CN107354103B - 链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株及其应用 - Google Patents

链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术农业生产领域，尤其涉及链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株及其应用。链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No：8465，保藏日期是2013年11月11日。本发明链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株及其发酵液可用防治烟草赤星病。

Description

链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术农业生产领域，尤其涉及链霉菌Streptomyceslunalinharesii ZJNU968菌株及其应用。
背景技术
烟草赤星病(Alternaria alternata)是烟草成熟期一种真菌性叶斑类病害，不但会影响烤烟产量，还会影响烟叶评吸质量。该病害在烟草产区发生较为普遍，是烟草生产中威胁最大的病害之一。化学防治是目前防治烟草赤星病最有效的方法，但是该方法会造成农药残留，污染环境，影响人类健康。此外，化学防治还会使烟草赤星病菌产生耐药性，从而影响防治效果。
随着人们对烟草及烟草制品安全性的要求越来越高，减少化学农药使用、生产绿色食品已经成为农业生产的新要求，因此生物防治越来越引起烟草界的关注。筛选烟草赤星病菌拮抗菌是实施生物防治的一项重要工作，对于解决烟草生产中农药残留及环境保护方面都具有重要意义。
发明内容
为了获得用于防治烟草赤星病菌的生物农药，本发明的第一个目的是提供链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968；本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株发酵液的生产方法；本发明的第三个目的是提供一种对烟草赤星病菌具有高拮抗性的生物农药。
为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下技术方案：
链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No：8465，保藏日期是2013年11月11日。
为了实现上述第二个目的，本发明采用了以下技术方案：
将试管斜面保藏的链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968接种至高氏I号培养基平板，然后在28℃培养3天；用无菌打孔器在长好拮抗菌的平板上打取直径为6mm的菌块，并用无菌水洗下菌体，接入装有30ml高氏I号液体培养基的250ml三角瓶中，于转速180 r/min、温度28℃摇床中培养144h，离心后得到链霉菌Streptomyces lunalinharesiiZJNU968菌株发酵液。
为了实现上述第三个目的，本发明采用了以下技术方案：
对烟草赤星病菌具有高拮抗性的生物农药包括链霉菌Streptomyceslunalinharesii ZJNU968菌株和其发酵液中的一种或两种。
综上所述，本发明提供了链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株和一种获得该菌株发酵液的方法，该菌株和其发酵液可以作为防治烟草赤星病菌的生物农药。
附图说明
图1 ZJNU968菌株发酵液对烟草赤星病菌的拮抗效果。
图2 ZJNU968菌株在高氏I号培养基上培养7d菌落(标尺为1mm)。
图3 ZJNU968菌株在高氏I号培养基上培养12d菌落(标尺为1mm)。
图4 ZJNU968菌株的孢子丝形态。
图5 以16S rDNA序列为基础的系统发育树状关系图。
生物材料保藏说明
链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No：8465，保藏日期是2013年11月11日。
具体实施方式
实施例1从土壤中分离筛选链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株。
(一)培养基：
高氏I号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NaCl0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.5。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
(二)放线菌菌株的分离纯化
从浙江省金华市婺城区采集16份土样，采用梯度稀释法制备土壤悬液，分别吸取10-3、10-4、10-5土壤稀释液0.1ml涂布于高氏I号培养基平板上，室温静置30min后倒置于28℃恒温培养箱培养。将长出的放线菌转接至新的高氏I号培养基平板再次进行纯化，并将最终获得的纯种菌株接种至试管斜面，于4℃条件下保藏备用。
(三)烟草赤星病菌拮抗菌株的筛选
将烟草赤星病菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，然后采用琼脂块法对分离得到的放线菌进行初筛，共获得6株对烟草赤星病菌具有抑菌活性的拮抗菌株。在此基础上，采用管碟法对初筛得到的6株拮抗菌株进行复筛，其中以菌株ZJNU968的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到3.60cm(附图1)。
(四)烟草赤星病菌拮抗菌株ZJNU968的鉴定
ZJNU968菌株的菌落不透明、圆形、微隆起、干燥且边缘整齐。菌落正面初期为白色(附图2)，10天后呈现灰色(附图3)，菌落背面呈微黄色。菌落质地硬而且致密，与培养基的连接紧密，难以挑取，具有典型的放线菌特征。该菌株气生菌丝和基内菌丝均很丰富，且有大量分枝，孢子丝呈螺旋状(附图4)，孢子呈短圆柱形。
ZJNU968菌株能水解淀粉，可以使明胶液化，能利用葡萄糖和乳糖生长。该菌株糖发酵试验(葡萄糖和乳糖)、甲基红试验、伏普试验、吲哚试验均为阴性，柠檬酸盐试验为阳性。
通过克隆、测序，获得ZJNU968菌株的16S rDNA基因序列，已提交至Genbank网站(基因库登录号为JX235956)。从GenBank、EzTaxon等数据库调集链霉菌属相关菌株16SrDNA序列，与ZJNU968菌株进行比较，并以青孢链霉菌(Streptomyces glaucosporus)为外群，按照N-J法构建系统发育树，结果显示ZJNU968菌株与Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071处于同一进化分支(附图5)，两者序列相似性达98％，而且ZJNU968菌株的形态特征和生理生化特征与Streptomyces lunalinharesii RCQ1071菌基本一致，因此确定菌株ZJNU968为Streptomyces lunalinharesii。
实施例2链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株发酵液的生产方法：
将试管斜面保藏的链霉菌Streptomyces lunalinharesii ZJNU968菌株接种至高氏I号培养基平板，然后在28℃培养3天；用无菌打孔器在长好拮抗菌的平板上打取直径为6mm的菌块，并用无菌水洗下菌体，接入装有30ml高氏I号液体培养基的250ml三角瓶中，于转速180r/min、温度28℃摇床中培养144h，离心后得到链霉菌Streptomyceslunalinharesii ZJNU968菌株发酵液。

Claims (3)

1.一株链霉菌菌株ZJNU968，其特征在于：所述链霉菌菌株ZJNU968属于链霉菌Streptomyces lunalinharesii ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8465，保藏日期是2013年11月11日。
2.如权利要求1所述的链霉菌菌株ZJNU968的发酵液的生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
将试管斜面保藏的权利要求1所述的链霉菌菌株ZJNU968接种至高氏I号培养基平板，然后在28 ℃培养3天；用无菌打孔器在长好拮抗菌的平板上打取直径为6 mm的菌块，并用无菌水洗下菌体，接入装有30 ml 高氏I号液体培养基的250 ml三角瓶中，于转速180 r/min、温度28 ℃摇床中培养144 h，离心后得到链霉菌菌株ZJNU968的发酵液。
3.对烟草赤星病菌具有高拮抗性的生物农药，其特征在于：所述生物农药包含利用权利要求2所述的生产方法获得的发酵液。
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