CN107446839B - 一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌dhns-3-5及其应用 - Google Patents

一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌dhns-3-5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS‑3‑5及其应用。一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS‑3‑5，分类命名为Curtobacterium citreum，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60109。本发明所述的生防细菌DHNS‑3‑5，在制备防治木薯细菌性枯萎病的生防菌剂中的应用。本发明从木薯8个不同生境分离到298株细菌中海选到一株能够有效防治木薯细菌性枯萎病的生防菌株DHNS‑3‑5，该菌株能够分泌嗜铁素和纤维素酶，日光温室大棚盆栽防效测定，DHNS‑3‑5防效为65.34％，和对照防效相比，差异显著。

Description

一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS-3-5及其应用
技术领域
本发明属于生物农药领域，涉及一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS-3-5及其应用。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科木薯属灌木状多年生作物，是我国热区重要的经济作物，其块根被广泛用于食品加工、变性淀粉和生物能源等产业之中。近年来，木薯在我国栽培面积一直保持在40万hm2以上，年产鲜薯900万吨左右。
由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis，简称Xam)引起的木薯细菌性枯萎病(Cassava bacterial blight，简称CBB)是一种毁灭性病害，广泛发生于亚洲、非洲和美洲的木薯产区。在非洲和南美洲，病害发生后所造成的木薯产量损失为12％～90％，严重时可导致毁种绝收。在我国，该病最先在台湾地区发生流行，造成的产量损失达30％，淀粉出粉率减少40％左右。2007～2009年，中国热带农业科学院对我国木薯主产区病害普查结果表明，该病在我国海南、云南和广西、广东等省份普遍发生，是当前木薯生产中主要病害，严重影响相关产业的发展。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS-3-5。
本发明的另一目的是提供该细菌的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS-3-5，分类命名为Curtobacteriumcitreum，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60109。
本发明所述的生防细菌DHNS-3-5，在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
本发明所述的生防细菌DHNS-3-5，在制备防治木薯细菌性枯萎病的生防菌剂中的应用。
一种防治木薯细菌性枯萎病的生防菌剂，由本发明所述的生防细菌DHNS-3-5发酵制备得到。
本发明所述的生防菌剂在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
有益效果：
本发明从木薯8个不同生境分离到298株细菌中筛选到一株有效防治木薯细菌性枯萎病的生防菌株DHNS-3-5，该菌株能够分泌嗜铁素和纤维素酶，日光温室大棚盆栽防效测定，DHNS-3-5防效为65.34％，和对照的防效相比，差异显著。
生物材料保藏信息
DHNS-3-5，分类命名为Curtobacterium citreum，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院56号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60109。
具体实施方式
实施例1
1.1材料
取样地点：2014年8月份采集于广东省湛江遂溪某木薯园。
取样方法：CBB发病地块和非发病地块。每块地分成4个小区，每个小区至少有250m2，每个小区的样本由5个重复混合而成。土壤取样时，深度为0-15cm，面积大约为1m2。采用五点采样法，每点间隔至少10m。每点三株健康植株连同根围土一并收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。
