CN114672424B - 一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用 - Google Patents

Abstract

本申请实施例公开了一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用。该内生菌是从茶树体内分离出的一株新型内生菌，通过形态学和分子生物学鉴定为Irpex lacteus No.2，已保藏在中国典型培养物保藏中心。通过拮抗实验结果表明，该内生菌对植物常见病原菌表现出了良好的抑菌效果，进一步说明该内生菌株能够用于植物病害的绿色安全防控。

Description

一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用

技术领域

本申请涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis)是多年生木本植物，是我国重要的经济作物。茶叶是一种天然保健饮品，并被称誉为21世纪的健康饮料。然而病虫害持续发生严重危害茶叶生产，传统的化学防治对茶叶的品质和健康安全存在隐患，给茶产业造成了一定的负面影响。以生物农药(微生物、植物源等天然产物)代替化学农药防治茶园病虫害，对茶产业绿色健康可持续发展具有重要意义。茶树内生菌作为潜在的生物防治资源，具有巨大的潜力。

茶树内生菌与茶树之间存在长期协同进化的关系，具有安全、对茶树生长无危害等优点，是较为理想的茶树病原菌的生物防治资源，具有潜在的开发应用价值。

但是，目前对茶树内生菌的研究起步较晚、研究较少。目前，业内研究人员在茶树内生菌的种类、内生菌在茶树体内的分布特征和内生菌与茶树的相互作用等进行了初步的探索，但利用茶树内生菌资源对茶树病害的预防作用研究报道较少。

发明内容

鉴于现有技术问题，本申请提供了一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用，其目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

第一方面，本申请实施例公开了一种茶树内生菌，该菌株命名为(Irpex lacteus)No.2，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 2022504，保藏日期为2022年4月27日。

第二方面，本申请实施例公开了一种冻干管，所述冻干管包含第一方面所述的茶树内生菌。

第三方面，本申请实施例公开了第二方面所述冻干管的制作方法，其步骤包括：

茶树内生菌株的培养，离心，收集菌体；

制备含有保护剂的菌体混悬液；

将菌体混悬液在无菌环境中分装到已灭菌的冷冻管中，用液氮或干冰进行预冻；

将预冻好的菌体，放入真空冷冻干燥设备中进行冻干；

冻干管抽真空后，保存于4℃冰箱。

第四方面，本申请实施例公开了一种生物防治菌制剂，所述制剂包含第一方面所述茶树内生菌。

第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述茶树内生菌的筛选方法，其步骤包括：

茶树组织的选取及表面消毒；

分离茶树内生菌；以及

茶树内生菌的鉴定。

进一步地，用于消毒茶树表面组织的溶剂为酒精、次氯酸钠溶液及无菌水的一种或组合。

进一步地，茶树内生菌的分离方法有孢子分离法、组织分离法和基质分离法，优选地为组织分离法。

进一步地，茶树内生菌的鉴定方法包括形态学特征验证及ITS测序鉴定。

第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述茶树内生菌在植物病害防治的应用。

优选地，所述应用包括植物炭疽病原菌和轮斑病原菌的防治。

更优选地，所述应用包括茶树炭疽病原菌和茶轮斑病原菌的防治。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本申请中涉及一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用，该茶树内生菌株为Irpex lacteus No.2，该内生菌株为本申请公开的一种新型茶树内生菌，并且所述内生菌未被作为一种生防菌种用于防治植物病原菌的相关报道。所述内生菌对于几种植物病原菌(如炭疽病原菌和茶轮斑病原菌)具有很好拮抗活性，相比于传统的化学防治，所述内生菌能够安全、高效、无污染地进行植物病害防治，减少对生态环境的污染，提高农产品的质量安全，保障人类的健康。

附图说明

图1为本申请实施例提供的茶树内生菌株的形态特征图。

图2为本申请实施例提供的茶树内生菌株与其相关菌株基于ITS基因的系统发育树。

图3为本申请实施例提供的茶树内生菌对峙胶孢炭疽菌7d抑菌效果图。

图4为本申请实施例提供的茶树内生菌对峙茶拟盘多毛孢7d抑菌效果图。

图5为本申请实施例提供的第7天时茶树内生真菌对2种病原菌的抑菌率。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

茶树内生菌株的分离与鉴定

1、茶树组织表面消毒

取健康茶树根茎叶组织，将表面泥土用自来水洗净，先在70％酒精中浸泡1min，然后放入3％浓度次氯酸钠溶液浸泡4min，再置于70％酒精中浸洗30s，最后用无菌水冲洗5遍，吸取100μL最后一遍冲洗的无菌水涂布于PDA培养基上，以制备对照培养基。

