CN102925386A

CN102925386A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疽病方面的应用

Info

Publication number: CN102925386A
Application number: CN2012104107526A
Authority: CN
Inventors: 牛赡光; 王清海; 刘幸红; 段春华
Original assignee: Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Ningbo Bio Leader Biotechnology Co ltd
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-10-24
Also published as: CN102925386B

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疽病方面的应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株SDF-005，保藏编号为CGMCC No.6672。该菌株或者用它制备的发酵液或者用它制备的菌剂可以用作生物农药，用于防治核桃炭疽病。实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌SDF-005具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其可湿性粉剂防治核桃炭疽病效果显著，防治效果达到78.22%，且核桃生长健壮，无药害产生。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疽病方面的应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其用途。

背景技术

炭疽病是危害核桃产业健康发展的重要病害之一。世界各核桃产区均有发生。主要危害果实、叶片、幼树、嫩梢和芽，潜伏期长、发病时间短、爆发性强，一般病果率达20~40%，严重者高达80%以上，落果率达50%以上。在收果前10~20d迅速使果实发黑变烂，严重影响核桃产量和品质，造成严重的经济损失。

对于该病的防治，国外根据种植区、种植目的不同使用药剂不同。苗圃和绿地以Banner MAXX、代森锰锌、波尔多液为主，人工林以多果定（Dodine）为主，多果定是目前唯一一个登记注册的可以用在可食坚果树上防治炭疽病的杀菌剂。国内防治炭疽病比较粗放，主要以退津特、甲基托布津、百菌清、波尔多液、仲丁胺、霉疫净为主。长期使用化学杀菌剂，导致病菌抗药性增强，只有加大用药剂量以控制病害，从而增加了生产成本和农药残留量。核桃一般种植在山区、丘陵，大多数是水分涵养区域，如果大量使用化学农药，极易污染土壤，水分，对城市及当地用水也是极大的风险。因此对核桃炭疽病进行生物防治是必然趋势。利用拮抗微生物防治核桃病害有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒及有效的新方法。拮抗微生物不仅可以防病，而且还能促进植物生长，对改善林地生态系统，保持林间生物多样性，以及维护林田生态平衡实现林业可持续发展将起到重要作用。全球生物农药的产量以每年10%-20%的速度递增。目前，全世界生物农药产品已经超过100多种，其中90%是微生物杀虫剂，微生物杀菌剂相对较少。尤其是利用解淀粉芽孢杆菌防治核桃炭疽病还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005，它可以用作生物农药，用来防治核桃炭疽病，具有良好的应用前景。

本发明的另一个目的是提供一种采用解淀粉芽孢杆菌SDF-005制备的发酵液和菌剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株SDF-005，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.6672。

本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌SDF-005，是从山东省济南市南部山区核桃林根际土壤中，采用稀释分离法分离获得的，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.6672。其具有以下微生物学特性：菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，平展，乳白色，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。该菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ-1所示，该菌株的atpA基因序列测定结果如SEQ-2所示。

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌SDF-005的培养方法或繁殖方法：普通培养采用NA培养基保存，实验室液体培养采用NYBD液体培养基。所述NA培养基配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水1000mL；NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。大量发酵培养配方（重量百分含量）：黄豆粉3.0%，玉米粉3.0%，轻质碳酸钙0.2%，氯化钠0.1%，其余为水，pH 7.5。

另一方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌SDF-005可湿性粉剂，它由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖0.5-60、淀粉0.5-30、羧甲基纤维素0.02-10、湿润剂10040.5-30、分散剂NNO 0.5-20，所述可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌SDF-005含量为0.1-100亿活菌/g。将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8%（质量百分含量），pH控制在7-7.5。

所述解淀粉芽孢杆菌SDF-005发酵液和菌粉通过包括以下步骤的方法制得：

（1）将保存的解淀粉芽孢杆菌SDF-005转移至NA试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养2-3d；

（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌SDF-005用无菌水以体积比1:10稀释，吸取1mL，置于NYBD液体培养基中，28℃摇床振荡培养1~2d得到种子液；

（3）按3.0%比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26℃，培养时间36h，通风比1：0.8。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达80亿/g。

（4）将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质（选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种）进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数可达220亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:8～10。

该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治核桃炭疽病。因此，又一方面，本发明提供解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者本发明的菌剂用于防治核桃炭疽病中的用途。

本发明还提供一种用于防治核桃炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的核桃施用解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者根据本发明的菌剂。

本发明还提供一种用于促进植物生长的方法，所述方法包括向植物施用解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者本发明的菌剂。

实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌SDF-005具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其可湿性粉剂防治核桃炭疽病效果显著，防治效果达到78.22%，且核桃生长健壮，无药害产生。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治核桃炭疽病中具有重要应用前景。

