CN104593284B - 一株核桃内生菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株核桃内生菌及其应用，该核桃内生菌为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ht‑q6，已于2014年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为9401。本发明是从核桃青皮中分离筛选出的核桃内生菌，鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌((Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Ht‑q6。该菌株对多种植物病原真菌具有拮抗作用，并明确了其发酵培养液的最佳配方和发酵条件，为开发研制生防菌剂提供了菌株资源及理论基础。因为是从植物组织中分离的，所以菌体容易在植株体内定殖，尤其是针对核桃病害，防治效果将更加稳定。

Description

一株核桃内生菌及其应用

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及一株核桃内生菌及其应用。

背景技术

一直以来，植物病虫害是威胁农业生产的主要祸手之一。化学药剂由于其见效快、成本低、使用方便等特点而自上世纪七十年代以来，被人们大量使用，虽然对农作物的产量提高具有重大的作用。但随着社会经济的增长，人们逐渐意识到长期大量使用农药带来的一系列问题：首先杀伤害虫天敌，土壤中微生物的种群减少，破坏了生态平衡；其次由于常年使用，使病原菌与害虫产生了抗药性，防治成本加大、防效降低；还有农药的残留问题，一方面导致生态环境恶化，另一方面食物中存在的农药残留最终威胁到人类的健康。因此在倡导环保和农业可持续性发展的今天，高效低毒低残留、与环境相容性好的生物制剂的开发与应用已成为农药界和植保界人士研究的热点。

目前筛选生防菌及其利用其发酵产物来防治植物病虫害是生防途径之一，生防菌通过直接抑制病原菌的生长或与其竞争生存空间，提高植株抗病虫能力等而达到防病虫害的目的。自Weindling在1932年首次发现木霉菌对植物病原真菌的抑制作用以来，植病生防研究取得了较大的进展，现已筛选出大量的生防菌，并开发出多种生物制剂。但有关的生防菌株大多是从土壤、植物根际或体表分离的，室内测定具有拮抗作用的菌株，室外施用时大多不能在寄主体表或体内正常定殖，同时受环境条件变化和不同生态条件下植物根围微生物种群变化等因素影响，致使其生防效果不稳定，有时甚至无效。

植物内生菌以其占据有利的生态位，不易受环境条件的影响，能够很好定殖于植株的相应部位，抵抗病虫害入侵等独有的优势，成为植物病虫害生物防治的潜在资源菌。因此研究和利用内生菌对于替代或减少农药与化肥的使用，改善农业生态系，保持植物微生态系统的生物多样性，维护农田生态平衡，实现农业可持续发展都具有重要意义。

植物内生细菌是能够定殖在健康植物组织内，并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物。目前，已经从多种植物体内分离筛选出具有生防作用的内生拮抗细菌。其中芽胞杆菌是主要类群之一，由于其芽胞具有耐热、抗逆等特点，易于加工制剂及度过不良环境而受到人们的重视。据报道马英元等(甜菜白粉病内生拮抗细菌的筛选鉴定及其防治效果的研究[J].植物保护，2011，37(2)：25-30)从高抗白粉病的甜瓜品种植株内筛选出对甜瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)有较好防效的内生枯草芽胞杆菌，张宝俊等(内生解淀粉芽胞杆菌 LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报，2010(2)：143-147)从梨树枝条中筛选出对梨黑斑病具有拮抗作用的内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，欧雄常等(拮抗辣椒疫病菌的红树内生细菌筛选及RS261菌株鉴定[J].微生物学通报，2009，36(2)：175-180)从红树内分离筛选出对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)有较好拮抗作用的内生解淀粉芽胞杆菌RS261。窦瑞木等(透骨草内生细菌生理生化特性及抑菌效果研究[J].河南农业科学，2008，5：79-81)从中草药透骨草中筛选出对灰霉菌(Botrytis cinerea)有抑制作用的内生枯草芽孢杆菌。

由胶孢炭疽菌(Gloeosporium fructigenum Berk.)引起的核桃炭疽病是危害核桃果实和叶片的重要病害，据报道分布在我国多个核桃产区，造成落果落叶，对核桃产量和品种造成重要的影响。本专利以核桃炭疽病菌(Gloeosporium fructigenum Berk.)作为目标菌，从核桃的青皮中分离筛选具有抑菌作用的核桃内生菌株。并对其分类地位、抑菌效果和发酵条件的优化配方等进行了系统研究，为进一步开发研制生防制剂提供菌株来源。

