CN113549558B - 一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病虫害防治技术领域，尤其涉及一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana及其应用。本申请是从茶树体内分离一株新型内生菌，通过形态学和分子生物学鉴定为Diaporthe australiana，通过生物活性评价表明，对几种植物上常见的病原菌均表现出很好的拮抗抑菌活性。说明该菌株能够用于植物病原菌的生防菌，应用于植物病害的绿色安全防控。

Description

一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana及其 应用
技术领域
本发明属于植物病虫害防治技术领域，尤其涉及一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana及其应用。
背景技术
植物内生菌是指能够生活在植物各种器官和组织的细胞间隙、细胞内，并与植物建立了和谐共生关系的微生物类群，包括细菌、真菌、放线菌等。这个和谐共生关系表现为其在部分或全部生命周期中寄生在宿主植物体内，且对植株暂时性地没有致病性。内生菌作为植株体的组成部分之一，对植物的生长、生物量积累、碳汇、生物修复等功能发挥着重要作用。
内生菌定殖在宿主植物体内，一方面能够促进植物生长，另一方面能够增强宿主植物对生物(植物病原菌、害虫等)和非生物胁迫的抗性。植物内生菌在一定的发育阶段和外界环境下，自身产生或促进宿主植物产生一系列次生代谢产物，其中相当一部分次生代谢产物具有很高的生物活性并具有广泛的应用前景，如抗生素和免疫抑制剂等。植物内生菌的生物防治机制包括拮抗作用(产生酶类、抗生素、细菌素及挥发性物质)和诱导系统抗病性(诱导植物产生多酚氧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶)。
植物病害是农林业生产的主要威胁之一，长期以来，化学防治是针对植物病害的主要手段，但其缺点日益突出，如造成病原菌的耐药性、污染生态环境、威胁人类健康等。因此，生物防治已成为当下可以用来替代化学防治的重要选项之一。此外，分离对病原菌具有拮抗作用的生防内生菌菌株，是开发利用生防菌用于防治植物病害的前提和基础。
植物内生菌在生物防治中存在多种生防机制，并且不同内生菌的生防机制也具有差异性。内生菌作为生防菌在防治植物病害方面的作用机制也不相同，主要表现为：分泌抗菌物质、与病原物之间竞争营养物质和生态位、促进植物生长和诱导植物产生抗性系统等来抑制病原菌的生长。内生菌现已被认为是生物防治的天然资源，因其安全和高活性，被广泛地应用在植物病虫害绿色防治中，具有广阔的应用潜力和开发应用价值。
茶树(Camellia sinensis)多年生木本植物，是我国重要的经济作物。茶叶是一种天然保健饮品，并被称誉为21世纪的健康饮料。然而病虫害持续发生严重危害茶叶生产，传统的化学防治对茶叶的品质和健康安全存在隐患，给茶产业造成了一定的负面影响。以生物农药(微生物、植物源等天然产物)代替化学农药防治茶园病虫害，对茶产业绿色健康可持续发展具有重要意义。内生菌作为潜在的生物防治资源，具有巨大的潜力。
目前对茶树内生菌的研究起步较晚、研究较少。同时利用茶树内生菌资源对茶树病害的预防作用研究报道较少。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株新型茶树内生生防真菌Diaportheaustraliana及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021866，于2021年7月12日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，培养物名称：Diaporthe australiana Z9。
本发明还提供了如上述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物炭疽病的试剂中的应用。
进一步地，所述植物炭疽病包括苹果炭疽病。
本发明还提供了如上述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物轮斑病的试剂中的应用。
进一步地，所述植物轮斑病包括茶轮斑病。
本发明还提供了如上述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物枯萎病的试剂中的应用。
进一步地，所述植物枯萎病包括棉花枯萎病、西瓜枯萎病中的至少一种。
本发明还提供了如上述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物黑胫病的试剂中的应用。
进一步地，所述植物黑胫病包括烟草黑胫病。
本发明还提供了如上述的一种生防菌剂，包含如上述的新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana。
本申请是从茶树体内分离一株新型内生菌，通过形态学和分子生物学鉴定为Diaporthe australiana，通过生物活性评价表明，对几种植物上常见的病原菌均表现出很好的拮抗抑菌活性。说明该菌株能够用于植物病原菌的生防菌，应用于植物病害的绿色安全防控。当然本专利不仅限于专利中的几种植物病原菌。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1.生物防治