附图说明

图1为以16SrDNA序列为基础的SDF-005菌系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SDF-005（CGMCC No.6672）的分离与鉴定

1.分离：

本发明的解淀粉芽孢杆菌是从山东省济南市南部山区核桃林根际土壤中采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为：

（1）土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；

（2）培养基平板制备：将NA培养基（营养琼脂培养基）和PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；

（3）称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10^-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10^-7；

（4）取上述土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱26℃恒温培养5-7d。

（5）将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至26℃恒温培养。

（6）以核桃炭疽病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对核桃炭疽病菌具有较强抑制活性的菌株，编号SDF-005。

所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3；所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)200g，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。

2.菌株鉴定

（1）微生物学特性：SDF-005菌株杆状、具周生鞭毛，长为6-11μm，宽0.9-1.6μm，革兰氏染色阳性。菌株在NA和NB培养基上28℃培养48h后，菌落圆形，平展，呈乳白色，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘不整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现菌株好氧生长。

供试菌株SDF-005在所处理的各种温度下，均可正常生长；强酸、强碱环境不适宜该菌株生长，pH5～9条件下，菌株可以正常生长；NaCl浓度在2%～10%之间，菌株生长性状一致。氧化酶阳性，硝酸盐还原试验弱阳性，能利用柠檬酸盐，能产生尿素酶分解尿素，不产H₂S，VP试验阳性，能利用苦杏仁甘、ZT，其它特性见下表1：

表1SDF-005菌株的生理生化特性

（2）分子生物学特性：

16S rRNA基因序列测定结果（SEQ-1）：

TGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGAGCCAGCCGCCGAAGTGATCCC

atpA基因序列测定结果（SEQ-2）：

GTTGGCCGGTGAACTTGTTGAGTTTTCAAACGGCGTTTTGGGTATGGCTCAAAACCTTGAAGAATCCAACGTAGGTATCGTTATCTTAGGACCTTACAGAGA TATCCGTGAAGGTGATGAGGTCAAAAGAACGGGCCGCATCATGGAAGTTCCTGTAGGTGAAGAATTAATCGGACGTATCGTCGTCAACCCGCTCGGACAGCCGGTAGACGGACTGGGTCCGATTCTGACAAGCAAAACACGTCCGATCGAAAGCCAGGCTCCAGGCGTAATGGACCGTAAATCGGTACATAGACCGCTGCAAACGGGTATCAAAGCGATCGACGCGTTAATTCCGATCGGCCGCGGACAGCGTAGCTGATTATCGGTGACCGTCAGACAGGTAAAACATCTGTTGCGATTGATACAATCTTAAACCAAAAAGATCAAGACATGATCTGTGTGTACGTAGCGATCGGCCAGAAAGAATCTACAGTGCGCGGCGTAGTGGAAACACTTCGTAAGCATGGCGCGCTTGATTACACGATTGTCGTGACGGCGTCCGCTTCACAGCCGGCTCCGCTTCTGTACCTTGCACCGTATGCAGGGGTGACAATGGGTGAAGAATTCATGTACAACGGCAAGCACGTTCTCGTCGTATATGATGATTTATCCAAACAAGCGGCCGCTTACCGTGAGCTGTCATTGCTTCTTCGCCGTCCGCCGGGCCGTGAAGCATTCCTGGGGATGTATTCTATCTTCACTCCCGTCTGCTTGAGCGCGCAGCCAAGCTGAGTGACGCAAAAGGTGCAGGATCAATTACGGCGCTGCCGTTCGTCGAAACACAAGCAGGAGATATCTCCGCTTATATCCCGACAAACGTCATTTCCATTACTGACGGACAGATTTTCCTTCAATCTGACCTATTCTTCTCAGGCGTGCGTCCTGCGATAAATGCCGGATTATCCGTTTCCCGTGTCGGCGGATCAGCCCAAATCAAAGCGATGAAAAAGGTAGCGGGAACATTGCGTCTTGACCTGGCTTCATACCGTGAACTTGAAGCGTTCGCCCAATTCGATC

将SDF-005菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与B.amyloliquefaciens subsp.plantarum(CP000560)同源性为99.65%，结合SDF-005菌株的形态特征、生理生化特性，确定SDF-005属于解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens subsp.plantarum。以16SrDNA序列为基础的SDF-005菌系统发育树如图1所示。

此菌株已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.6672。

实施例2解淀粉芽孢杆菌SDF-005对核桃炭疽病室内效果验证

1.实验方法

采用平板对峙培养法，将供试的核桃炭疽病菌菌饼（9mm）移至平板中央，四周2cm处接种SDF-005菌株，置27℃生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。

2.结果

由表2可以看出，SDF-005对核桃炭疽病菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径为16.17mm，菌丝生长抑制率为82.04%。

表2.SDF-005对核桃炭疽病菌室内抑菌活性测定

Figure 2012104107526100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例3解淀粉芽孢杆菌SDF-005可湿性粉剂的制备

