CN113402471B - 来源于植物内生真菌的铁载体类化合物及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物，结构式如下所示：
Figure DDA0003079916170000011
所述铁载体类化合物是从粉红粘帚霉15020经过发酵培养分离获得。所述化合物具有抗耐药铜绿假单胞菌感染活性，可以提高线虫存活率。

Description

来源于植物内生真菌的铁载体类化合物及制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
粘帚霉(GliocladiHm)，属于半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，是一种分布广泛的土壤习居菌和重寄生菌，具有生长速度快、产孢量大、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多样等优点，被认为是目前已发现的拮抗微生物中极具潜力的生防因子之一。粉红粘帚霉(Clonostaehys rosea)是得到广泛的研究和应用的粘帚霉之一，属于丝状真菌。粉红粘帚霉的生存环境十分广泛，热带雨林，温带，靠近北极地区以及世界上的沙漠地带均有粉红粘帚霉分布。据报道，耕地、草地、荒野、淡水、海滩以及盐碱地都可能分离到粉红粘帚霉。C.rosea作为一种重要的生防菌，可寄生在多种具有危害性的植物病原真菌当中，产生几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等细胞壁降解酶，侵染其细胞壁，达到生物防治的作用，避免化学防治所带来的环境污染、农药残留以及病菌抗药性等问题。粉红粘帚霉还可以寄生在植病线虫的各种虫态(胞囊、卵、幼虫、雌虫等)中，产生具有杀线虫活性的次级代谢产物，例如化合物gliocladine A-E和verticillin A；除此之外还可以产生其它多种具有良好活性的天然产物，例如可以产生抗菌活性化合物cerebroside C和bionectriol A；具有植物毒性的化合物(-)-dihydrovertinolide；对L5178Y小鼠淋巴瘤细胞系表现出明显的细胞毒性的环肽类化合物Cyclo-(Gly-D-Leu-D-allo-Ile-L-Val-L-Val-D-Trp-β-Ala)；目前，由粉红粘帚霉产生的铁载体类化合物Clonocoprogens A和B显示出了具有对氯喹产生耐药性的恶性疟原虫菌株的中等抗疟活性和抗菌活性。选择此类化合物进行深入研究，对发现新结构、新活性的化合物和继续挖掘粉红粘帚霉的生物防治机理都具有良好的前景。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物。
本发明的第二个目的是提供一类所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一类所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物，结构式如下所示：
Figure BDA0003079916150000021
所述铁载体类化合物是从粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)经过发酵培养分离获得。
所述粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)(即建议的分类命名为：粉红螺旋聚孢霉)，已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.21037。
本发明的第二个方面提供了一种所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将固体发酵培养基灭菌，然后将体积百分比为5％的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质，将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物。
所述固体发酵培养基为大米：水(W:V)＝2：3，pH值自然。
所述固体发酵培养基灭菌是在121℃下灭菌20min。
所述种子液的制备方法包括以下步骤：在多个玻璃瓶中分别装入种子培养基，于115℃下灭菌30min，使用含有粉红粘帚霉的平板菌种由平板挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养5d，转速为220rpm，得到种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L。
所述种子培养基的pH值自然。
所述含有粉红粘帚霉的平板菌种的培养方法为：
将平板培养基在115℃下灭菌30min，制成平板，于28℃恒温培养3d，至表面水分稍干，无杂菌生长时，将粉红粘帚霉15020菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养10d，外观为肉红色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L。
所述平板培养基的pH值自然。
所述粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)的分离方法包括以下步骤：
将智利圣地亚哥新鲜草叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理：75％酒精漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，5％次氯酸钠溶液漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干水分，将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm2小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3～15d，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
所述菌株分离培养基的配制方法包括以下步骤：
土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
所述粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)的保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
所述将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物包括以下步骤：
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液过滤去除固体发酵物，收集上清液，将上清液浓缩蒸干，称重得到粗提物，经正己烷、乙酸乙酯和水进行三相萃取，将乙酸乙酯层浓缩蒸干称重，用甲醇作为流动相，用Sephadex LH-20柱洗脱，得到15个子组分N1-N15，N2组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-AR色谱柱进行纯化，流速为4.0mL/min，使用52％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物粉粘帚霉素D即化合物1、粉粘帚霉素D1即化合物2；N4组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-PFP色谱柱纯化，流速为4.0mL/min，使用55％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物粉粘帚霉素E即化合物3、粉粘帚霉素E1即化合物4。