对核桃炭疽病化学防治的药剂生产上常用铜制剂、有机硫类、苯并咪唑类等，特别是苯并咪唑类杀菌剂应用较多。如刘霞等(8种杀菌剂对核桃炭疽病病原菌胶孢炭疽菌的室内毒力[J].农药学学报，2013，15(4)：412-420)通过室内筛选，建议在生产中防治核桃炭疽病的化学药剂有咪鲜胺(prochloraz)、戊唑醇(tebuconazole)、三唑酮(triadimefon)、代森锰锌(mancozeb)和异菌脲(iprodione)。但是如果长期和频繁地使用某类杀菌剂，易导致抗药性的产生，防治效果下降，成本上升，并且污染环境，杀伤天敌，破坏生态平衡，且农药残留影响果品，直接危险到人类的健康。

筛选对核桃炭疽病菌有拮抗作用的生防菌株，王清海等(核桃炭疽病高效生防菌株鉴定及抑菌活性[J].山东农业大学学报(自然科学版)，2011，42(3)：335-337)从土壤中分离筛选出4株对核桃炭疽病菌具有较强抑制活性的拮抗细菌，Bf-02为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，Bs-03为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，PF-1为幼虫芽孢杆菌(Bacillus lacivae)，PF-2为短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。生防菌株是从土壤和植物根际分离的，室内测定具有拮抗作用的菌株，室外施用时大多不能在寄主体表或体内正常定殖，同时受环境条件变化和不同生态条件下植物根围微生物种群变化等因素影响，其生防效果往往不稳定，有时甚至无效。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足提供一株核桃内生菌及其应用，本发明以核桃炭疽病菌为目标菌，从核桃组织中分离筛选出对核桃炭疽病菌具有拮抗作用的核桃内生菌。明确其分类地位，抑菌效果及其发酵条件的优化配方。为下一步开发研制生防制剂奠定理论基础。

本发明的技术方案如下：

一株核桃内生菌，它为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ht-q6，该菌株已于2014年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.9401。

核桃内生菌在制备用于防治病原菌的生防制剂中的应用。

所述的核桃内生菌在制备用于防治病原菌的生防制剂中的应用，其中所述病菌为核桃炭疽病菌、梨褐腐病菌、苹果褐腐病菌、茄子枯萎病菌、番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、梨黑斑病菌、苹果干腐病菌、西瓜炭疽病菌和菜豆菌核病菌。

核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用。

所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用，包括如下步骤：

1)将核桃内生菌Ht-q6转接至NB培养液中，于28℃、170r·min^-1下震荡培养24h；

2)将步骤1)培养的核桃内生菌Ht-q6转接至新的NB培养液中，于28℃、170r·min^-1下震荡培养48h；

3)将步骤2)培养的核桃内生菌Ht-q6进行离心，去沉淀，留上清液，得核桃内生菌Ht-q6无菌滤液；

4)用步骤3)所得核桃内生菌Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌进行抑制；

根据权利要求5所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用，其特征在于，步骤1)和步骤2)中所述NB培养液为NA培养基的液体培养基，其中，NA培养基为：蛋白胨0.5g，牛肉膏0.3g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH为7。

有益效果：

1.从核桃青皮中分离筛选出的核桃内生菌，鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Ht-q6。因为是从核桃青皮中分离筛选出的，所以研制的生防菌剂中菌体容易在植株体内定殖，尤其是针对核桃病害，在核桃组织中更容易定殖，防治效果更加稳定。

2.从核桃中分离出对核桃炭疽病菌Gloeosporium fructigenum具有拮抗作用的内生菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Ht-q6，同时对梨褐腐病菌Monilia fructigena、苹果褐腐病菌Marssonina coronaria、茄子枯萎病菌Fusariumoxysporum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、棉花立枯病菌Rhizoctonia solani、梨黑斑病菌Alternaria kikuchiana、苹果干腐病菌Botryosphaeria erengeriana、西瓜炭疽病菌colletotrichum orbiculare和菜豆菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum病原菌具有拮抗作用，对开发研制防治多种病害的新型生防制剂提供菌株来源。

3.本研究通过对菌株Ht-q6的最佳发酵培养的优化研究，筛选出了生产成本相对较低的发酵培养基。为今后该菌株的扩大规模和生产研究应用奠定了基础。即确定产抑菌活性物质最佳培养液配方：1％玉米粉，1％牛肉浸膏，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl；最佳产菌量培养液配方：1％玉米粉，0.5％牛肉浸膏，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.01％KCl；最佳培养条件为：接种量4mL，初始pH6.0，装瓶量75mL/250mL，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间48h。

