CN112899171B - 白囊耙齿菌ll210及其应用、生防菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白囊耙齿菌LL210及其应用、生防菌剂。本发明提供的白囊耙齿菌LL210，分类命名为Irpex lacteus，保藏菌号CGMCC No.21057。该菌株是从番茄叶片上分离得到，无毒、无致病性。平板对峙试验表明，该菌株能够有效抑制番茄灰霉病菌和番茄晚疫病菌菌丝生长及孢子萌发，可用于拮抗植物病原真菌番茄灰霉病菌和/或疫霉菌。本发明利用白囊耙齿菌LL210制备的生防菌剂防治番茄病害，对番茄灰霉病、晚疫病的防治效果分别达到81.35％和87.68％，具有良好的防病效果且与环境相容性好，为番茄等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。

Description

白囊耙齿菌LL210及其应用、生防菌剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及的是白囊耙齿菌LL210及其应用、生防菌剂。
背景技术
我国设施蔬菜生产模式具有低投入、低能耗、集约化、全年栽培等特点，导致连作障碍逐年严重，病害高发，已成为制约我国设施蔬菜可持续利用的瓶颈问题。比如尖孢镰刀菌侵染引起的番茄灰葡萄孢菌侵染引起的番茄灰霉病、疫霉菌引起的番茄晚疫病等。目前对病原微生物的防治主要包括物理防治、化学防治和生物防治等，大多数使用的仍然是传统的化学防治，比如有机磷酸酯类农药、有机砷类、苯类农药的使用。虽然这些化学药品见效快，但是长期使用会导致这些病原菌增强对药物的抗性，而且会危害人类身体健康，对环境造成污染，不符合可持续发展的理念。生物防治是近年来新兴起的一种防治方法，由于无环境污染，无药物残留，并且能满足无公害生产蔬菜的要求，在此方面的研究也越来越多，生防菌也被越来越多的人所青睐。
白囊耙齿菌是一种世界性分布的白腐真菌。因其能够降解木质素和木质素衍生的芳香族化合物以及在水土环境中表现出显著的污染物抗性，而被认为是生物降解有机污染物的优良菌株，同时该菌株含有药用成分而被用作药物制剂。目前，关于白囊耙齿菌对植物病原真菌的作用方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210，该白囊耙齿菌对番茄灰霉病菌和/或疫霉菌具有显著的抑菌效果，能够应用于拮抗番茄灰霉病菌和/或疫霉菌，以及番茄灰霉病菌和/或番茄晚疫病菌的病害防治。
本发明的目的还在于，将上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210应用于生防菌剂的制备，并进一步提供了含有白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210的生防菌剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，其分类命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210，保藏编号为CGMCC No.21057。
本发明提供了上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在拮抗植物病原真菌中的应用，优选的，所述植物病原真菌为番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)和/或疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary)。
本发明提供了上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在植物病害防治中的应用，优选的，所述植物病害为番茄灰霉病和/或疫霉菌。
优选的，所述应用包括以下步骤：采用白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210培养液对番茄植株进行喷雾，将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210培养液喷在番茄叶片的正反面。
进一步优选的，所述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210培养液的制备方法包括以下步骤：接种白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210单菌落于LB液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160r·min-1培养24h，采用无菌水将培养后所得菌液的菌落稀释至4×108cfu·mL–1，即得。
本发明提供了上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在制备植物生防菌剂中的应用。
本发明还提供了一种生防菌剂，包括生防菌和辅料，所述生防菌为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210，保藏编号为CGMCC No.21057。
保藏说明
本发明提供的白囊耙齿菌，其分类命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年11月17日，保藏编号为CGMCC No.21057。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的白囊耙齿菌LL210，分类命名为Irpex lacteus，保藏菌号CGMCCNo.21057。该菌株是从番茄叶片上分离得到，无毒、无致病性。平板对峙试验表明，该菌株能够有效抑制番茄灰霉病菌和番茄晚疫病菌菌丝生长及孢子萌发，可用于拮抗植物病原真菌番茄灰霉病菌和/或疫霉菌。该菌株能够作为农业生防真菌代替化学农药使用，不会危害人畜健康，安全高效，环境友好，有广阔的应用前景。
