CN103184181A - 一株用于防治烟草野火病的灰产色链霉菌 - Google Patents

Abstract

一株对烟草野火病具有生防活性的灰产色链霉菌株TYFCQ272，属农业病害生物防治领域。此菌从自然环境寄主种植根际土壤中分离获得，根据形态特征和分子生物学鉴定为灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)。该菌对烟草野火病菌有很强的抑制作用，对烟草野火病有很好的控制效果。同时，该菌株还具有广谱拮抗活性，对烟草灰霉病菌、苹果腐烂病菌、烟草根黑腐病菌等病原真菌抑菌效果较好，抑菌圈半径都在10.0mm以上，还对柑桔溃疡病菌和烟草角斑病菌等病原细菌表现出较强的抑菌作用，抑菌圈半径达20.0mm以上。该菌株次生代谢产物中有纤维素酶，蛋白酶和嗜铁素等。TYFCQ272菌体制剂或无菌滤液对烟草野火病有很好的控制作用，经发酵菌体或次生代谢产物提取技术可生产环境友好型生物农药，具有重要的商业开发应用价值。

Description

一株用于防治烟草野火病的灰产色链霉菌

技术领域

本发明涉及植物病害生物控制技术领域，特别是涉及一株用于防治烟草野火病的灰产色链霉菌。 

背景技术

烟草野火病是世界各烟草产区普遍发生的一种重要病害，它是由烟草假单胞杆菌属，丁香假单胞烟草致病变种（Pseudomonas syringae pv. tabaci）引起的。该病最早由Wolf和Foser（1917）报道，此后国外如前苏联、美国、德国、日本、巴西等许多国家都有报道。自80年代以来，此病在我国上升为主要病害，东北三省，四川、河南、云南、贵州和重庆等省市发生严重，成为烟草生产中的主要病害之一。该病害主要危害叶部，尤其是在中后期，严重影响烟叶的产量和品质。 

烟草病害的综合防治一直是烟叶生产中的重要环节，长期以来化学防治在烟草病害防治策略中占据非常重要的地位。烟草生产上化学农药的大量和长期连续使用以及使用技术的不合理，使得烟草野火病菌产生抗药性，且不同来源的野火病原菌株的抗药性也存在着差异。耐药性菌株的出现不仅增加防治病害的成本，而且加重使用农药对环境的污染和生态系统的破坏，同时也直接影响烟叶品质。在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用微生物的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点，已成为无公害绿色农药的主体和未来农药的发展方向。因此，大力开展生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一株用于防治烟草野火病的灰产色链霉菌，该放线菌菌株对烟草野火病有较强的控制效果。根据菌株菌落培养性状、形态特征和生理生化性状及16S rDNA序列比对分析，初步确定菌株TYFCQ272为灰产色链霉菌，并对它进行了抑菌谱测定，表明其对多种病原菌有很好的抑菌作用，抗菌谱广。 

1. 灰产色链霉菌TYFCQ272菌株的筛选：西南大学从四川省凉山州采集自烟田土壤分离获得的多个菌株中，经初筛和复筛后得到有抑菌活性的放线菌21株。初筛采用平板对峙法,复筛采用氯仿熏蒸法。最后经过控病防效试验确定对烟草野火病有较好防治作用的为放线菌菌株TYFCQ272。 

