CN106146194A - 一种抗重茬菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明抗重茬菌剂由地衣芽孢杆菌菌粉、细黄链霉菌粉、寡雄腐霉发酵物、绿色木霉菌粉、食用菌菌渣、复硝酚钠与α‑萘乙酸钠组成，它可以减轻作物重茬病害，对由重茬引起的青枯病、烟草花叶病等病害有很高的防效，同时还能预防根黑腐病、枯萎病、根结线虫病、立枯病等多种病害，有效降低烤烟黑胫病、根黑腐病和普通花叶病的发病率与病情指数；本发明的抗重茬菌剂能够促进烤烟早生快发，使生育期提前，提高烤烟株高和茎围，提高烤烟烟叶产量，改善烟叶外观质量。

Description

一种抗重茬菌剂

【技术领域】

本发明属于农用微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种抗重茬菌剂。

【背景技术】

随着种植制度不断改革，种植面积趋紧，重茬问题越来越成为生产中遇到的难题之一。重茬病是指在同一块地上连年种植同一种作物，发生的生理症状。重茬病主要原因是连年种植同一种作物，导致土壤中作物所偏好的营养元素缺失或失衡，前茬作物根系分泌物和残留物在分解过程中产生有毒物质对次年作物造成毒害和生长抑制，土壤中的病原微生物逐年积累，使土壤中病虫害逐步加重，从而导致农产品质量和种植效益下降，严重影响农户种植的积极性。例如，重茬病害具体表现为花生成片死亡、马铃薯烂死、洋葱烂死等；发育不良，瓜菜瘦弱，叶小皱缩，瓜果难座，果形奇丑，果实多病；大葱干尖，葱白瘦黑，叶色不正；果树早衰，烂枝流胶等。作物产量降低，施肥越来越多，投入越来越大，而产量却越来越低，水果减产20～40％，蔬菜减产30～50％，甚至超过50％，这些事实都令人触目惊心。

因此，人们对重茬问题进行了大量研究，取得一些重要成果。例如CN 102382810 A公开了一种预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法。该方法使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝雷丝孢酵母、淡紫拟青霉、细黄链霉菌、多粘芽孢杆菌和金龟子绿僵菌等生产菌种以及使用草炭制成益生菌菌剂。该益生菌菌剂解决了现有大棚蔬菜-黄瓜种植技术存在的重茬病等病害，有效防止在大棚蔬菜种植过程中出现的死苗、黄苗、枯萎、花叶、根腐等土壤生态病状，大棚黄瓜增产15～20％。CN 103789235 A明公开了一种抗重茬复合微生物菌剂生产方法，该生产方法使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌制备抗重茬复合微生物菌剂。CN 103898019 A公开一种抗重茬复合微生物菌剂，它由复合微生物菌剂、微量元素、碳酸钙与干燥剂组成；所述复合微生物菌剂是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种或两种以上复配物。CN 105601449 A公开一种黄瓜专用抗重茬复合剂，所述的复合剂由枯草芽孢杆菌固体菌剂、解淀粉芽孢杆菌固体菌剂、细黄链霉菌固体菌剂、微生物菌肥磷钾复合肥及微量元素添加剂制成，它改善了土壤微生物生态环境，为黄瓜生长提供了磷钾营养元素，促进了作物根系生长、降低了黄瓜的病害发生，有效地实现了黄瓜的增产。

目前阻碍抗重茬菌剂农业应用的瓶颈问题是，利用传统微生物发酵方法得到的微生物发酵菌剂活菌数偏低，功能单一，应用于农业生产中作用效果不明显。并且在菌剂生产过程中能耗较大，资源利用率较低。

本发明人针对这些技术缺陷，在总结现有技术的基础之上，通过大量实验研究与分析，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种抗重茬菌剂。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种抗重茬菌剂。

该抗重茬菌剂由0.5～1.5重量份地衣芽孢杆菌菌粉、3～7重量份细黄链霉菌粉、5～15重量份寡雄腐霉发酵物、5～15重量份绿色木霉菌粉、65～80重量份食用菌菌渣、0.1～0.3重量份复硝酚钠与0.05～0.20重量份α-萘乙酸钠组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的食用菌菌渣是平菇菌渣、香菇菌渣、金针菇菌渣或茶树菇菌渣。