白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210筛选自番茄叶片，无毒、无致病性。该菌株在与宿主植物协同进化的过程中，形成了稳定的生态关系，内生细菌可以通过自身产生或诱导宿主产生抗菌物质，分泌胞外信号小分子协同宿主响应，调控生长素和茉莉酸的水平，或通过与植物病原菌竞争生态位和营养物质对植物病害起到防治作用。本发明利用白囊耙齿菌LL210制备的生防菌剂防治番茄病害，对番茄灰霉病和/或晚疫病的防治效果分别达到81.35％和87.68％，具有良好的防病效果且与环境相容性好，为番茄等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。
附图说明
图1是白囊耙齿菌菌落及孢子形态图；
图2是白囊耙齿菌LL210对番茄灰霉病病原菌菌丝生长的抑制作用结果图；
图3是白囊耙齿菌LL210对番茄晚疫病病原菌菌丝生长的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类培养基、试剂、等均为市售商品。实施例中的供试病原菌有番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、番茄疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary)，均由本实验室从番茄发病植株分离并保存。
实施例1拮抗菌的分离鉴定
本发明从番茄叶片上分离得到一株拮抗番茄病原真菌的白囊耙齿菌LL210，其无毒、无致病性，为番茄等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。
在发病的番茄植株上选取健康叶片进行采样，放入事先准备好的经灭菌备用的自封袋内，带回实验室进行分离。在超净工作台中，先将材料放入无菌水中清洗，接着用75％酒精消毒10-30s，无菌水冲洗3次，再用升汞消毒15s，无菌水冲洗3次，在无菌纸上吸干多余的水分。用手术刀将材料切成1cm左右的正方形小块，伤口朝下插入PDA培养基中，在28℃恒温培养箱中培养数天，待菌落长出后，打柄器打菌饼至PDA培养基中，放至28℃恒温培养箱纯培养。
形态特征观察结果如下：
菌落特征：该菌株菌落表面呈白色，密被短绒毛，环纹不明显，边沿薄，波状，起伏，菌盖下籽实层面白色或白囊色。形态特征如图1。
DNA序列分析结果如下：
利用CTAB法提取菌株DNA，采用通用引物：ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT-3’和ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3’对提取的基因组DNA进行扩增，PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司测序，将所得核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS基因)序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现其与白囊耙齿菌有100％的序列同源性。
结合形态学特征和分子鉴定，将该菌株鉴定为白囊耙齿菌。
本实施例提供的白囊耙齿菌LL210，其分类命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年11月17日，保藏编号为CGMCC No.21057。
实施例2白囊耙齿菌LL210对番茄灰霉病病原菌菌丝生长的抑制作用
该实施例验证了白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210对植物病原真菌的拮抗作用，所述植物病原真菌为番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)。
在直径为9cm的PDA培养基平板上，平板一侧放置直径为0.8cm的白囊耙齿菌菌饼，在另一侧放置相同大小的番茄灰霉病病原菌菌饼，两菌饼间隔4.5cm，置于28℃恒温培养箱中培养，分别在第7-14d时统计抑菌率。
结果如下表所示，白囊耙齿菌对番茄灰霉病菌菌丝生长有明显的抑制作用(图2)，培养7-14d时的抑菌率分别为：
时间 7d 8d 9d 10d 11d 12d 13d 14d
抑菌率 64.4％ 66.7％ 73.3％ 73.3％ 81.1％ 86.7％ 88.9％ 100％
实施例3白囊耙齿菌LL210对番茄晚疫病病原菌菌丝生长的抑制作用
该实施例验证了白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210对植物病原真菌的拮抗作用，所述植物病原真菌为番茄疫霉菌(P.infestans(Mont.)De Bary)。
在直径为9cm的PDA培养基平板上，平板一侧放置直径为0.8cm的白囊耙齿菌菌饼，在另一侧放置相同大小的番茄晚疫病病原菌菌饼，两菌饼间隔4.5cm，置于28℃恒温培养箱中培养，分别在第7-14d时统计抑菌率。结果如下表所示，白囊耙齿菌LL210对番茄疫霉菌菌丝生长有明显的抑制作用(图3)，培养7-14d时的抑菌率分别为：
时间 7d 8d 9d 10d 11d 12d 13d 14d
抑菌率 65.6％ 68.9％ 77.8％ 82.2％ 85.6％ 91.1％ 94.4％ 100％
实施例4茄灰霉病和/或番茄晚疫病的防治
该实施例提供了白囊耙齿菌LL210在植物病害防治中的应用，所述植物病害为番茄灰霉病和/或番茄晚疫病。
