倒成平板，凝固后用无菌打孔器(直径8mm)在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入10μl环二肽溶液，吹干后28℃倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈。

2.4环二肽对青枯菌的MIC

(1)青枯菌在TTC平板上活化后，挑取单菌落接种于10mL液体TTC培养基，28℃220rpm过夜；

(2)培养好的菌液用新鲜的液体TTC培养基稀释到OD600＝0.1，取96孔板，每孔加100μL稀释菌液；

(3)加入抑菌物质(即环二肽)，浓度分别为226、113、56.5、28.25、14.12μg/mL，另外加菌液和TTC培养基两个做对照，28℃200rpm培养一天。

(4)酶标仪检测OD₆₀₀的值。

3、结果

环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile对青枯菌具有很强抑菌效果，见图3；其对青枯菌的MIC为226μg/ml，见图4。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用。

2.根据权利要求1所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：所述的环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile通过如下步骤制备得到：

(2)用葡聚糖凝胶LH-20装柱，将含活性成分的有机溶液I上样，通过葡聚糖凝胶LH-20吸附活性成分；再用甲醇洗脱，每收集250ml甲醇洗脱液为一个组分；收集第4个组分，经过旋转蒸发后溶解在甲醇中，过0.22μm的滤膜去除不溶物；

3.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的发酵所用的发酵培养基为LB培养基。

4.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的发酵的条件为于35～37℃，200～250rpm发酵。

5.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的发酵的程度为达到大肠埃希氏菌的对数生长期或稳定期。

6.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的固液分离的方式为离心。

7.根据权利要求6所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：所述的离心的条件为8000～12000×g离心10～20min。

8.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的乙酸乙酯的用量为与所述的上清液等体积。

9.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的用葡聚糖凝胶LH-20装柱中的柱子的柱高为1.0m，柱直径为5cm。

10.根据权利要求2所述环二肽cyclo-(S)-pro-(R)-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的半制备高效液相层析中的柱子为C18半制备柱Phenomenex,Gemini-NX 5μm C18 110A,250×10.0mm。