2. 灰产色链霉菌TYFCQ272菌株的形态鉴定 

菌落特征：在不同培养基中TYFCQ272菌落形态分别为：

ISP-2培养基：菌落较大，圆形，中间褶皱，中间凸起，有晕圈，气生菌丝白色，短绒毛状，孢子丝灰白色，基内菌丝深褐色。

ISP-3培养基：菌落圆形，中间成蜂窝状，边缘菌丝呈短绒毛状，气生菌丝灰白色，孢子丝灰色，基内菌丝降褐色，产生色素。 

ISP-4培养基：菌落为边缘不规则的圆形，气生菌丝白色、长绒毛状，孢子丝白色，基内菌丝淡黄色，不产可溶性色素。 

ISP-5培养基：菌落圆形，中间凸起，气生菌丝白色、长绒毛状，孢子丝灰褐色，基内菌丝从褐黄色到褐色，产生色素。 

高氏一号培养基：菌落圆形，中间凸起，气生菌丝白色，孢子丝灰白色，产水，基内菌丝降黄色到褐色，产生可溶性色素。 

查氏培养基：菌落边缘菌丝呈放射状，气生菌丝白色、长绒毛状，边缘稀疏，中间孢子丝呈絮状，灰色，基内菌丝无色，产生色素。 

马铃薯浸汁培养基：菌落生长初期呈牛奶胨状，边缘环状包围，成熟期无环状物，菌落长满了丰富的灰色气生菌丝，孢子丝为淡栗色，基内菌丝从浅黄色到深褐色，略产褐色色素。 

菌丝体与孢子特征，革兰氏染色和生理生化观察，孢子链长而直，成簇丛，有少数孢子链产生螺旋，孢子近球形。TYFCQ272为革兰氏阳性菌，L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖均产酸，酪朊水解，还原硝酸盐成亚硝酸盐，产生硫化氢，淀粉水解，吲哚反应为阳性。根据分类资料将该菌株初步鉴定为灰产色链霉菌。 

分子生物学鉴定：通过提取TYFCQ272基因组DNA和16S rDNA PCR扩增, TYFCQ272扩增出的16S rDNA片段长度为1488bp, TYFCQ272与链霉菌属（Streptomycessp.）在遗传上接近，结合培养特性、形态特征、革兰氏染色及生理生化试验结果，将菌株TYFCQ272确定为灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)。 

TYFCQ272菌种的活体纯培养已于2012年06月15日保藏于‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，邮政编码100101，电话：010-64807355），保藏号：CGMCC No.6228。 

菌株TYFCQ272代谢产物分析：TYFCQ272不能分解含几丁质成分培养基，表明产物中无几丁质酶； TYFCQ272在牛乳蛋白培养基上产生明显的透明圈，表明产物中含蛋白酶； TYFCQ272在纤维素平板上产生了黄色透明圈，说明其代谢产物里均含有纤维素酶，能分解纤维素； 嗜铁素的检测结果显示，在平板上产生了黄色透明圈，表明TYFCQ272有螯合Fe³⁺离子的能力。 

菌株TYFCQ272抑菌谱测定：TYFCQ272菌株对烟草灰霉病菌、苹果腐烂病菌、烟草根黑腐病菌等抑菌效果较好，抑菌圈半径都在10.0mm以上，还对病原细菌柑桔溃疡病菌和烟草角斑病菌表现出较强的抑菌作用，抑菌圈半径达20.0mm以上。 

菌株TYFCQ272控病效果：TYFCQ272对烟草野火病有很好的控病作用且防效稳定，与72%农用链霉素4000倍相对防效都在90%以上。第21天，菌株TYFCQ272的菌悬液和无菌发酵滤液对野火病的相对防效显著好于农用链霉素处理。TYFCQ272无菌发酵液不同稀释倍数对烟草野火病均有较好的防效。第7天，2倍稀释和5倍稀释对野火病的相对防效显著好于72%农用链霉素4000倍液处理，10倍稀释的相对防效与农用链霉素处理相当。 

 本发明的优点 

从烟株根际土壤中分离获得的灰产色链霉菌TYFCQ272菌株，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身在平板上对烟草野火病菌等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草野火病有很好的防控效果。因为该菌株是从烟田土壤中分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。

附图说明

图1为拮抗放线菌菌株TYFCQ272对烟草野火病菌的平板拮抗效果 

图2为菌株TYFCQ272对烟草野火病的控制效果

图3为菌株TYFCQ272 在7种鉴定培养基上的菌落特征

培养基由前至后分别为ISP-2培养基、ISP-3培养基、ISP-4培养基、ISP-5培养基、高氏一号培养基、查氏培养基、马铃薯浸汁培养基

图4为菌株TYFCQ272菌丝体及孢子链特征

图5为菌株TYFCQ272蛋白质酶活性检测结果

图6为菌株TYFCQ272几丁质酶活性检测结果

图7为菌株TYFCQ272纤维素酶活性检测

图8为菌株TYFCQ272嗜铁素活性检测

图9为基因组DNA1.0%琼脂糖凝胶电泳，12为菌株TYFCQ272

图10为PCR后1.0%琼脂糖凝胶电泳图 ，4为菌株TYFCQ272

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述 

实施例1.灰产色链霉菌TYFCQ272菌株的鉴定 

1.1菌落特征观察：用酵母精麦芽糖琼脂培养基（ISP-2）、燕麦粉琼脂培养基（ISP-3）、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP-4）、甘油天门冬素琼脂培养基（ISP-5）以及马铃薯浸汁培养基、察氏（Czapck）培养基和高氏一号培养基，划线接种于以上7种培养基平板上，28℃恒温培养7-14天，待其菌丝生长稳定后，用解剖镜分别观察单菌落形态、气生菌丝、基内菌丝、孢子丝颜色。