根据本发明的另一种优选实施方式，寡雄腐霉发酵物是按照下述步骤制备得到的：

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比30～35:5～10:45～50:5～8:0.5～1.5:0.2～0.3:0.1～0.2进行混合，得到一种固体发酵物料；然后

按照以固体发酵物料重量计5～10％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度25～28℃的条件下进行固体发酵培养5～6d，然后机械翻拌、低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，固体发酵培养产物是在温度25～35℃的条件下进行低温烘干的。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的地衣芽孢杆菌菌粉活菌数≧200亿/g；细黄链霉菌粉活菌数≧10亿/g、绿色木霉菌粉活菌数≧10亿/g与寡雄腐霉发酵物≧10亿/g。

根据本发明的另一种优选实施方式，该抗重茬菌剂由0.8～1.2重量份地衣芽孢杆菌菌粉、4～6重量份细黄链霉菌粉、8～12重量份寡雄腐霉发酵物、8～12重量份绿色木霉菌粉、69～76重量份食用菌菌渣、0.14～0.26重量份复硝酚钠与0.08～0.18重量份α-萘乙酸钠组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，该抗重茬菌剂由1.0重量份地衣芽孢杆菌菌粉、5.0重量份细黄链霉菌粉、10.0重量份寡雄腐霉发酵物、10.0重量份绿色木霉菌粉、70～74重量份食用菌菌渣、0.18～0.22重量份复硝酚钠与0.10～0.16重量份α-萘乙酸钠组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，它的总有效活菌数≧2亿/g、纤维素酶活≧200U/g、蛋白酶活≧100U/g、含水量≦以重量计35％，pH值为5.5～8.5。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种抗重茬菌剂。

该抗重茬菌剂由0.5～1.5重量份地衣芽孢杆菌菌粉、3～7重量份细黄链霉菌粉、5～15重量份寡雄腐霉发酵物、5～15重量份绿色木霉菌粉、65～80重量份食用菌菌渣、0.1～0.3重量份复硝酚钠与0.05～0.20重量份α-萘乙酸钠组成。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。它能以芽孢形式存在，抵抗恶劣的环境。该细菌可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。它能产生抗菌活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌生长繁殖。

本发明使用的地衣芽孢杆菌菌粉是目前市场上销售的产品，例如由湖北绿天地生物科技有限公司、湖北启明生物工程有限公司、扬州市海诚生物技术有限公司、保定瑞谷生物科技有限公司销售的地衣芽孢杆菌菌粉，采用在后面详细具体描述的检测方法检测确定，所述的地衣芽孢杆菌菌粉活菌数≧200亿/g。

细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)是链霉菌属放线菌。它的代谢产物含有生长素、抗菌素、苯乙酸、琥珀酸及细胞分裂素等作物生长所必需的生长调节剂成分，它能转化土壤中的氮、磷、钾，提高土壤肥力，减少化肥用量，它能抑制病菌繁殖，防病保苗，刺激细胞分裂，促进作物生根、发芽、成熟，提高作物产量，促进有效物质合成，提高农产品品质等作用。

本发明使用的细黄链霉菌粉是目前市场上销售的产品，例如由青岛地恩地生物科技有限公司、保定瑞谷生物科技有限公司销售的细黄链霉菌粉，采用在后面具体描述的检测方法检测确定，所述的细黄链霉菌粉活菌数≧10亿/g。

绿色木霉(Trichoderma viride)在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，例如纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。绿色木霉是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性真菌病害。

本发明使用的绿色木霉菌粉是目前市场上销售的产品，例如由沂源康源生物科技有限公司、山东长泰生物科技有限公司、沂源翰林农业发展有限公司销售的绿色木霉粉，采用在后面详细具体描述的检测方法检测确定，所述的绿色木霉粉活菌数≧10亿/g。

当然，也可以根据现有技术文献，使用常规的培养基采用常规培养方法进行逐级培养制备得到所述的地衣芽孢杆菌菌粉、细黄链霉菌粉、绿色木霉菌粉。

寡雄腐霉(Pythium Oligandrum)是真菌的天敌，是自然界中存在的一种攻击性很强的寄生真菌，能在多种农作物根际定殖，不仅不会对作物产生致病作用，而且还能抑制或杀死其它致病真菌和土传病原菌，诱导植物产生防御反应，减少病原菌的入侵；同时，它的代谢产物及各种酶是植物的促生长活性剂，能促进作物根系发育，提高养分转化率。