附图说明

图1-1为核桃内生菌菌株Ht-q6平板菌落形态；

图1-2为核桃内生菌菌株Ht-q6的菌体形态，(光学显微镜40倍)；

图1-3为核桃内生菌菌株Ht-q6的基因组DNA电泳图；

图1-4为核桃内生菌菌株Ht-q6的PCR扩增产物电泳图；

图1-5为基于16S rDNA序列构建的菌株Ht-p6的系统发育树；

图2-1为菌株Ht-q6不同浓度无菌滤液对核桃炭疽菌孢子萌发的影响；

图2-2为菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽菌孢子萌发的抑制(40X)，其中，a：正常萌发的分生孢子；b：干燥条件萌发的分生孢子，孢子芽管短；c：经发酵滤液处理的分生孢子，孢子畸形(c-1)，芽管短，末端膨大(c-2，3)；

图2-3不同浓度无菌滤液对核桃炭疽菌菌丝形态的影响(光学显微镜40倍)，其中，a：正常菌丝；b：产孢正常；c、经无菌滤液处理后的畸形菌丝；d：产孢异常；

图2-4为菌株Ht-q6对不同病原真菌的抑制作用，其中，A、a是菜豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)；B、b是茄子枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.Melongenae)；C、c是苹果干腐病菌(Botryosphaeria berengeriana)；D、d是梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)；E、e是棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)；

图3-1为不同碳源对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-2为不同氮源对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-3为不同无机盐对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-4为装液量对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-5为接种量对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-6为pH对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-7为发酵时间对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-8为转速对Ht-q6菌株产菌量的影响；

图3-9为培养温度对Ht-q6菌株产菌量的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

未木质化的枝干、叶和青皮果采自山西省农业科学院果树研究所核桃资源圃，核桃炭疽病菌(Gloeosporium fructigenum)由山西农业大学植物病理实验室提供，Tris、EDTA、溶菌酶、SDS、Tris饱和酚、2000bp DNA Marker、Agarose(琼脂糖)、EB(溴化乙锭)，由北京康为世纪生物科技有限公司制造，2×Es Taq Mastermix、Forward Primer、ReversePrimer由上海生工股份有限公司合成。

16Sr DNA序列分析及系统发育树构建网站和软件：

Blast在线分析软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)

Clustalw2在线分析软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)

Bioedit软件、PAUP软件、Treeview软件。

实施例1核桃内生菌的分离、筛选与鉴定

基础培养基：NA培养基：蛋白胨0.5g，牛肉膏0.3g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH7。NB培养液：NA培养基的液体培养基。LB培养基：胰蛋白胨10g，NaCl10g，酵母粉5g，水1000mL。PDA培养基：新鲜马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，蒸馏水100mL。PBA培养液：PDA培养基的液体培养基。

一、核桃内生菌株的分离

采用组织分离法，将从山西省农科院果树所核桃资源圃和山西农业大学植物园采集到的未木质化的枝干、叶和青皮果用自来水冲洗干净。按不同采集地点及不同采集部位分别称取3g，先用75％的酒精溶液表面消毒1-2min，再用次氯酸钠溶液消毒0.5-1min后，立即用无菌水漂洗5-6次。用已灭菌剪刀将茎、叶剪碎，青皮果取其果肉，分别置于灭菌的研磨中。在研磨中加入无菌水，适量灭菌石英砂，充分研磨至糊状。将上述研磨好的糊状液体倒入灭菌 的试管中，静置，此为原液。取1mL原液注入9mL无菌水中，依次梯度稀释。分别用移液枪取10^-4、10^-5、10^-63个浓度梯度的溶液100μL均匀涂布于NA平板上，每个梯度三次重复。同时，取最后一次冲洗的无菌水0.1mL均匀涂布于NA平板上，作为对照。28℃培养箱中倒置黑暗培养2-3天。观察并挑取外观形态特征不同的单菌落在相应NA平板上划线纯化，然后将纯化好的菌株转接至NA斜面上，4℃编号保存备用。

若对照NA平板上无菌落生长时，则表明材料表面消毒彻底，分离的菌株为内生菌。若有菌落生长，则表明消毒不彻底，重复本次操作，直至NA平板上无菌落长出。

二、核桃内生拮抗菌株的筛选

以核桃炭疽病菌(Gloeosporium fructigenum)为靶标菌，采用平板对峙培养法筛选拮抗菌株。取已培养5天的核桃炭疽菌，用直径6mm的打孔器在菌落边缘获取菌饼并置于PDA平板中央，然后在距中央20mm两侧点接已分离纯化的内生菌。对照只接核桃炭疽菌，每个处理重复3次。28℃倒置黑暗培养5d后，观察有无抑菌带产生并测量抑菌带的大小。将筛选出的抑菌带大的菌株一天转接一次，连续转接20次后，测定其对核桃炭疽菌的抑制效果的稳定性。

