CN108130305B

CN108130305B - 一株枯草芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐线虫病中的应用

Info

Publication number: CN108130305B
Application number: CN201810185868.1A
Authority: CN
Inventors: 王兆臣; 牛赡光; 张薇; 孙淑建; 王花
Original assignee: Shandong Daimengde Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Daimengde Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: CN108130305A

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐线虫病中的应用。本发明的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LK2103，是从山东省济宁市微山湖湖泥中分离获得的，已于2017年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14670。试验结果表明：枯草芽孢杆菌菌株LK2103生物防治制剂防治西洋参根腐线虫效果显著，防治效果达到73.08％，且西洋参长势良好，无药害产生。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐线虫病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐线虫病中的应用，以及采用该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂。

背景技术

西洋参(Panax quiquefolium L.)，又名花旗参、洋参等，系五加科人参属多年生草本植物，以根入药，是重要的补益类中药，被誉为“绿色黄金”。西洋参原产美国和加拿大，我国于20世纪70年代末期开始引种，目前的主要产区集中在东北、华北、胶东半岛和西北的汉中地区。不论是原产地还是引种地的西洋参，在栽培过程中均有多种病害发生，并且，随着西洋参在各地种植年份的增加，病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，特别是根部病害，不仅危害严重而且也是防治的难点，成为影响西洋参产量和质量的主要障碍。近年来，西洋参主根部一种病害——根腐线虫，对西洋参的产量和品质造成严重影响。该病的发生不但影响西洋参外观性状，而且给西洋参种植者造成重大的经济损失。此种病害具有危害性大、不易被发现的特点，只有地下部分被严重危害，导致整个植株生长势减弱而在地上部分表现出来以后才会被发现；一旦植株地上部表现症状，根部己经被严重破坏而完全失去利用价值。根腐线虫病是近年来严重影响西洋参产量和质量的主要因素之一。

目前生产上常采用化学药剂防治西洋参根腐线虫。化学防治极易造成农药残留，污染环境，并且化学农药的长期使用，使得根腐线虫对其产生抗药性，导致防治效果下降甚至失败。

生物防治是利用物种间的拮抗作用来减少病害的发生，对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性，因而具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是最早被报道用来防治植物病害的菌种。

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，其生理特征丰富多样，在自然界中广泛存在，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌突出的特征是能产生内生耐热以及对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性的芽孢，这有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、能够形成抗逆性较强的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌具有有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高效防治西洋参根腐线虫病的新的微生物——枯草芽孢杆菌菌株LK2103。本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物(尤其是西洋参)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LK2103，是从山东省济宁市微山湖湖泥中分离获得的，已于2017年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.14670。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB(Luria-Bertani)培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

本发明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103的培养方法或繁殖方法包括：

(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6；

(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6；

(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶25∶17∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾12％，硫酸镁8％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙70％。

(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方

本发明还提供一种用于防治西洋参根腐线虫病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103。

并且，本发明还提供了一种用于防治西洋参根腐线虫病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有根腐线虫病的西洋参植株施用上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103或者上述生物防治制剂。

本发明也提供了上述枯草芽孢杆菌菌株或者上述生物防治制剂在防治西洋参根腐线虫病中的用途。

本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)制备所述枯草芽孢杆菌菌株LK2103的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，29～31℃下恒温培养；

(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温29～31℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。

在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株LK2103的孢子移植到LB液体培养基，29～31℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，29～31℃下振荡培养3～5d；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温29～31℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。

其中，步骤(1)中的LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6。

步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶25∶17∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾12％，硫酸镁8％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙70％。

步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。

实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物(尤其是西洋参)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治西洋参根腐线虫，还能有效促进西洋参生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治西洋参根腐线虫。试验结果表明：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103固体发酵培养物防治西洋参根腐线虫效果显著，防治效果达到73.08％，且西洋参长势良好，无药害产生。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。

实施例1

1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LK2103的分离与纯化

本发明的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LK2103是从湖泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

(1)芽孢杆菌的分离

湖泥样品于2014年4月20日采集自山东省济宁市微山湖。称取1g湖泥于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。

(2)西洋参根腐线虫高效拮抗芽孢杆菌的筛选

①初筛

A.根腐线虫四龄幼虫悬浮液的制备

从西洋参根部挑取新鲜卵块，置于自制孵化装置中进行孵化，24h后开始收集幼虫，每天收集一次，共收集一周。线虫液稀释为100条/mL，4℃保存待用。

B.芽孢杆菌对根腐线虫四龄幼虫的作用

吸取菌悬液2mL，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入2mL四龄幼虫的悬浮液，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在12h、24h、36h、48h和60h后观察线虫的活力。

C.芽孢杆菌对根腐线虫卵块孵化的作用

吸取菌悬液2mL，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入10粒卵块，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在24h、48h和60h后观察幼虫的孵化情况。

②复筛：

将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的菌株LK2103进行鉴定。

本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治西洋参根腐线虫的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LK2103。实验证明，该枯草芽孢杆菌固体发酵培养物在防治西洋参根腐线虫中显示出非常高效的防治效果，使得西洋参长势良好。因而，本发明的枯草芽孢杆菌是具有广泛应用前景的枯草芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治西洋参根腐线虫病害的生物防治制剂。