步骤一、接种白囊耙齿菌LL210单菌落于200mL LB液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160r.min-1培养24h，将所培养的菌液稀释至4×108cfu.mL-1，制备出预防番茄灰霉病和/或番茄晚疫病的制剂；
步骤二 取长至5-6叶，长势一致的盆栽番茄，用防治番茄灰霉病和/或番茄晚疫病制剂喷雾至番茄叶片正反面，以清水作为对照，24h后将番茄灰霉病和/或番茄晚疫病菌的孢子悬浮液1×107个孢子/mL(将少许无菌水注入已长满番茄灰霉病和/或晚疫病菌病菌的PDA平板内，将琼脂表面的孢子刮下，倒入无菌容器内，充分振荡后用灭菌的纱布过滤，于血球计数板中计数)喷雾接种其上。番茄植株培养于人工气候箱(23℃，r≧90％)中。每个处理3盆，每盆3株，重复3次。接种后7d调查番茄的发病情况，病情分级采取5级标准。0级：无病斑，叶片无症状，植株健康；1级：病斑面积占总叶片的10％以下；2级：病斑面积占总叶片的10％-50％；3级：病斑面积占总叶片的50％以上；4级：植株死亡。
病情指数＝100×[Σ(各级病叶数×病害级别数)]/(调查总叶数×4)
防治效果(％)＝[(对照病情指数-拮抗菌株处理后病情指数)]/对照病情指数]×100
结果表明：喷雾治疗和预防番茄灰霉病和/或晚疫病制剂的番茄植株比用清水处理的病情指数分别降低33.33和38.51，防治效果分别为81.35％和87.68％(见表1)。
表1白囊耙齿菌LL210对番茄灰霉病和/或晚疫病的防治效果
Figure BDA0003006457220000051
<110> 河南科技大学
<120> 白囊耙齿菌LL210及其应用、生防菌剂
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 白囊耙齿菌(Irpex lacteus)
<221> 核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS基因)
<400> 1
catgtgcacg cctggctcat ccactcttaa cctctgtgca ctttatgtaa gagaaaaaaa 60
tggtggaagc ttccaggatc tcgcgagagg tcttcggttg aacaagccgt ttttctttct 120
tatgttttac tacaaacgct tcagttatag aatgtcaact gtgtataaca catttatata 180
caactttcag caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240
aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcactcc 300
ttggtattcc gaggagtatg cctgtttgag tctcatggta ttctcaaccc ctaaattttt 360
gtaatgaagg tttagcgggc ttggacttgg aggttgtgtc ggcccttgtc ggtcgactcc 420
tctgaaatgc attagcgtga atcttacgga tcgccttcag tgtgataatt atctgcgctg 480
tggtgttgaa gtatttatgg tgttcatgct tcgaaccgtc tccttgccga gacaatcatt 540
tgacaatctg agctcaaatc 560

Claims (7)

1.白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，其特征在于，其分类命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus) LL210，保藏编号为CGMCC No.21057。
2.如权利要求1所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在拮抗植物病原真菌中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为番茄灰霉病菌和/或疫霉菌。
3.如权利要求1所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述植物病害为番茄灰霉病和/或番茄晚疫病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：采用白囊耙齿菌(Irpex lacteus) LL210培养液对番茄植株进行喷雾，将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)LL210培养液喷在番茄叶片的正反面。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述白囊耙齿菌(Irpex lacteus) LL210培养液的制备方法包括以下步骤：接种白囊耙齿菌(Irpex lacteus) LL210单菌落于LB液体培养基中，28℃的恒温振荡培养箱中160 r·min-1培养24 h，采用无菌水将培养后所得菌液的菌落稀释至4×108 cfu·mL–1，即得。
6.如权利要求1所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)在制备植物生防菌剂中的应用。
7.一种生防菌剂，其特征在于，包括生防菌和辅料，所述生防菌为白囊耙齿菌(Irpex lacteus) LL210，保藏编号为CGMCC No.21057。
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