三、核桃内生拮抗菌株的鉴定

1.形态鉴定

观察NA平板上细菌菌落的大小、颜色、边缘形状以及菌落隆起形状和透明度；通过革兰氏染色和芽孢染色，在显微镜下观察菌体及芽孢的形态。

2.生理生化鉴定

测定生理生化指标的具体实验方法参照R.E.布坎南等《伯杰细菌鉴定手册》和东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》。

3.分子生物学鉴定

拮抗细菌菌株Ht-q6基因组DNA的提取：

(1)接种单菌落于3mL LB液体培养基中，200rpm，37℃，7小时即可。

(2)将培养好的菌液分装到3支1.5mL EP管中，1200rpm，离心5min，弃上清收集菌体。用400ul的TE缓冲液重悬后，3管和1管。

(3)将菌液悬于480ul TE缓冲液中(实际加180ul即可)，室温放置30min。

(4)加入200ul溶菌酶<50mg/mL>和1ul RNase A<20mg/mL>，于37℃水浴1h(或4-24h)，具体时间以菌体清亮为准。

(5)加入1/10体积的10％的SDS，3ul蛋白酶K(终浓度达0.1mg/mL)，55℃水浴2h 左右(也可过夜消化)，期间颠倒混匀离心管数次(用2个EP管夹紧颠倒)。

(6)冷却至室温，加入1/3体积的5mol/L的NaCl和与菌液等体积的Tris饱和酚，室温放置30min，期间轻柔颠倒离心管数次。

(7)1200rpm，离心5min。用截断的枪头转移上清至一新的离心管。

(8)加入与上清等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，1200rpm，离心5min，取上清，(枪头不用截断)。

(9)重复(8)一次。

(10)加入2倍上清体积的无水乙醇沉淀DNA，-20℃，20min，(若沉淀不明显，可延长冷却时间)。

(11)1200rpm，离心5min，弃上清，再加入500ul70％乙醇(洗涤沉淀DNA)，1200rpm，离心5min，弃上清，再1200rpm，离心30s(或用枪头吸净残留乙醇)。

(12)将离心管开盖置于37℃温箱干燥10-20分钟(或置于室温下几个小时)。

(13)将DNA溶于20ul TE缓冲液中。取1ul用紫外检测仪检测浓度及纯度，取5ul电泳。检测DNA完整性(A₂₆₀/A₂₈₀＝1.8-2.0为纯)。电泳Marker，1500-2000。

(14)其余置-20℃保存。

拮抗细菌菌株Ht-q6 16S rDNA的PCR扩展：

(1)16S rDNA PCR反应的正反向引物：Forward primer：5′AGA GTT TGA TCCTGGCTC AG3′；Reverse primer：5′CGG CTA CCT TGT TAC GAC3′

(2)PCR反应体系(uL)

(3)PCR反应程序：94℃预变性2min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)35个循环，72℃终延伸2min。PCR反应完成后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并将扩增产物送上海生物工程有限公司进行测序。

分析16S rDNA序列相似性及构建系统发育树：

用Blast软件将经上海生工测得的16S rDNA序列与GenBank数据库中已登录的16SrDNA序列进行相似性分析，运用Clustal在线分析软件、PAUP软件等，构建系统发育树。

四、结果

1.核桃内生细菌的分离和筛选结果

通过组织分离法从核桃茎、叶及青皮果中共分离到21株细菌，编号为Ht-q1～Ht-q21。通过平板对峙试验，从分离到的21株细菌中筛选出了4株对核桃炭疽菌有拮抗作用的菌株，分别为Ht-q5、Ht-q6、Ht-q7、Ht-q8。其中Ht-q6对核桃炭疽病菌的抑制作用最好，且连续转接20代后对核桃炭疽菌的抑制效果稳定。

2.核桃内生菌菌株Ht-q6的形态特征、生化特性及16S rDNA序列

从核桃青皮中分离筛选的内生菌株，命名为Ht-q6，在培养基上单菌落形态呈近圆形，乳黄色，不透明，边缘不整齐，表明褶皱(如图1-1)。革兰氏染色为G⁺，细胞呈杆状，大小约为3.1um×0.8um(图1-2)，有芽孢，芽孢卵圆形，中生或端生，稍膨大，初步鉴定为芽胞杆菌(Bacillus)。其生理生化特性见表1-1。