2、菌株鉴定

(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

(2)分子生物学特性

该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：

CCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCCTCCGCTCGA。

(3)细胞形态和理化实验结果

表1枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LK2103的细胞形态和理化实验结果

该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2017年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14670。

实施例2

1、芽孢杆菌菌种发酵过程

LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.4～7.6。

固体培养基：固料、无机盐和水，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶25∶17∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾12％，硫酸镁8％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙70％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。

大量发酵培养基同固体培养基。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103大量固体发酵过程：

①菌种种子液培养

将枯草芽孢杆菌菌株(B.subtilis)LK2103从试管斜面中挑取少量孢子，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。

②固体生产菌种的培养

将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。

③大量固体发酵：

将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，其活菌数达10亿/克。

为了明确枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103固体发酵培养物对西洋参根腐线虫的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年4月～6月在山东省威海市进行试验，现将试验结果报告如下：

1供试材料及方法

1.1供试药剂

按本发明实施例2发酵方法生产的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103固体发酵培养物(10亿/克)；1.8％阿维菌素乳油(河南绿野之星作物保护有限公司生产，市售)。

1.2试验材料与防治对象

试验材料为西洋参；防治对象为西洋参根腐线虫病。

1.3试验地情况

试验地设在山东省威海市文登区张家产镇。该地区由于连续种植西洋参，西洋参根腐线虫的发生日益严重。试验土壤类型为壤土，有机质含量为3.52％，pH值为6.1，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时西洋参根腐线虫处于发病初期。

1.4试验设计及安排

本试验共3个处理，分别为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103固体发酵培养物15倍液、1.8％阿维菌素乳油1000倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于发病初期对病株及其附近植株灌根，连续3次，每次每病株灌药液250ml。于2016年4月10日、5月10日和6月10日各灌根一次。

1.5试验调查及计算方法

1.5.1气象条件

第1次施药(4月10日)当日晴，风力5～6级，最高气温为16℃，最低气温为5℃，相对湿度为62％。第2次施药(5月10日)，当日晴，风力4～5级，最高气温为21℃，最低气温为12℃，相对湿度为68％；第3次施药(6月10日)当日晴，风力4～5级，最高气温为27℃，最低气温为18℃，相对湿度为75％。

1.5.2药效及安全性调查

药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查50株，调查植株根部病害情况，记录病情级数并计算病情指数。

安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察西洋参的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。

西洋参根腐线虫分级标准：

0级：西洋参根完好无病、虫危害。

1级：西洋参根全体被危害面积小于1/3。

2级：西洋参根全体被危害面积在1/3～2/3之间。

3级：西洋参根全体被危害面积大于2/3。

1.5.3药效计算方法

防治效果按式(1)、(2)计算：

式中：CK₀——空白对照区施药前病情指数；

CK₁——空白对照区施药后病情指数；

PT_{0————}药剂处理前施药前病情指数；

PT_{1————}药剂处理后施药后病情指数。

1.5.4对西洋参的直接影响

观察药剂对西洋参有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对西洋参长势的影响。

用下列方式记录药害：

(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。

(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：

①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

药害分级方法：

—：无药害；

+：轻度药害，不影响植物生长；

++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；

+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；

++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。

②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。

2结果

2.1供试药剂对西洋参根腐线虫的防治效果

供试药剂对西洋参根腐线虫的防治效果如表2-3所示。表3结果显示，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103固体发酵培养物和1.8％阿维菌素乳油对西洋参根腐线虫均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到70％以上。

从西洋参根腐线虫田间试验的病情指数来看(表3)，最后一次施药后14d，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LK2103防治效果为73.08％，明显高于1.8％阿维菌素乳油50.00％的防治效果。

表2三种药剂处理前西洋参根腐线虫病害情况

表3三种药剂处理对西洋参根腐线虫的防治效果

2.2西洋参安全性调查

经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，西洋参生长正常，无药害产生，说明枯草芽孢杆菌固体发酵培养物对西洋参安全。

3小结

3.1从病情指数和防治效果来看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103对西洋参根腐线虫具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果达到70％以上。

3.2从西洋参长势看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LK2103对西洋参具有促进生长效果，没有药害，安全可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东戴盟得生物科技有限公司

<120> 一株枯草芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐线虫病中的应用

<130> 0

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<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1384

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株LK2103的16s rDNA基因序列

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cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag 120

ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc 180

gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg 240

atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa 300

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acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc 420

tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 480

taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg 540

cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac 600

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gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg 720

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gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc tttcacatca 840

gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat tccggacaac gcttgccacc 900

tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca 960

aggtaccgcc ctattcgaac ggtacttgtt cttccctaac aacagagctt tacgatccga 1020

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tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg agcaagctcc catcctccgc 1380

tcga 1384

Claims

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LK2103，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.14670。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株LK2103在防治西洋参根腐线虫病中的用途。

3.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株LK2103。

4.权利要求3所述的生物防治制剂在防治西洋参根腐线虫病中的用途。

5.一种防治西洋参根腐线虫病的生物防治方法，其特征是，向具有根腐线虫病的西洋参植株施用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株LK2103或者权利要求3所述的生物防治制剂。