参考Morris等人的方法取样：A.无病害地块的健康植株；B.无病害地块的健康植株根围土；C.无病害地块的根际土；D.病害地块的健康植株；E.病害地块的病株(病株上的健康部位叶片)；F.病害地块健康植株的根围土；G.病害地块染病植株的根围土；H.病害地块的根际土。以及另一地块(吴川唐缀，新地，第一年种植木薯)的健康叶片及其茎秆的中空部分。
病原菌来源：本研究室前期保存的病原菌(2013年采集于广东湛江遂溪某木薯地，分离于木薯发病叶片和茎秆)。
1.2方法
1.2.1颉颃菌株分离
外生细菌分离：取3g样品，放入灭菌的三角瓶中，加27mL无菌的0.85％NaCl和灭菌玻璃珠，于摇床上150rpm振荡30min后，静置5min，得到10-1稀释液，依次制备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液。分别取10-4、10-5、10-6三个梯度的稀释液100μl涂在R2A培养基上，每个梯度3个重复，30℃培养48h。
内生细菌分离：分别取样品若干，用1％的次氯酸钠浸泡5min，70％酒精浸泡1-2min，无菌水清洗3次(取最后一次清洗的溶液100μl涂于R2A平板上，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌)。其他同外生菌的分离方法。
选菌落数在30-300个的平板，计数，挑取平板上不同大小、形态的菌落分离、纯化，40％甘油保存于-70℃超低温冰箱中，备用。
1.2.1产酶和代谢产物活性测定
1.2.2.1蛋白酶活性测定
参照Yang的方法，挑取处于生长旺盛期的菌株接种于蛋白培养基平板上(A：脱脂奶粉6.4g，溶于240mL水中，121℃灭菌1min；B：琼脂6.4g，定容至240mL，121℃灭菌20min，A与B分别灭菌后混合)，30℃培养3d，观察透明圈且测量内径和外径，4个技术重复，3次试验平行重复，下同。
1.2.2.2几丁质酶活性测定
参照Roberts的方法，制备好胶体状几丁质，将颉颃细菌接种在以胶体状几丁质为唯一碳源的Chi-Ayers培养基平板(NH4H2PO4 1.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，胶体状几丁质1％(w/v)定容至1000mL，pH＝7.0，琼脂20g)，30℃培养3d，观察透明圈且测量内径和外径。
1.2.2.3β-1,3-葡聚糖酶活性的检测
参照杨威的方法，将颉颃细菌接种在葡聚糖平板上(β-1,3-葡聚糖0.1g，TSB0.4g，琼脂1.6g，4g/L的刚果红1mL，定容至100mL)，30℃培养48h，观察透明圈且测量内径和外径。
1.2.2.4纤维素酶活性的检测
参照Ghose的方法，把准备好的菌株接到纤维素酶活性测定平板(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，定容至1000mL，pH＝7.0)，30℃培养48h后，用1g/L的刚果红染1h后，倒掉染液后，用1M的NaCl浸泡1h。观察透明圈的有无且测量其内径和外径。
1.2.2.5产嗜铁素活性的检测
参照Shin的方法，将A，B液混合倒平板，并将准备好的菌株接于该平板上(A：1，60.5mg CAS(铬天青S)溶于50mL去离子水；2，10mL三价铁溶液(1mM FeCl3·6H2O，10mM盐酸为溶剂)；3，72.9mg HDTMA溶于40mL去离子水。上述三个溶液混合定容至100mL，pH调至中性，121℃灭菌20min。B：30.24g Pipes加入900mL Waker agar培养基，12g 50％(W/V)的NaOH溶液将培养基pH调至6.8，121℃灭菌20min)，30℃培养3d，观察透明圈且测量内径和外径。
1.2.2.6产吲哚乙酸测定
参照Sawar and Kremer(1992)方法，取二甲氨基苯甲醛8g溶于760mL 95％酒精和160mL浓盐酸中，制得埃利希氏试剂。以1％胰蛋白胨水(pH＝7.2～7.6)为培养液，2d后将培养好的菌液加入3～5ml埃利希氏试剂，观察液面是否变红。
1.2.3颉颃活性测定
参照杨威的方法，将病原菌接种到LB培养液中，28℃、200rpm、22h震荡培养，制成种子液，以5％的接种量接种到LB液中，28℃，200rpm，24h培养成发酵液。随后将病原菌发酵液以5％的比例接种到LB固体培养基中(待LB固体培养基冷却至37～45℃加入此比例的病原菌菌液)，制成含病原菌的平板，每皿加入15mL。
随后将预先培养好的细菌培养液分别吸取8μL于灭菌滤纸片(直径为5mm)上，以LB培养液和灭菌水为空白对照。28℃培养48-72h，观察并测量抑菌圈大小。每个处理4个技术重复，3个试验重复。
1.2.4赋值评估