表1-1核桃内生菌菌株Ht-q6的生理生化特性

注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应

核桃内生菌菌株Ht-q6的基因组DNA及扩增产物(图1-3，图1-4)，扩增产物测序后得到长度为1457bp的16S rDNA序列。(用Blast软件将上述16S rDNA与GenBank数据库中已注册的16S rDNA序列进行同源相似性比较，同时构建系统发育树(图1-5)。结果表明，核桃内生拮抗菌株Ht-q6菌株与AB301022和NC009725这2个解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)处于同一个分支上，同源性高达99％以上。综合Ht-q6菌株的形态特征、 生理生化特性及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

核桃内生菌菌株Ht-q6的DNA序列如下：

ACAGTGGCGGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGACAGAGATT。

实施例2核桃内生菌株Ht-q6对核桃炭疽病菌的抑菌作用

核桃内生菌株：解淀粉芽胞杆菌Ht-q6，病原真菌：核桃炭疽病菌(G.fructigenum)。

培养基：NA、NB、PDA、PBA参照实施例1中的基础培养基；查彼培养液：NaNO₃2g，K₂HPO₄ 1g，KCl0.5g，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄ 0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

一、核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液的制备

取1mL-20℃保存的Ht-q6菌株转接到10mL/150mL的NB培养液中，28℃，170r·min^-1振荡培养过夜，即得种子液。按1mL的接种量将种子液转接到新的NB培养液中，28℃，170r·min-1振荡培养48h，即得发酵液。将发酵液于4℃冷冻高速离心机中，12000r·min^-1离心10min去沉淀，留上清液，用0.22um的微孔滤膜过滤除菌即得无菌滤液。

二、核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌分生孢子萌发的影响

核桃炭疽病菌孢子悬浮液的制备：在无菌条件下，取5mL含有定量洗衣粉的无菌水，注入已培养5-7d的病原菌斜面试管中，轻轻振荡，制成孢子悬浮液，并用无菌水稀释到40倍视野下30-40个孢子左右。

孢子萌发：将孢子悬浮液和已稀释好的无菌滤液按1∶1(V/V)混合，取30uL滴于凹玻片中央，25℃黑暗保湿培养6h后，显微镜下观察孢子萌发情况。重复5个玻片。对照为孢子悬浮液与无菌NB培养液的混合。

将无菌滤液按20、50、100、150、200倍的稀释比例与PBA培养液混匀后，倒平板，取100uL已配制好的孢子悬浮液置于平板上并均匀涂布。每处理3次重复。25℃黑暗保湿培养2h后，记录平板上病原菌菌落数，即孢子萌发数。

三、核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌菌丝生长的影响

取直径6mm的病原菌菌碟4块接入50mL/150mL查彼培养液中，25℃培养3d后，加入无菌滤液并使其终浓度为20、50、100、150、200倍，以不加无菌滤液为对照。每处理重复3次。待对照长满整个三角瓶底时，分别挑取对照和处理病原菌菌丝，光学显微镜下(16×40倍)观察Ht-q6菌株对病原菌菌丝形态的影响，并分别称量对照和每个处理病原菌菌丝的湿、干重。

四、核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌菌丝细胞膜的影响

将6mm的病原菌菌饼定量接入50mL/150mL查彼培养液中，25℃培养3d后，四层纱布过滤，离心收集菌体。用1％NaCl洗涤，离心，重复3次，再将菌体悬浮于1％NaCl溶液中，加入无菌滤液使其终浓度为20倍，对照不加无菌滤液。分别于25℃静置培养12，24h后取样，离心收集上清液。用紫外-风光光度计检测离心上清液在260nm和280nm处的吸光值， 判断菌丝细胞膜是否破裂。

五、核桃内生菌株Ht-q6抑菌谱的测定

具体方法可参考实施例1。

六、结果

1.核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽菌孢子萌发的影响

无菌滤液能够抑制核桃炭疽病菌孢子的萌发，且随稀释倍数的增多，抑制作用逐渐减弱(图2-1)。镜检发现，对照组孢子形成细长、均匀的芽管(图2-2a)，处理组孢子畸形(图2-2c-1)，芽管短，末端膨大(图2-2 c-2，3)。

2.核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽菌菌丝生长的影响

不同稀释倍数的无菌滤液处理的核桃炭疽菌菌丝的湿、干重均低于对照，且随稀释倍数的增加湿、干重增加(表2-1)。镜检发现对照组菌丝粗细均匀、生长正常(图2-3a)，产孢正常(图2-3b)，处理组菌丝畸形，粗细不均匀，形成囊泡(图2-3c)，产孢异常(图2-3d)。