本发明的第三个方面提供了一种所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备抗菌药物中的应用。
所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure BDA0003079916150000041
Figure BDA0003079916150000051
所述致病菌株为白色念珠菌菌株SC 5314。
本发明的第四个方面提供了一种所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备免疫细胞诱导增强药物中的应用。
所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure BDA0003079916150000052
Figure BDA0003079916150000061
Figure BDA0003079916150000071
所述免疫细胞诱导增强药物体现为诱导免疫细胞释放NO活性，所述免疫细胞为RAW264.7小鼠巨噬细胞。
本发明的第五个方面提供了一种所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备抗菌药物中的应用，所述致病菌为耐药铜绿假单胞菌。
所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure BDA0003079916150000072
Figure BDA0003079916150000081
所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物具有抗耐药铜绿假单胞菌感染活性，可以提高线虫存活率。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供四个铁载体类化合物粉粘帚霉素D(化合物1)、粉粘帚霉素E(化合物3)、N14-palmitoylcoprogen(化合物5)和Clonocoprogen C(化合物7)，以及三个铁载体生物合成前体粉粘帚霉素D1(化合物2)、粉粘帚霉素E1(化合物4)和N2-palmitoyl-N5-E-anhydromevalonyl-N5-hydroxy-L-ornithine(化合物6)。提取方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、质谱检测，其结构正确，其中化合物N14-palmitoylcoprogen(化合物5)对白色念珠菌具有很好的抑制活性。化合物粉粘帚霉素E(化合物3)、N14-palmitoylcoprogen(化合物5)和Clonocoprogen C(化合物7)起到提高RAW264.7小鼠巨噬细胞生成NO活性。所述化合物都具有抗耐药铜绿假单胞菌感染活性，可以提高线虫存活率。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)
地址：中国朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年12月16日
保藏编号：CGMCC NO：21037
分类命名：Clonostaehys rosea
附图说明
图1为本发明化合物粉粘帚霉素D-E和它们的生物合成前体粉粘帚霉素D1-E1的紫外谱图。
图2为本发明化合物粉粘帚霉素D的HR-ESI-MS谱图。
图3为本发明化合物粉粘帚霉素D1的HR-ESI-MS谱图。
图4为本发明化合物粉粘帚霉素E的HR-ESI-MS谱图。
图5为本发明化合物粉粘帚霉素E1的HR-ESI-MS谱图。
图6为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图7为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图8为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图9为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图10为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图11为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图12为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图13为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。
图14为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱。
图15为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱。
图16为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱。
图17为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱。
图18为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图19为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图20为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图21为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的HSQC谱图。
图22为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图23为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图24为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图25为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的HMBC谱图。
图26为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的NOESY谱图。
图27为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的NOESY谱图。
图28为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的NOESY谱图。
图29为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的NOESY谱图。