本赋值系统包括如下指标：平板颉颃活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素、吲哚乙酸活性。其中赋值方法如下[16]：平板颉颃活性根据颉颃圈(颉颃圈外径与内径之差)的大小分为四级：0：无颉颃活性；1：颉颃圈在1-3mm之间(含3mm)；2：颉颃圈在3-6mm之间(含6mm)；3：颉颃圈大于6mm。赋予的值分别为0、1、2、3。水解酶和产生嗜铁素赋值方法：0：无水解圈；1：水解圈在1-3mm之间(含3mm)；2：水解圈在3-6mm之间(含6mm)；3：水解圈大于6mm，依次赋值对应为0、1、2、3。吲哚乙酸活性根据液面颜色变化赋值如下：0：不变色；1：浅红色；2：红色；3：深红色。
1.2.5指纹图谱和16S rRNA测序和聚类分析
利用细菌基因组试剂盒(Shanghai SBS Genetech Co.Ltd)提取细菌基因DNA后，参考杨明明等人的方法，分别进行扩增核糖体DNA限制性酶切分析(amplified ribosomalDNA restriction analysis,ARDRA)和BOX-PCR扩增。利用软件对所得图谱进行聚类分析。
试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因组后，参考杨敬辉的方法从基因组中扩增出16S rRNA基因片段的PCR扩增[10]。所得产物在华大基因测序分析，并将相关序列在NCBI上进行比对。
经过上述方法评估,筛选到一株有效菌株DHNS-3-5(分离于病害地块的健康植株茎内)，经16S rRNA鉴定为Curtobacterium citreum。
DHNS-3-5的形态学特征如下：
DHNS-3-5生理生化特征见表1。
表1
注：x：数值代表四次重复试验水解圈的平均值(mm)。SD：半径；V：值。
y：0：0mm；1:1-3mm；2：3-6mm；3：＞6mm；
z：0：–；1：+；2：++；3：+++
实施例2DHNS-3-5的发酵培养方法
培养液LB配方：氯化钠10g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。将DHNS-3-5接种到LB培养液中30℃培养200rpm振荡培养，16～20h后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，带OD值达到0.6时将种子菌液以1:500体积比加入装有LB发酵培养液中发酵培养24h。
实施例3温室试验测定
试验品种为“南植199”。本试验设置两个处理：A.108CFU/mL DHNS-3-5菌剂发酵液10倍稀释液；B.对照：同等稀释倍数的LB溶液。每处理设4个重复，每个重复3棵苗。菌剂和对照处理组每株苗喷施30mL，对照组用等量LB和灭菌水以相同方法喷雾；以上各处理组在喷雾时均加入终浓度为0.01％的表面活性剂Tween-20。喷施5d后以剪叶的方式接种浓度为107CFU/mL的病原菌(李超萍.国内木薯病害调查与细菌性枯萎病防治技术研究[D].海南大学,2011)。接种病原菌15-30d后调查病害严重度并计算生防效果。
病害调查方法：0级为叶片无病斑；1级为病斑占叶面积1/10以下；3级为病斑占叶面积1/10～1/4；5级为病斑占叶面积1/4～1/2；7级为病斑占叶面积1/2～3/4；9级为病斑占叶面积3/4以上。
病害严重度和生防效果统计计算方法：病害严重度(％)＝[∑(病级数×该病级植株数)/(最高病级×总植株数)]×100；生防效果(％)＝[(对照病害严重度-处理组病害严重度)/对照病害严重度]×100.
表2
接种病原菌后21-28d调查病害情况(表2)，发现DHNS-3-5防效较好，防效在60％以上。对21-28d的防效进行平均系数分析，结果显示，DHNS-3-5防效为65.34％，和对照的防效相比，差异也显著。

Claims (5)

1.一株防治木薯细菌性枯萎病的生防细菌DHNS-3-5，分类命名为柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60109。
2.权利要求1所述的生防细菌DHNS-3-5在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
3.权利要求1所述的生防细菌DHNS-3-5在制备防治木薯细菌性枯萎病的生防菌剂中的应用。
4.一种防治木薯细菌性枯萎病的生防菌剂，其特征在于由权利要求1所述的生防细菌DHNS-3-5发酵制备得到。
5.权利要求4所述的生防菌剂在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
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