1.2菌丝体与孢子特征观察：采用插片法观察待测菌菌丝的形态以及孢子特征。取待测菌菌悬液涂布于高氏一号培养基上，用镊子夹取已灭菌的盖玻片，以大约45°角斜插入培养基内，每平板插4-5片。将插片后的平板倒置于28℃培养，3-5天后用镊子小心取出盖玻片，然后将有菌的一面盖在载玻片上，直接用显微镜观察待测菌的气生菌丝、孢子链及孢子的着生情况。由此从形态上初步确定待测病菌的分类地位。 

1.3分子生物学鉴定：通过提取TYFCQ272基因组DNA和16S rDNA PCR扩增, TYFCQ272扩增出的16S rDNA片段长度为1488bp,具体碱基片段为 

GGCCTGCCGCGTCTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGAGCCTCCAAGGCATCTTGGAGGTTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGACTGACTATAAACGGCTTGTGTGGTGAGAGTATATGGCTCACACAAGGCAGACGACACCGGTAGCCGGCCTGAGAGGGGGCGACCGGCAACACCTGGGAACTGAGGAACACGGCCCAGACTCTTACGGGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATACCGTGAAGGTGGGAGCGCGAATCCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTAGCGATTGGACGAAGTCGAACAAGAGCAGCAAGGG

与链霉菌属（Streptomyces sp.）在遗传上相近。

实施例2. 灰产色链霉菌TYFCQ272菌株控病效果 

2.1 菌株TYFCQ272抑菌效果：将菌株点接种在PDA平板中心， 28℃恒温培养 3天后，再把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，杀死TYFCQ272菌。然后用猴头喷雾器将3×10⁸ cfu/mL 的烟草野火病菌菌悬液喷于平板上（约100μL/皿），重复 3 次。28℃恒温条件下培养48h后，测量抑菌圈的直径。确定菌株TYFCQ272对烟草野火病菌的抑制效果。

2.2 菌株TYFCQ272控病效果：设4个处理1：采用喷雾接种，喷洒拮抗菌菌悬液至叶片上布满雾点为度，接种后保湿培养24h；2：喷施拮抗菌无菌发酵滤液，接种方法同处理1：3：农药对照（CK2），72%农用链霉素可湿性粉剂4000倍，接种方法同处理1；4：空白对照（CK1），只喷施等量清水；第一次处理后第2天接种烟草野火病菌菌悬液，以后每隔7天处理1次，共3次，调查烟草野火病发病情况，以接种病原菌日为起点日，记录第7天、14天和21天的发病情况，并计算病情指数和防治效果。确定菌株TYFCQ272对烟草野火病的控制效果。 

分级标准参照中华人民共和国国家标准——烟草病虫害分级及调查方法GB/T 23222-2008。 

实施例3. 菌株TYFCQ272代谢产物分析 

3.1 几丁质酶活性检测

唯一碳源培养基（Chi-Ayers）：磷酸二氢铵 1.0g、硫酸镁 0.2g、氯化钾 0.2g、琼脂20g、1%胶体状几丁质定容至l000mL，pH：7.0。 

胶体状几丁质的制备：20g甲壳素溶于350mL浓盐酸，在4℃放置 24h，经玻璃棉过滤，滤液加入-20℃过夜的冰无水乙醇2L，10000 r/min离心20min，自来水冲洗沉淀至中性pH，冷冻干燥，-20℃密封保存。使用胶体状几丁质时，必须用手动匀浆器研磨5次以上。 

将拮抗菌接在上述培养基制成的平板上，28℃培养7-10天，观察透明圈有无及测量透明圈的大小，如有透明圈则表明菌株产生了几丁质酶。以此确定TYFCQ272产几丁质酶情况。 