本发明使用的寡雄腐霉发酵物是按照下述步骤制备得到的：

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g由北京比奥瑞生物科技有限公司或北京金久丰科技发展有限公司提供的寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在恒温培养箱中恒温培养3d；

所述的PDA培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它由200g马铃薯、20g葡萄糖、15～20g琼脂与1000毫升自来水配制而成的。

本发明使用的恒温培养箱是是目前市场上销售的产品，例如由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的产品。

C、种子培养

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

所述的CMA液体培养基制备方法如下：将200～300g玉米粉加入蒸馏水中，搅匀，文火煮沸1h，再用4层纱布过滤，然后加15～20g琼脂，加热溶化，加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min。

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比30～35:5～10:45～50:5～8:0.5～1.5:0.2～0.3:0.1～0.2进行混合，得到一种固体发酵物料；

在这个步骤中，固体发酵培养产物优选地是在温度25～35℃的条件下进行低温烘干的。

这个步骤使用的食用菌菌渣是平菇菌渣、香菇菌渣、金针菇菌渣或茶树菇菌渣。这个步骤使用的食用菌菌渣是经过剥去外层薄膜、粉碎预处理的80～100目食用菌菌渣。本发明使用的食用菌菌渣例如是来自三门峡富康食用菌专业合作社生产平菇得到的平菇菌渣；来自三门峡绿之源生物科技有限公司生产香菇得到的香菇菌渣、来三门峡绿之源生物科技有限公司生产金针菇得到的金针菇菌渣、来自三门峡绿之源生物科技有限公司生产茶树菇得到的茶树菇菌渣。

本发明使用的豆粕粉是豆粕豆粉或豆子豆粉，它们来自中粮黄海粮油工业(山东)有限公司生产大豆油得到的豆粕粉。

豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸的粒度通常是60～300目。本发明使用的麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸都是目前市场上销售的产品。

将食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸混合得到固体发酵物料所使用的设备是本技术领域里通常使用的混合设备，在此不再一一列举。

然后，按照以固体发酵物料重量计5～10％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度25～28℃的条件下进行固体发酵培养5～6d，然后机械翻拌、低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。采用在后面详细具体描述的检测方法检测确定，所述的寡雄腐霉发酵物的活菌数≧10亿/g。

在本发明的抗重茬菌剂中使用的食用菌菌渣，即食用菌废料，又被称作菌糠，是食用菌栽培后被食用菌菌丝利用后的植物残体，极难降解。我国每年产生至少400万吨菌渣，在全国各地农村，食用菌菌渣通常被随地丢弃或燃烧，由此产生的环境问题不容忽视。实际上，食用菌菌渣营养丰富，它的营养相当于通常麦麸、豆粕含有的营养。

在本发明的抗重茬菌剂中，食用菌菌渣的主要作用在于改善土壤肥力，提供植物营养，提高果蔬中叶绿素或可溶性糖的含量。

本发明使用的食用菌菌渣是平菇菌渣、香菇菌渣、金针菇菌渣或茶树菇菌渣。

所述的食用菌菌渣在使用前需要进行剥去外层薄膜、粉碎预处理，收集粒度80～100目的食用菌菌渣。

复硝酚钠是一种强力细胞赋活剂，它与作物接触后能迅速渗透到植物体内，促进细胞原生质流动，提高细胞活力，能加快作物生长速度，打破休眠，促进生长发育，防止落花落果，改善产品品质，提高产量，提高作物的抗病、抗虫、抗旱、抗涝、抗寒、抗盐碱、抗倒伏等抗逆能力。它广泛适用于粮食作物、经济作物、瓜果、蔬菜、果树、油料作物及花卉等。且具有高效、低毒、无残留、适用范围广、无副作用、使用浓度范围宽等优点。

在本发明中，复硝酚钠的主要作用在于促进作物生长发育，提高作物抗病、抗虫能力。本发明使用的复硝酚钠是目前市场上销售的产品，例如由郑州农达生化制品有限公司以商品名复硝酚钠原粉销售的产品。