表2-1菌株Ht-q6不同浓度无菌滤液对核桃炭疽菌菌丝生长的影响

3.核桃内生菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌菌丝细胞膜的影响

从表2-2可知，核桃炭疽病菌菌丝经Ht-p6无菌滤液处理12、24h后，其离心上清液在260nm和280nm处的吸光值高于对照。这说明，Ht-p6无菌滤液能使核桃炭疽病菌菌丝细胞膜受损或破裂，导致细胞膜透性增加，一些大分子物质外渗，从而在260nm和280nm出吸光值增高。

表2-2菌株Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌菌丝细胞膜的影响

4.核桃内生菌株Ht-q6的抑菌谱。

如表2-3核桃内生菌株Ht-q6对10种病原菌均表现出不同程度的抑制作用，对梨、苹果褐腐病菌及核桃炭疽病菌的抑菌圈直径达到10mm以上，具有广谱抑菌拮抗活性(图2-4)。

表2-3菌株Ht-q6的抑菌谱

注：表中数据表示平均数±标准差。

微生物能够抑制病原菌的生长或杀死病原菌，因为它能够产生可作用于病原菌细胞壁、细胞膜、能量代谢系统等的抑菌物质。初步研究发现，Ht-q6无菌滤液能够抑制核桃炭疽菌菌丝生长和孢子萌发，浓度越高，影响越大，浓度越低，影响越小。另外，显微镜下发现，无菌滤液使菌丝生长畸形，出现囊泡，产生异常孢子，；使孢子畸形，形成的芽管短且末端膨大。这与大多数人的研究结果相符。此外，经无菌滤液处理12、24h后的菌丝在260nm和280nm处的吸光值明显增高。综合上述研究结果可以推断，无菌滤液中含有抗菌活性物质，这些物质能够作用于病原菌菌丝细胞膜，使细胞膜受损或破裂，造成细胞内物质外渗。有关抗菌物质的性质及分子作用机理有待进一步研究。

实施例3拮抗菌株Ht-q6产代谢产物的发酵条件的优化

种子培养液：1％蛋白胨，1％葡萄糖，0.2％NaH₂PO₄·2H₂O，0.4％Na₂HPO₄·2H₂O，0.05％MgSO₄·7H₂O，100mL蒸馏水，pH7.0-7.2。

基础发酵培养液：1％蛋白胨，1％葡萄糖，0.2％NaH₂PO₄·2H₂O，0.4％Na₂HPO₄·2H₂O，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.02％CaCl₂，100mL蒸馏水，pH7.0-7.2。

拮抗菌株的活化使用NB培养液，核桃炭疽病菌的培养使用PDA培养基和PBA培养液。试剂：葡萄糖、D-果糖、酵母浸粉、绿豆粉、KCl、NaCl等。

一、种子液的制备

吸取1mL已活化的Ht-q6菌株接种于50mL/250mL种子培养液中，28℃，180r·min^-1恒温振荡培养16-24h。

二、活菌量的测定

采用平板菌量计数法计数，用无菌水将发酵液稀释到浓度约为3x10³cfu.mL^-1左右，取0.1mL涂布在NA平板上，24h后记录平板上菌落的数量。根据稀释的倍数计算原1mL发酵液中所含的活菌量。

三、对病原真菌抑菌活性的测

孢子悬浮液的制备：将已活化的核桃炭疽病菌接种到PBA培养液中，25℃，170r·min^-1振荡培养3-5天后，用灭菌的4层纱布过滤，并用无菌水稀释到每视野15个孢子左右的孢子悬液(16×40倍观察)。

发酵液的处理：将Ht-q6菌株的发酵液于高速冷冻离心机中4℃，12000r·min^-1离心10min去沉淀，留上清液。用0.22um的微孔滤膜过滤除菌即得无菌滤液。

抑菌活性的测定采用改良式平板扩散法：此平板两层，下层为10mLPDA培养基，上层为1mL孢子悬浮液+9mLPDA培养基的混合体。用6mm的打孔器在双层平板上打孔，然后在孔内注入40uL无菌滤液，对照为种子培养液。每处理重复3次。25℃静置培养2d后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。

四、发酵培养液的优化

分别以不同的碳源、氮源、无机盐替换基础发酵培养液中的碳源、氮源、无机盐，进行发酵试验。并以前一个试验确定的最适碳、氮源作为下一个试验的基础。以菌量及其抑菌活性为指标，确定最适碳源、氮源及无机盐。