图30为化合物3、5和7在不同浓度下对RAW264.7细胞生成NO的影响示意图。
图31为化合物1-7在不同浓度下对线虫存活率的影响示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
制备铁载体类化合物所需原料：土豆提取物购自美国BD公司，产品目录号为2022-01-31；葡萄糖购自上海泰坦科技有限公司，产品目录号为G61055A；琼脂购自青岛华东化玻仪器公司。
一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法包括以下步骤：
一、发酵制备铁载体类化合物
1、种子培养
(1)将平板培养基在115℃下灭菌30min，制成平板，于28℃恒温培养3d，至表面水分稍干，无杂菌生长时，将粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养10d，外观为肉红色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L。所述平板培养基的pH值自然。
所述粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)的分离方法包括以下步骤：
将智利圣地亚哥新鲜草叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理：75％酒精漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，5％次氯酸钠溶液漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干水分，将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm2小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3～15d，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
所述菌株分离培养基的配制方法包括以下步骤：
土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
所述粉红粘帚霉15020(Clonostaehys rosea)的保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
(2)在多个250mL玻璃瓶中分别装入100mL种子培养基，于115℃下灭菌30min，使用第(1)步获得的平板菌种由平板挖块接种。于28℃在旋转摇床旋转培养5d，转速为220rpm，得到种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为(g/L)：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L；
所述种子培养基的pH值自然。
2、发酵培养
配制固体发酵培养基(固体发酵培养基成份：大米：水(W:V)＝2：3，pH值自然)，在菌种袋中分装80g大米和120mL水，灭菌(于121℃下灭菌20min)后按照5％(体积百分比)的接种量将上述步骤1得到的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质。
二、分离纯化铁载体类化合物并鉴定
1、分离纯化铁载体类化合物
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液过滤去除固体发酵物，收集上清液，将上清液浓缩蒸干，称重得到粗提物，经正己烷、乙酸乙酯和水进行三相萃取，将乙酸乙酯层浓缩蒸干称重，用甲醇作为流动相，用Sephadex LH-20柱洗脱，得到15个子组分N1-N15，N2组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-AR色谱柱进行纯化，流速为4.0mL/min，使用52％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物粉粘帚霉素D(化合物1)、粉粘帚霉素D1(化合物2)、N14-palmitoylcoprogen(化合物5)和Clonocoprogen C(化合物7)；N4组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-PFP色谱柱纯化，流速为4.0mL/min，使用55％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物粉粘帚霉素E(化合物3)、粉粘帚霉素E1(化合物4)和N2-palmitoyl-N5-E-anhydromevalonyl-N5-hydroxy-L-ornithine(化合物6)。
2、鉴定铁载体类化合物粉粘帚霉素D(1)和粉粘帚霉素E(3)，及其生物合成前体粉粘帚霉素D1(2)和粉粘帚霉素E1(4)。
将上述得到的化合物粉粘帚霉素D(1)和粉粘帚霉素E(3)，及其生物合成前体粉粘帚霉素D1(2)和粉粘帚霉素E1(4)进行鉴定：
(1)外观：均为无定形橙黄色粉末。
(2)溶解性：易溶于甲醇，难溶于水。
(3)紫外光谱：化合物粉粘帚霉素D(1)和粉粘帚霉素E(3)，及其生物合成前体粉粘帚霉素D1(2)和粉粘帚霉素E1(4)的甲醇溶液紫外光谱在200和225nm处有最大吸收峰，紫外光谱见图1所示，图1为本发明化合物粉粘帚霉素D-E和它们的生物合成前体粉粘帚霉素D1-E1的紫外谱图。
(4)质谱：图2为本发明化合物粉粘帚霉素D的HR-ESI-MS谱图，显示其[M+H]+峰为m/z 991.6304，提示其最可能分子式为C51H86N6O13。图3为本发明化合物粉粘帚霉素D1的HR-ESI-MS谱图，显示其[M+H]+峰为m/z 525.3909，提示其最可能分子式为C29H52N2O6。图4为本发明化合物粉粘帚霉素E的HR-ESI-MS谱图，显示其[M+H]+为m/z 989.6147，提示其最可能分子式为C51H84N6O13。图5为本发明化合物粉粘帚霉素E1的HR-ESI-MS谱图，显示其[M+H]+为m/z 523.3753，提示其最可能分子式为C29H50N2O6。HR-ESI-MS图谱测试采用Thermo FisherOrbitrap Q Exactive mass spectrometer，甲醇为溶剂。
