CN101372680A - 一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌，属于微生物领域。一株荧光假单孢杆菌PF7－5，其保藏登记号CGMCC No.2069。本发明的优点是：本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7－5为一种生防细菌，它能够通过微生物发酵途径获得对烟草野火病具有显著防效的代谢产物，具有良好的生物农药开发前景。

Description

一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌
技术领域
本发明涉及一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌，属于微生物领域。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物之一。烟草野火病是烟草主要的细菌性病害，在全国各烟区均有发生，每年均造成一定程度的危害和经济损失。
目前该病害的防治方法主要以化学农药为主，然而化学农药使用带来的农药残留、污染环境等问题正日益受到全世界的关注，发展绿色农业是农业可持续发展的需要，也是全球农业发展的趋势和走向。
“无公害烟叶”、“烟草可持续发展”等农业可持续发展战略的实施，引起了人们对化学农药的潜在危险和危害的重视。因此，符合环保、健康，可持续发展理念的高效、低毒、低残留、与环境相容的生物防治，就成为当前无公害农业生产研究的主题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对烟草生长无危害且对烟草野火病具有有显著防效的荧光假单胞杆菌。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株荧光假单孢杆菌PF7-5，其保藏登记号CGMCC No.2069。
所述的荧光假单孢杆菌PF7-5用于制备防治烟草野火病的药物的应用。
菌株的形态特征如下：革兰氏阴性菌，极生鞭毛，可游动，大小0.5-1.0um×1.5-5.0um。LB培养基上菌落金黄色，氧化酶反应阳性，精氨酸双水解酶阳性，产生黄绿色荧光色素；对氨苄青霉素、氯霉素具有较强的抗性。在pH值低于4及大于10的条件下细菌几乎不能生长，最适pH值为7。最佳培养基成份：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml，琼脂15g。最适生长温度26-28℃。
本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5是从烟草根际土壤中分离得到。该菌株的代谢产物对烟草野火病具有显著抑制作用。
培养条件：
(1)斜面培养：培养时间2-3天，培养基成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml，琼脂15g。pH值7.0，最适生长温度26-28℃。
(2)种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的但菌落接入种子培养液中，26℃摇菌16-18个小时，转速200rpm。种子培养液成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml。pH值7.0。
(3)发酵：按5％的的接种量接入种子培养基，振荡培养3天(72小时)，转速200rpm。培养液成分同上。
本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5其16S—23S ribosomal RNA序列如序列表SEQID No.1所示。
本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5其DAPG(2，4-diacetylphloroglucinal，2，4-二乙酰基藤黄酚)合成酶基因序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5其PCA(Phenazine-l-carboxylic acid，吩嗪-1-羧酸)合成酶基因序列如序列表SEQ ID No.3所示。
本发明所涉及的荧光假单孢杆菌PF7-5经鉴定确定为荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)的一个株系，定名为PF7-5，已于2007年5月31日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.2069。保存地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
本发明的优点是：本发明所述的荧光假单孢杆菌PF7-5为一种生防细菌，它能够通过微生物发酵途径获得对烟草野火病具有显著防效的代谢产物，具有良好的生物农药开发前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为本发明菌株的光镜照片，图中细胞为杆状，并具有一条或两条极生鞭毛。
具体实施方式
实施例1：荧光假单孢杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)的培养
培养条件：
(1)斜面培养：培养时间2-3天，培养基成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml，琼脂15g。pH值7.0，温度26℃。
(2)种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的但菌落接入种子培养液中，26℃摇菌16-18个小时，转速200rpm。种子培养液成分(1升)：蛋白胨25g，葡萄糖6.2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾1.5g，甘油10ml。pH值7.0。
(3)发酵：按5％的的接种量接入种子培养基，振荡培养3天(72小时)，转速200rpm。培养液成分同上。
实施例2：荧光假单孢杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)对烟草野火病室内拮抗试验
上述荧光假单孢杆菌PF7-5发酵液2000rpm离心后80℃15分钟灭活，同时对枯草芽孢杆菌BS06-1(筛选分离自烟草根际土壤)以及普通细菌LBA4404的代谢产物进行灭活。试验进行如下处理：
A:CGMCC No.2069(PF7-5)10ml+100ul野火病(烟草病原细菌)+40ml液体LB；
B:枯草芽孢杆菌BS06-1代10ml+100ul野火病+40ml液体LB；
C:普通细菌代10ml+100ul野火病+40ml液体LB；
D:农用链霉素+100ul野火病+50ml液体LB；
E:角斑净+100ul野火病+50ml液体LB；
F:对照，100ul野火病+50ml液体LB。
各处理25℃过夜振荡培养。次日测OD600的吸光值(用各处理的备用样进行调零)，计算抑菌率。抑菌率＝(1-(OD处理/OD对照)×100。
实验结果见下表1，结果表明荧光假单孢杆菌PF7-5发酵液对烟草野火病的抑菌效果达到96％。
表1.荧光假单孢杆菌PF7-5发酵液对烟草野火病的抑菌效果
 