五、正交试验

根据上述试验筛选出的最适碳源、氮源、无机盐，设计9处理(四因素三水平)的正交试验，以菌量及其抑菌活性为指标，确定培养液成分的最佳配方比例。

六、发酵条件的优化

以正交试验结果确定的最佳培养液为基础培养液，单因素改变装液量(30mL、50mL、75mL、100mL、150mL)、接种量(1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL、9mL)、培养液初始pH(pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9)、发酵时间(24h、48h、60h、72h、96h)、摇床转速(130、150、180、200)、培养温度(25℃、30℃、35℃、37℃、40℃)。以菌量及其抑菌活性为指标，确定其最佳发酵条件。

七、结果

1.发酵培养液的优化结果

(1)不同碳源的优化结果

由表3-1可以看出，用玉米粉做碳源时，抑菌圈直径最大，可达17.50mm。用半乳糖做碳源时，菌量最多，达1×10⁹cfu·mL^-1以上，玉米粉为碳源时的菌量高于除半乳糖之外的其他碳源(图3-1)。综合两种检测结果，再加上玉米粉成本比较低，适合大规模生产，因此选择玉米粉为最佳碳源。

表3-1不同碳源对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(2)不同氮源的优化结果

由表3-2可见，菌株Ht-q6对有机氮源的利用较无机氮源好，酵母浸、牛肉浸膏和蛋白胨为氮源时，抑菌圈直径差异不显著，但大于其它氮源。选择牛肉浸膏作为氮源时，菌量最 多，为4.00×10⁹cfu·mL^-1以上(图3-2)。综合两种检测结果，确定牛肉浸膏为最适氮源。

表3-2不同氮源对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(3)不同无机盐的优化结果

由表3-3可以看出，当发酵培养液的无机盐为K⁺和Fe²⁺时抑菌效果较好，抑菌圈直径可达26.50mm和25.00mm，但两者间差异不显著，Mg²⁺和Ca²⁺为无机盐时两者抑菌圈间无显著差异且仅次于K⁺和Fe²⁺。当发酵培养液的无机盐为Mg²⁺和Ca²⁺时，菌量较其它无机盐多，分别为4.00×10⁹cfu·mL^-1以上和5.00×10⁹cfu·mL^-1以上，K⁺为无机盐时菌量仅次于Mg²⁺和Ca²⁺(图3-3)。因此，选择Mg²⁺和K⁺为最适无机盐。

表3-3不同无机盐对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(4)正交试验优化结果

将通过上述试验确定的发酵培养液组分作为正交试验的四个因子，每个因子设计3个水平，进一步对培养液各组分的浓度进行优化。具体设计方案见表3-4。

试验结果表明(表3-4)，发酵培养液的四种组成成分对产抑菌活性物质的影响次序为牛肉浸膏＞玉米粉＞KCl＞MgSO₄·7H₂O，牛肉浸膏含量对产抑菌活性物质有显著的影响(P＜0.05)，玉米粉、KCl、MgSO₄·7H2O的含量对产抑菌活性物质的影响不显著(P＞0.05)，四种组成成分的含量对产抑菌活性物质的影响次序分别为A2＞A1＞A3，B2＞B1＞B3，C1＞C3＞C2，D2＞D3＞D1。综合上述结果，确定A2B2C1D2为最适产抑菌活性物质发酵培养液，即玉米粉1％、牛肉浸膏1％、MgSO₄·7H₂O、0.02％、KCl0.02％。

由表3-5可见，发酵培养液的四种组成成分对产菌量的影响没有显著差异，玉米粉、牛肉浸膏、MgSO₄·7H₂O、KCl的含量对产菌量的影响次序分别为A2＞A1＞A3，B1＞B2＞B3， C1＞C3＞C2，D1＞D3＞D2。综合以上结果，确定最适产菌量发酵培养液为A2B1C1D1，即玉米粉1％、牛肉浸膏0.5％、MgSO₄·7H₂O、0.02％、KCl0.01％。

表3-4培养基组成成分的正交试验设计方案及结果

A：玉米粉；B：牛肉浸膏；C：MgSO₄·7H₂O；D：KCl；K：均值；R：极差

表3-5培养基组成成分的正交试验设计方案及结果

A：玉米粉；B：牛肉浸膏；C：MgSO₄·7H₂O；D：KCl；K：均值；R：极差

2.发酵条件优化结果

(1)装液量的优化结果

由表3-6可以看出，随着装液量的增多或减少，各抑菌圈直径间没有显著的差异，这表明接种量对抑菌活性物质的产量影响不大。随着装液量的增多或减少，菌量会随之变化，当装液量为75mL/250mL时菌量最多(图3-4)。因为，芽胞杆菌的发酵过程对氧气的要求特别严格，或多或少都会影响其抑菌效果及菌量。所以，确定75mL/250mL为最适装液量。