（1）将保存的解淀粉芽孢杆菌SDF-005转移至NA试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养2-3d。

（2）在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌SDF-005用无菌水按体积比1:10稀释，吸取1mL，至于NYBD液体培养基中，28℃摇床振荡培养1~2d得到种子液；

（3）按3.0%比例（体积比）将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度 26℃，初始pH7.5，装液量70%，培养时间36h，通风1：0.8。发酵完成后，得到发酵液菌数可达80亿/g。

（4）将解淀粉芽孢杆菌发酵液与膨润土按质量比1:9混合均匀，干燥；

（5）按质量比，干燥好的解淀粉芽孢杆菌菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖0.5-60、淀粉0.5-30、羧甲基纤维素0.02-10、湿润剂1004（山东邹平德兴精细化工有限公司生产）0.5-30、分散剂NNO0.5-20进行混合均匀，要求可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌SDF-005含量为15亿活菌/g；

（6）上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8%（质量百分含量），pH控制在7-7.5。

实施例4解淀粉芽孢杆菌SDF-005可湿性粉剂的作用验证

本实施例提供了解淀粉芽孢杆菌SDF-005可湿性粉剂针对核桃炭疽病的相关实验。

1.1供试药剂

本发明实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）(SDF-005)CGMCC No.6672可湿性粉剂；75%代森锰锌水分散粒剂（市售）。

1.2供试作物与防治对象：

供试作物为核桃，品种为香玲；

防治对象：炭疽病

1.3试验地情况

试验地设在山东省泰安市核桃种植园中，分别于2009年在泰安市核桃种植园进行林间防治核桃炭疽病试验。土壤为砂土地。核桃树为10年生香玲，株距3m×4m，树势中等偏弱，病害发生严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，核桃开花后3周用药，每隔15d施药1次，共计7次。

1.4试验设计及安排

本试验设计了15亿/g解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）(SDF-005)CGMCC No.6672可湿性粉剂400倍、600倍、800倍，75%代森锰锌水分散粒剂400倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区3棵核桃树。于2009年核桃开花后3周用药，每隔15d施药1次，共计7次。

1.5试验调查及计算方法

1.5.1药效调查、调查时间和次数

采收前5d调查，每个处理随机调查300个果实，计算病果率、防治效果，整个试验调查1次。

1.5.4药效计算方法

药效按式（1）、（2）计算：

2.结果

2.1供试药剂对核桃炭疽病的防治效果

表3结果显示，15亿/g解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）(SDF-005)CGMCC No.6672可湿性粉剂对核桃炭疽病有较好的防治效果，其中15亿/g解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）(SDF-005)CGMCC No.6672可湿性粉剂400倍、600倍防治效果最好，防治效果分别达78.22%、75.69%，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于800倍和75%代森锰锌的防治效果。

表315亿/g SDF-005可湿性粉剂防治核桃炭疽病田间药效试验结果

Figure 2012104107526100002DEST_PATH_IMAGE002

注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著（P<0.05）。

3.小结

从核桃病果率和防治效果来看，15亿/g解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）(SDF-005)CGMCC No.6672可湿性粉剂对核桃炭疽病具有较好的防治效果，稀释400倍后防治效果可达78.22%，明显好于对照药剂，差异显著。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株SDF-005，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.6672。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005在防治核桃炭疽病方面的用途。

3.一种包含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005的菌剂。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征是，所述菌剂为可湿性粉剂。

5.如权利要求4所述的菌剂，其特征是，所述可湿性粉剂由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖0.5-60、淀粉0.5-30、羧甲基纤维素0.02-10、湿润剂1004 0.5-30、分散剂NNO 0.5-20，所述可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌SDF-005含量为0.1-100亿活菌/g。

6.如权利要求5所述的菌剂，其特征是，所述解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉由下述方法制成，

（1）将解淀粉芽孢杆菌SDF-005转移至NA试管斜面中，置于培养箱26℃恒温培养2-3d；

（3）按3.0%的体积比将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26℃，培养时间36h，通风比1：0.8；所述大量发酵培养基按重量百分比计为：黄豆粉3.0%，玉米粉3.0%，轻质碳酸钙0.2%，氯化钠0.1%，其余为水，pH 7.5；

（4）将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质进行混合均匀，干燥；所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:8～10。

7.如权利要求6所述的菌剂，其特征是，所述NA培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水1000mL；所述NYBD培养基为：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。

8.如权利要求6所述的菌剂，其特征是，所述基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种。

9.权利要求3-8中任意一项所述的菌剂在防治核桃炭疽病方面的用途。

10.一种用于防治核桃炭疽病的方法，其特征是，向具有炭疽病的核桃施用权利要求1的解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者权利要求3-8中任意一项所述的菌剂。