本申请保护的茶树内生菌菌株Diaporthe australiana对几种植物病原菌具有很好拮抗活性。相比于传统的化学防治，生防菌能够安全、高效、无污染地进行植物病害防治，减少对生态环境的污染，提高农产品的质量安全，保障人类的健康。
2.内生菌生防菌株
本申请从茶树中分离出的一株新型的茶树内生菌Diaporthe australiana，目前未见该菌株应用为生防菌，并用于防治植物病原菌的相关报道。
附图说明
图1是内生菌株平板培养效果图；左图为正面，右图为背面；
图2是内生真菌Diaporthe australiana对5种植物病原菌的抑菌率；
图3是内生真菌Diaporthe australiana拮抗苹果炭疽病原菌菌丝生长7d抑菌效果；
图4是内生真菌Diaporthe australiana拮抗茶轮斑病原菌菌丝生长7d抑菌效果；
图5是内生真菌Diaporthe australiana拮抗西瓜枯萎病原菌菌丝生长7d抑菌效果；
图6是内生真菌Diaporthe australiana拮抗番茄枯萎病原菌菌丝生长7d抑菌效果；
图7是内生真菌Diaporthe australiana拮抗烟草黑胫病原菌菌丝生长7d抑菌效果；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana及其应用，具体如下实施例所示。
实施例1内生菌株的分离与鉴定
取健康茶树根茎叶组织，将表面泥土用自来水洗净，先在70％酒精中浸泡1min，然后放入3％浓度次氯酸钠溶液浸泡4min，再置于70％酒精中浸洗1s，最后用无菌水冲洗5遍，吸取100uL最后一遍冲洗的无菌水涂布于PDA培养基上，以制备对照培养基。
组织分离法：将表面消毒后的茶树组织切成5mm*5mm的小块，切面处贴在PDA培养基上，25℃恒温培养7d，每天观察，并用移菌环将新长出的菌丝挑出单独培养。图1为内生菌株平板培养效果图。
对分离出的内生真菌进行ITS和18S基因位点测序，并将测序结果于NCBI上进行BLAST比对得到相似菌种名称为Diaporthe australiana(表1)
表1 ITS测序鉴定结果
Figure BDA0003248198560000041
实施例2内生菌拮抗实验
本实施例中将内生真菌Diaporthe australiana对5种植物病害致病菌(苹果炭疽病致病菌围小丛壳菌(Glomerella ciningulaia(Stonem.)Spauld.et Sch.)，茶轮斑病致病菌茶拟盘多毛孢(Pseudopestalotiopsis theae)，西瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Hiveum(E.F.Smith)Wollen.)，番茄枯萎病致病菌番茄尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici Snyder et Hansen)，烟草黑胫病致病菌烟草疫霉菌(Phylophthora nicotianae))进行平板对峙实验，并在不同的培养时间统计菌落生长的直径，并计算抑菌率。
具体内容如下：
1、平板对峙法：
从病原菌菌落边缘刻出半径为5mm的菌饼，菌丝朝下接种于PDA培养基平板中心点，用同样的方法刻出4个内生菌Diaporthe australiana菌饼，分别接种于距离病原菌菌饼2.5cm的四个方向上，用不放置Diaporthe australiana菌饼的平板作对照，25℃恒温培养7d，每天测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。抑菌率计算方法：
拮抗菌抑菌率(％)＝((对照组菌落直径-5)-(处理组菌落直径-5))/(对照组菌落直径-5)
2、对峙实验结果：研究表明在第七天时，Diaporthe australiana对所选的5种致病菌的抑菌率均在60％以上(图2)，特别是对苹果炭疽病的防治，达到了71％。内生真菌Diaporthe australiana对5种植物病原菌菌丝生长抑制作用效果图见图3-7，其中上方为处理组，下方为对照组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana，保藏编号为：CCTCC NO：M2021866。
2.如权利要求1所述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物炭疽病的试剂中的应用，所述植物炭疽病为苹果炭疽病。
3.如权利要求1所述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物轮斑病的试剂中的应用，所述植物轮斑病为茶轮斑病。
4.如权利要求1所述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物枯萎病的试剂中的应用，所述植物枯萎病为番茄枯萎病、西瓜枯萎病中的至少一种。
5.如权利要求1所述的一株新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana在制备防治植物黑胫病的试剂中的应用，所述植物黑胫病为烟草黑胫病。
6.一种生防菌剂，其特征在于：包含如权利要求1中所述的新型茶树内生生防真菌Diaporthe australiana。
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