A B C D E F
OD600 0.022 0.296 0.401 0.398 0.014 0.532
抑菌率％ 96 44 25 25 97
实施例3：荧光假单孢杆菌PF7-5(CGMCC No.2069)对烟草野火病田间防效试验
试验于黑龙江省烟草科学研究所试验场进行，品种为NC89。烟草田间旺长期每隔4天分别喷施3次药剂，药剂处理如下：
A：CGMCC No.2069(P.fluorescens7-5)活菌(菌液8000rpm离心后，菌体溶于无菌水中)；B：CGMCC No.2069(P.fluorescens7-5)代谢产物(菌液8000rpm离心后上清液)；C:BS06-1活菌(菌液8000rpm离心后，菌体溶于无菌水中)；D:BS06-1代谢产物(菌液8000rpm离心后上清液)E：农用链霉素4000倍；F：库珀宝5000倍；G：水。
各处理3次施药完毕后隔4天接种烟草野火病菌菌液，跟踪调查烟草野火病发病情况，每株烟由下至上调查10片叶。计算各处理病情指数以及抑菌效果。烟草角斑病病害严重度分级标准(以叶片为单位)：
0级：全叶无病。
0.5级：病斑面积占叶片面积的1％以下。
1级：病斑面积占叶片面积的1％～5.0％。
2级：病斑面积占叶片面积的5.0％～10％。
3级：病斑面积占叶片面积的10.0％～20％。
4级：病斑面积占叶片面积的20％以上。
病情指数＝∑(病害等级×该级叶数)/(调查叶数×最严重等级)×100；抑菌效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。
实验结果见表2，结果表明荧光假单孢杆菌PF7-5对烟草野火病的抑菌效果达到91.9％。
表2.荧光假单孢杆菌PF7-5田间对烟草野火病的抑菌试验结果
 
处理 调查株数 感病叶数 最高病级 发病率％ 病情指数 防效(％)
A 12 10 1 8.3 2.2 91.9
B 12 19 2 15.8 5.6 79.4
C 12 33 2 27.5 18.3 32.7
D 12 50 2 41.7 27.8 -
E 12 72 3 60.0 28.5 -
F 12 70 3 58.3 26.4 2.9
G(CK) 12 75 3 62.5 27.2
序列表
<110>黑龙江省烟草科学研究所
<120>一株防治烟草野火病的荧光假单胞杆菌
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>540
<212>DNA
<213>荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)
<400>1
Figure A200810224386D00071
<210>2
<211>856
<212>DNA
<213>荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)
<400>2
Figure A200810224386D00081
<210>3
<211>856
<212>DNA
<213>荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)
<400>3
Figure A200810224386D00082
Figure A200810224386D00091

Claims (2)

1.一株荧光假单孢杆菌PF7-5，其保藏登记号CGMCC No.2069。
2.权利要求1所述的荧光假单孢杆菌PF7-5用于制备防治烟草野火病的药物的应用。
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