(5)核磁共振谱：图6为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图，图7为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图，图8为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图，图9为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的1H-NMR谱图。图10为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图，图11为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图，图12为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图，图13为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的13C-NMR谱图。再结合四个新化合物的1H-1H COSY谱(如图14-17所示，图14为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱，图15为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的1H-1HCOSY谱，图16为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱，图17为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的1H-1H COSY谱)，HSQC谱图(如图18-21所示，图18为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的HSQC谱图，图19为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的HSQC谱图，图20为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的HSQC谱图，图21为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的HSQC谱图)和HMBC谱图(如图22-25所示，图22为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的HMBC谱图，图23为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的HMBC谱图，图24为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的HMBC谱图，图25为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的HMBC谱图)，对四个新化合物的核磁共振谱进行了研究并对1H和13C信号进行了归属，见表1-4。化合物的相对构型则由各自的NOSEY谱图(如图26-29所示，图26为本发明化合物粉粘帚霉素D溶于DMSO-d6中的NOESY谱图，图27为本发明化合物粉粘帚霉素D1溶于DMSO-d6中的NOESY谱图，图28为本发明化合物粉粘帚霉素E溶于DMSO-d6中的NOESY谱图，图29为本发明化合物粉粘帚霉素E1溶于DMSO-d6中的NOESY谱图)确定，并最终确定结构如下：
Figure BDA0003079916150000131
表1化合物粉粘帚霉素D的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0003079916150000132
Figure BDA0003079916150000141
Figure BDA0003079916150000142
表2化合物粉粘帚霉素D1的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0003079916150000143
Figure BDA0003079916150000151
Figure BDA0003079916150000152
表3化合物粉粘帚霉素E的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0003079916150000153
Figure BDA0003079916150000161
Figure BDA0003079916150000162
表4化合物粉粘帚霉素E1的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0003079916150000163
化合物粉粘帚霉素D-E和粉粘帚霉素D1-E1的NMR测试采用Bruker 600MHz(1H600MHz；13C 150MHz)，溶剂为DMSO-d6(溶剂峰校正δH 2.50/δC 39.52)。
本发明制备的铁载体类化合物抗真菌活性测试：
所测菌株为白色念珠菌菌株SC 5314。采用连续稀释法测定上述制备的化合物对所选细菌生长的抑制作用，获得化合物对抗不同菌株的最低抑菌浓度。最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)是抑制细菌生长所需药物的最低浓度。本实验选取两性霉素B作为阳性对照药，同时设置只加DMSO处理作为阴性对照。
挑取白色念珠菌菌株SC 5314单菌落悬浮在RPMI 1640中，浓度为1×104cfu/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔中包含78μL真菌悬浮液，每种化合物的2倍系列稀释液添加2μL。样品和对照药溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，DMSO的最终浓度不得高于0.05％。采用连续稀释法获得一系列样品浓度为4000至31.3μg/mL，并将板在35℃下孵育16小时。用酶标仪在600nm测培养前后吸光度，根据吸光度的变化计算得到最低抑菌浓度即MIC值，所有实验平行进行3次。
实验结果如表5所示：
表5化合物1-7的抗白色念珠菌SC 5314活性测试结果
Figure BDA0003079916150000171
从表5中结果可知，化合物5具有优异的抗白色念珠菌活性，MIC值为25μg/mL。
促进免疫细胞NO生成活性的测试：
本实验测试上述制备的化合物在不同浓度下对小鼠单核巨噬细胞样细胞系RAW264.7释放NO的促进作用，并以LPS(10μg/mL)作为阳性对照。测试用RAW264.7细胞，先加入DMEM培养液配制成细胞悬液，以8×104个/孔接种于96孔板，放置培养箱培养24小时后，加入被测试化合物，设置终浓度40μg/mL、20μg/mL和10μg/mL三个梯度，继续培养24小时后取培养液上清检测NO含量，每组实验平行3次。
检测化合物1-7对诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞生成NO的活性，实验结果如图30所示，图30为化合物3、5和7在不同浓度下对RAW264.7细胞生成NO的影响示意图。从图中可以看出，化合物3和5可以对RAW264.7细胞释放NO起到诱导作用，并且随着浓度增加，化合物3和5对RAW264.7细胞生成NO的诱导作用逐渐增强。对比阴性对照(N)，化合物3、5、7在不同浓度(40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)下都可以提高NO的释放量。在浓度为10μg/mL时，化合物3、5、7提高NO的释放量的效果均弱于阳性对照(阳性药LPS)。
抗耐药铜绿假单胞菌感染活性的测试：
用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)喂养L4期线虫Caenorhabditiselegans，25℃培养16～25h后，收集感染的线虫转移至96孔板，孔板中添加M9 buffer和测试化合物，总共200μL，25℃静置培养在规定的时间内统计线虫的存活数。
通过线虫-耐药铜绿假单胞菌感染模型测试化合物1-7的抑菌活性，如图31所示，图31为化合物1-7在不同浓度下对线虫存活率的影响示意图。从图中可以看出，测试结果表明化合物1-7都有一定提升PA感染的线虫存活率的作用，并且随着用药浓度增加，线虫的存活率逐渐提高并趋于稳定，化合物1-7对线虫存活率作用的EC50数值见表6所示。