α-萘乙酸钠是一种广谱、高效、低毒植物生长调理剂，它能迅速促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，具有调节生长、促进生根、抽芽、开花、防止落花落果、形成无核果实、促进早熟、增产等作用，同时也可增强植物的抗旱、抗寒、抗病、抗盐碱、抗干热风的能力。

在本发明中，α-萘乙酸钠的主要作用在于调节作物生长，促进生根、抽芽、开花。本发明使用的α-萘乙酸钠是目前市场上销售的产品，例如由郑州郑氏化工产品有限公司以商品名α-萘乙酸钠销售的产品。

在本发明的抗重茬菌剂中，其它组分的含量在所述范围内时，如果所述地衣芽孢杆菌菌粉的量小于0.5重量份，则不能在作物根际形成优势菌群；如果所述地衣芽孢杆菌菌粉的量大于1.5重量份，则不利于该抗重茬菌剂中其它种类微生物的生长繁殖；因此，所述地衣芽孢杆菌菌粉的量为0.5～1.5重量份是合理的，优选地是0.8～1.2重量份，更优选地是1.0重量份。

同样地，其它组分的含量在所述范围内时，如果所述细黄链霉菌粉的量小于3重量份，则不能充分发挥其代谢产物的促生作用；如果所述细黄链霉菌粉的量大于7重量份，则会造成其对土壤中营养物质转化过快，从而使作物出现缺素症；因此，所述细黄链霉菌粉的量为3～7重量份是适当的，优选地是4～6重量份，更优选地是5.0重量份。

其它组分的含量在所述范围内时，如果所述寡雄腐霉发酵物的量小于5重量份，则寡雄腐霉菌不能很好地在作物根际定殖；如果所述寡雄腐霉发酵物的量大于15重量份，则不能与绿色木霉以最佳比例复配，发挥最优抗病效果；因此，所述寡雄腐霉发酵物的量为5～15重量份是适当的，优选地是8～12重量份，更优选地是10.0重量份。

其它组分的含量在所述范围内时，如果所述绿色木霉菌粉的量小于5重量份，则绿色木霉菌不能很好地在作物根际定殖；如果所述绿色木霉菌粉的量大于15重量份，则不能与寡雄腐霉以最佳比例复配，发挥最优抗病效果；因此，所述绿色木霉菌粉的量为5～15重量份是适当的，优选地是8～12重量份，更优选地是10.0重量份。

其它组分的含量在所述范围内时，如果所述食用菌菌渣的量小于65重量份，则不利于抗重茬菌剂中微生物生长繁殖；如果所述食用菌菌渣的量大于80重量份，则会造成单位质量菌剂中有益微生物的比例减少；因此，所述食用菌菌渣的量为65～80重量份是可行的，优选地是69～76重量份，更优选地是70～74重量份。

其它组分的含量在所述范围内时，如果所述复硝酚钠的量小于0.1重量份，则不能有效地促进作物生长发育，提高作物抗病、抗虫能力；如果所述复硝酚钠的量大于0.3重量份，则会产生药害；因此，所述食用菌菌渣的量为0.1～0.3重量份是恰当的，优选地是0.14～0.26重量份，更优选地是0.18～0.22重量份。

其它组分的含量在所述范围内时，如果所述α-萘乙酸钠的量小于0.05重量份，则不能有效地调节作物生长，促进生根、抽芽、开花；如果所述α-萘乙酸钠的量大于0.20重量份，则会产生药害；因此，所述α-萘乙酸钠的量为0.05～0.20重量份是可行的，优选地是0.08～0.18重量份，更优选地是0.10～0.16重量份。

优选地，本发明抗重茬菌剂由0.8～1.2重量份地衣芽孢杆菌菌粉、4～6重量份细黄链霉菌粉、8～12重量份寡雄腐霉发酵物、8～12重量份绿色木霉菌粉、69～76重量份食用菌菌渣、0.14～0.26重量份复硝酚钠与0.08～0.18重量份α-萘乙酸钠组成。

更优选地，本发明抗重茬菌剂由1.0重量份地衣芽孢杆菌菌粉、5.0重量份细黄链霉菌粉、10.0重量份寡雄腐霉发酵物、10.0重量份绿色木霉菌粉、70～74重量份食用菌菌渣、0.18～0.22重量份复硝酚钠与0.10～0.16重量份α-萘乙酸钠组成。