3.2 纤维素酶检测 

纤维素刚果红培养基：磷酸二氢钾 0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、羧甲基纤维素钠1.88 g/L、明胶2.0g/L、刚果红0.2g/L、琼脂20g/L，pH：7.0

把待测菌接到上述培养基上，28℃培养7-10天后，用刚果红（lg/mL）染色lh，倒掉刚果红染液后，再用氯化钠（1M）浸泡lh，观察透明圈的有无，如有透明圈则表明菌株产生了纤维素酶。以此确定TYFCQ272产纤维素酶情况。

3.3 蛋白酶的检测 

蛋白培养基：脱脂奶粉40g，琼脂16g，定容至400mL。

将待测菌接种于上述蛋白培养基上，25℃培养3～5天，观察菌落周围有无透明圈。如有透明圈则表明菌株产生了蛋白酶。以此确定TYFCQ272产蛋白酶情况。 

3.4 嗜铁素的检测 

嗜铁素培养基：A：a. 60.5mg铬天青S溶于50mL去离子水；b. 10mL三价铁溶液（1mM 六水三氯化铁、10mM盐酸为溶剂）；c. 72.9mg溴化十六碳烷基三甲铵溶于40mL去离子水。上述a、b、c三种溶液混合后定容至100mL，调pH至中性，121℃灭菌20min。B：1000mLNA培养液，用NaOH溶液将培养液pH调至6.8，121℃ 灭菌20min。灭菌结束后混合A，B液后制成平板，接种待测菌，28℃培养7-10天观察颜色变化，如有晕圈则表明菌株产生了嗜铁素。以此确定TYFCQ272产嗜铁素情况。

16S rDNA基因序列：

 

  1    GGCCTGCCGC GTCTACCATG CAAGTCGAAC GATGAACCTC CTTCGGGAGG GGATTAGTGG

  61   CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTTCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG

  121  GGGTCTAATA CCGGATACGA GCCTCCAAGG CATCTTGGAG GTTGGAAAGC TCCGGCGGTG

  181  AAGGATGAGC CCGACTGACT ATAAACGGCT TGTGTGGTGA GAGTATATGG CTCACACAAG

  241  GCAGACGACA CCGGTAGCCG GCCTGAGAGG GGGCGACCGG CAACACCTGG GAACTGAGGA

  301  ACACGGCCCA GACTCTTACG GGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGAAAG

  361  CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG GTTGTAAACC TCTTTCAGCA

  421  GGGAAGAAGC GAAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG

  481  CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GAGCTCGTAG

  541  GCGGCTTGTC ACGTCGGGTG TGAAAGCCCG GGGCTTAACC CCGGGTCTGC ATTCGATACG

  601  GGCTAGCTAG AGTGTGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT GTAGCGGTGA AATGCGCAGA

  661  TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG ATCTCTGGGC CATTACTGAC GCTGAGGAGC

  721  GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGGTGGGA

  781  ACTAGGTGTT GGCGACATTC CACGTCGTCG GTGCCGCAGC TAACGCATTA AGTTCCCCGC

  841  CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCAG

  901  CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT ACCAAGGCTT GACATACACC

  961  GGAAAGCATT AGAGATAGTG CCCCCCTTGT GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC ATGGCTGTCG

  1021 TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC TTGTTCTGTG

  1081 TTGCCAGCAT GCCCTTTCGG GGTGATGGGG ACTCACAGGA GACCGCCGGG GTCAACTCGG

  1141 AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT GCCCCTTATG TCTTGGGCTG CCACACGTGC

  1201 TACAATGGCC GGTACAAAGA GCTGCGATAC CGTGAAGGTG GGAGCGCGAA TCCTCAAAAA

  1261 GCCGGTCTCA GTTCGGATTG GGGTCTGCAA CTCGACCCCA TGAAGTCGGA GTTGCTAGTA

  1321 ATCGCAGATC AGCATTGCTG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA

  1381 CGTCACGAAA GTTGGTAACA CCCGAAGCCG GTGGCCCAAC CCCTTGTGGG AGGGAGCTGT

  1441 CGAAGGTGGG ACTAGCGATT GGACGAAGTC GAACAAGAGC AGCAAGGG

Claims (1)

1.一株用于防治烟草野火病的灰产色链霉菌 (Streptomyces griseochromogenes) TYFCQ272，其保藏号为CGMCC NO.6228。

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