表6化合物1～7在PA感染的线虫模型保持半数存活率下的用药浓度
Figure BDA0003079916150000181
从图31可知，化合物1-7均具有抗铜绿假单胞菌感染提高线虫存活率的活性。化合物7的EC50为1.853μg/mL，活性最好。化合物5的EC50为2.174μg/mL，化合物5和7可以起到中等的抗感染活性，效果均弱于阳性对照(阳性药CIP，环丙沙星，EC50为0.549μg/mL)。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一类来源于植物内生真菌的铁载体类化合物，其特征在于，结构式如下所示：
Figure FDA0003752559610000011
2.一种权利要求1所述的来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将固体发酵培养基灭菌，然后将体积百分比为5％的种子液接种于固体发酵培养基，于28℃静置培养，40d后收获固体发酵物，固体发酵物为容器内的所有物质，将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物；
所述将上述固体发酵物经过分离纯化获得所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物包括以下步骤：
将上述得到的固体发酵物经乙酸乙酯提取三遍，提取液过滤去除固体发酵物，收集上清液，将上清液浓缩蒸干，称重得到粗提物，经正己烷、乙酸乙酯和水进行三相萃取，将乙酸乙酯层浓缩蒸干称重，用甲醇作为流动相，用Sephadex LH-20柱洗脱，得到15个子组分N1-N15，N2组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-AR色谱柱进行纯化，流速为4.0mL/min，使用52％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物粉粘帚霉素D即化合物1、粉粘帚霉素D1即化合物2；N4组分通过半制备型RP-HPLC使用ACE C18-PFP色谱柱纯化，流速为4.0mL/min，使用55％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物粉粘帚霉素E即化合物3、粉粘帚霉素E1即化合物4；
所述种子液的制备方法包括以下步骤：在多个玻璃瓶中分别装入种子培养基，于115℃下灭菌30min，使用含有粉红粘帚霉的平板菌种由平板挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养5d，转速为220rpm，得到种子液；
所述粉红粘帚霉的平板菌种为粉红粘帚霉15020，其保藏号为CGMCC No.21037。
3.根据权利要求2所述的来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养基为大米：水＝2：3，大米与水的比为重量与体积之比，其中重量单位为克，体积单位为毫升，pH值自然；
所述固体发酵培养基灭菌是在121℃下灭菌20min；
所述种子培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为g/L：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L；
所述种子培养基的pH值自然。
4.根据权利要求2所述的来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，其特征在于，所述含有粉红粘帚霉的平板菌种的培养方法为：
将平板培养基在115℃下灭菌30min，制成平板，于28℃恒温培养3d，至表面水分稍干，无杂菌生长时，将粉红粘帚霉15020菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养10d，外观为肉红色，气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到平板菌种。
5.根据权利要求4所述的来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，其特征在于，所述平板培养基由以下成分组成：土豆提取物、葡萄糖和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为g/L：土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L；
所述平板培养基的pH值自然。
6.根据权利要求4所述的来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的制备方法，其特征在于，所述粉红粘帚霉15020的分离方法包括以下步骤：
将智利圣地亚哥新鲜草叶片部位植物样品用无菌水清洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小片做表面消毒处理：75％酒精漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，5％次氯酸钠溶液漂洗3min，无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干水分，将上述表面消毒后的材料剪切成0.5cm2小块，放入含有菌株分离培养基的平板中28℃恒温培养3～15d，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养；
所述菌株分离培养基的配制方法包括以下步骤：
土豆提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L，高温灭菌，在制备平板时加入青霉素100mg/L和链霉素200mg/L的混合液20mL。
7.一种来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure FDA0003752559610000031
Figure FDA0003752559610000041
致病菌株为白色念珠菌菌株SC 5314。
8.一种来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备免疫细胞诱导增强药物中的应用，其特征在于，所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure FDA0003752559610000042
Figure FDA0003752559610000051
Figure FDA0003752559610000061
所述免疫细胞诱导增强药物体现为诱导免疫细胞释放NO活性，所述免疫细胞为RAW264.7小鼠巨噬细胞。
9.一种来源于植物内生真菌的铁载体类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，致病菌为耐药铜绿假单胞菌；
所述来源于植物内生真菌的铁载体类化合物的结构为以下结构的一种：
Figure FDA0003752559610000062
Figure FDA0003752559610000071
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