2、茶树内生菌分离

组织分离法：将表面消毒后的茶树组织切成5mm*5mm的小块，切面处贴在PDA培养基上，25℃恒温培养7d，每天观察，并用移菌环将新长出的菌丝挑出单独培养。

3、茶树内生菌的鉴定

将茶树内生真菌在PDA培养基上25℃恒温培养5天后，观察其形态学特征并对其进行形态学鉴定。结果如图1所示：观察到菌落边缘整齐，颜色为白色偏淡黄色，伴有大量的棉絮状气生菌丝，在显微镜下观察到该菌丝为有隔菌丝，菌丝较细，分支较多。根据其形态结构特征，将其初步鉴定为耙齿菌属。

对内生真菌进行ITS基因测序，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，并构建系统发育树。结果如图2所示，ITS序列分析结果表明，分离的茶树内生菌株与白囊耙齿菌Irpex lacteus(MN856303.1)处于同一分支上，表明与其相似度最高，同时与Irpexlacteus(MH301114.1)和Irpex lacteus(MG748584.1)属于同一亚群，结合其形态学特征，将该真菌鉴定为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)。茶树内生真菌(Irpex lacteus)No.2的ITS序列为：如SEQ ID NO.1所示。

ITS测序鉴定结果如表1所示：

表1

茶树内生菌(Irpex lacteus) No.2的拮抗实验

本实施例为茶树内生菌Irpex lacteus No.2在植物病害防治的应用之一，本实施例中将茶树内生菌Irpex lacteus No.2对两种植物病害(茶炭疽病和茶轮斑病)的病原菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和茶拟盘多毛孢进行平板对峙实验，并在不同的培养时间统计菌落生长的直径，并计算抑菌率。

1.平板对峙法：

从病原菌菌落边缘刻出半径为5mm的菌饼，菌丝朝下接种于PDA培养基平板中心点，用同样的方法刻出4个拮抗内生菌菌饼，分别接种于距离病原菌菌饼2.5cm的四个方向上，用不放置拮抗菌菌饼的平板作对照，25℃恒温培养7d，每天测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。

2.抑菌率计算方法：

拮抗菌抑菌率(％)＝((对照组菌落直径-5)-(处理组菌落直径-5))/(对照组菌落直径-5)

3.对峙实验结果：

图3所示的是茶树内生菌Irpex lacteus No.2对峙胶孢炭疽菌1～7d的抑菌效果，其中上方为对照组，下方为处理组；图4所示的是茶树内生菌Irpex lacteusNo.2对峙茶拟盘多毛孢1～7d的抑菌效果，其中上方为对照组，下方为处理组；可以看出茶树内生菌Irpexlacteus No.2对两种病原菌具有很明显的抑菌效果，通过上述公式计算抑菌率，如图5所示，随着时间的增长，抑菌率稳步升高，在第7d时，茶树内生菌Irpex lacteus No.2对2种病原菌的抑菌率均达到最高，分别为75.19±1.16％和74.87±0.77％。

综上所述，本申请提供的茶树内生菌Irpex lacteus No.2以及包含茶树内生菌Irpex lacteus No.2的生物防治菌制剂是能够应用于植物病害防治，且效果良好。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种茶树内生菌及其在植物病害防治的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 643

<212> DNA

<213> Irpex lacteus No.2

<400> 1

tgcggaagga tcattatcga gttttgaacg ggttgtagct ggcctctcac gaggcatgtg 60

cacgcctggc tcatccactc ttaacctctg tgcactttat gtaagagaaa aaaatggtgg 120

aagcttccag gatctcgcga gaggtcttcg gttgaacaag ccgtttttct ttcttatgtt 180

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tctgagctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag cat 643

Claims (5)

1.一种茶树内生菌，该菌株命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)No.2，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M2022504，保藏日期为2022年4月27日。

2.一种冻干管，其包含权利要求1所述的茶树内生菌。

3.权利要求2所述冻干管的制作方法，其步骤包括：

茶树内生菌株的培养，离心，收集菌体；

制备含有保护剂的菌体混悬液；

将菌体混悬液在无菌环境中分装到已灭菌的冷冻管中，用液氮或干冰进行预冻；

将预冻好的菌体，放入真空冷冻干燥设备中进行冻干；

冻干管抽真空后，保存于4℃冰箱。

4.一种生物防治菌制剂，其包含权利要求1所述茶树内生菌。

5.权利要求1所述茶树内生菌在茶树炭疽病和/或轮斑病病害防治的应用。

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