表3-6装液量对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(2)接种量的优化结果

由表3-7可以看出，随着接种量的增加各抑菌圈直径之间没有显著的差异。这说明，接种量对抑菌活性物质的产量影响不大。接种量为4mL时，菌量相对其它接种量多(图3-5)。故选4mL为最适接种量。

表3-7接种量对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(3)初始pH的优化结果

由表3-8可以看出，当pH为5.0、6.0、7.0时，三者的抑菌圈直径之间没有显著的差异，且大于其它pH时的抑菌圈直径。这表明，中性偏酸性的环境适宜该菌株生长。pH为6.0时，菌量最多，在7.00×10¹⁰cfu·mL^-1以上(图3-6)。综合上述两种检测结果，选择pH6.0作为最适初始pH值。

表3-8pH对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(4)发酵时间的优化结果

结果表明(表3-9，图3-7)，菌株在24h时正处于生长时期，此后，随着时间的延长，菌体数量及其产抑菌物质的量逐渐增多，在48h达到最多。48h以后，菌株处于衰亡期，菌体数量越来越少，抑菌活性明显减弱。因此，要想得到高的菌量及较好的抑菌效果，应将该菌株发酵48h。

表3-9发酵时间对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(5)摇床转速的优化结果

由表3-10可见，在150r·min^-1、180r·min^-1、200r·min^-1，抑菌圈直径无显著差异，但高于130r·min^-1时的抑菌圈直径。随着转速的增加，菌量随之增加，在180r·min^-1时达到最多，200r·min^-1时开始下降(图3-8)。因为转速小，通气量小，不利于菌体生长；转速太快，会导致菌体自溶，使得菌量减少。因此，确定180r·min^-1为最适转速。

表3-10转速对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

(6)培养温度的优化结果

由表3-11可见，温度为30℃、35℃时的抑菌圈直径无显著差异，但显著大于其它温度时的抑菌圈直径。随着培养温度的不断升高，菌量先增多后减少，在30℃时，达到最多(图3-9)。因此确定30℃为最适培养温度。

表3-11培养温度对Ht-q6菌株产抑菌活性物质的影响

菌株的发酵是一个非常复杂的过程，受到多种因素的影响，其中发酵培养液及发酵条件是影响其产抑菌活性物质的两个重要的因素。因为在发酵的过程中，适合微生物生长的条件，并不一定适合所需抑菌物质的高产。本研究采用单因素实验和正交试验方法对Ht-q6菌株的最佳发酵培养液配方及最佳发酵条件进行优化，结果表明：其产抑菌活性物质最佳发酵培养液配方为1％玉米粉，1％牛肉浸膏，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，0.2％NaH₂PO4·2H₂O，0.4％Na₂HPO₄·2H₂O，100mL蒸馏水；其产菌量最佳发酵培养液配方为1％玉米粉，1％牛肉浸膏，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.02％KCl，0.2％NaH₂PO4·2H₂O，0.4％Na₂HPO₄·2H₂O，100mL蒸馏水；最佳培养条件为：接种量4mL，初始pH6.0，装瓶量75mL/250mL，培养温度30C，摇床转速180r·min^-1，培养时间48h。

Claims (4)

1.一株核桃内生菌，其特征在于，它为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ht-q6，该菌株已于2014年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9401。

2.权利要求1所述的核桃内生菌在制备用于防治病原菌的生防制剂中的应用，所述病原菌为核桃炭疽病菌、梨褐腐病菌、苹果褐腐病菌、茄子枯萎病菌、番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、梨黑斑病菌、苹果干腐病菌、西瓜炭疽病菌和菜豆菌核病菌。

3.权利要求1所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)将核桃内生菌Ht-q6转接至NB培养液中，于28℃、170r·min^-1下震荡培养24h；

2)将步骤1)培养的核桃内生菌Ht-q6转接至新的NB培养液中，于28℃、170r·min^-1下震荡培养48h；

3)将步骤2)培养的核桃内生菌Ht-q6进行离心，去沉淀，留上清液，得核桃内生菌Ht-q6无菌滤液；

4)用步骤3)所得核桃内生菌Ht-q6无菌滤液对核桃炭疽病菌进行抑制；

步骤1)和步骤2)中所述NB培养液为NA培养基的液体培养基，其中，NA培养基为：蛋白胨0.5g，牛肉膏0.3g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH为7。