采用在后面详细具体描述的检测方法检测确定，本发明抗重茬菌剂的总有效活菌数≧2亿/g。

根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准采用比色法测定本发明抗重茬菌剂的纤维素酶活≧200U/g。

根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准采用比色法方法测定本发明抗重茬菌剂的蛋白酶活≧100U/g。

根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准测定本发明抗重茬菌剂的含水量≦以重量计35％。

根据农用微生物菌剂(GB 20287-2006)标准测定本发明抗重茬菌剂的pH值为5.5～8.5。

在本发明中，将地衣芽孢杆菌菌粉、细黄链霉菌粉、寡雄腐霉发酵物、绿色木霉菌粉、食用菌菌渣、复硝酚钠与α-萘乙酸钠按照重量比0.5～1.5：3～7：5～15：5～15：65～80：0.1～0.3：0.05～0.20混合，得到本发明的抗重茬菌剂。

下面说明根据“农用微生物菌剂(GB 20287-2006)”标准检测地衣芽孢杆菌、绿色木霉、寡雄腐霉和细黄链霉菌活菌数的方法。

采用平板计数法，地衣芽孢杆菌使用营养琼脂培养基、绿色木霉和寡雄腐霉使用孟加拉红培养基、细黄链霉菌使用高氏一号培养基。

具体检测步骤如下：

I、系列稀释：称取10g样品，加到带玻璃珠的100mL无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上以转速200r/min充分振荡30min，得到母液菌悬液(基础液)。用无菌移液管分别吸取5.0mL母液菌悬液加到45mL无菌水中，按照体积比1:10进行系列稀释，分别得到1:1×10¹，1:1×10²，1:1×10³，1:1×10⁴……稀释的菌悬液。

II、加样及培养：每个样品取3个连续稀释度，用无菌移液管分别吸取0.1mL不同稀释度菌悬液，加到预先制备的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，地衣芽孢杆菌在温度37℃下、绿色木霉和寡雄腐霉在温度28℃下、细黄链霉菌在温度30℃下进行培养。

III、菌落识别：根据所检测寡雄腐霉菌，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。

菌落计数：以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准(丝状真菌为10～150个菌落数)，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数为20～300个时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。根据下式(1)计算有效活菌数：

$n_m=\stackrel{\‾}{x}{\mathrm{kv}}_1/\left(m_0{v}_2\right)\×{10}^{-8}\mathrm{...}\left(1\right)$

式中：

n_m—质量有效活菌数，亿/g

—菌落平均数，个

k—稀释倍数

v₂—菌悬液加入量，mL

m₀—样品量，g

本发明的抗重茬菌剂可以采用拌土的施用方法进行穴施、环施或沟施。本技术领域的技术人员可以根据实际生产情况确定本发明抗重茬菌剂的施用量及其施用方法，这对于本技术领域的技术人员而言不存在任何技术问题，是容易实现的。

[有益效果]

本发明的有益效果是：

本发明抗重茬菌剂可以减轻作物重茬病害，对由重茬引起的青枯病、烟草花叶病等病害有很高的防效，能预防根黑腐病、黑胫病、赤星病、枯萎病、黄萎病、根结线虫病、立枯病等多种病害，有效降低烤烟黑胫病、根黑腐病和普通花叶病的发病率与病情指数；可以降解农药残留，改善土壤团粒结构，提高作物抗寒、抗旱、耐盐碱等抗逆能力；同时高效转化土壤中N、P、K，提高土壤肥力，减少化肥用量。本发明的抗重茬菌剂能够促进烤烟早生快发，使生育期提前，提高烤烟株高和茎围，提高烤烟烟叶产量，改善烟叶外观质量。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

在本发明中，如无特别说明，用于说明浓度或比例的“％”均为重量百分比。

实施例1：本发明抗重茬菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

首先，制备寡雄腐霉发酵物

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g由北京比奥瑞生物科技有限公司提供的寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

采用常规方法将200g马铃薯、20g葡萄糖、15～20g琼脂与1000毫升自来水配制成PDA培养基。

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

将200～300g玉米粉加入蒸馏水中，搅匀，文火煮沸1h，再用4层纱布过滤，然后加15～20g琼脂，加热溶化，加水补充至1000mL，分装，在震荡培养摇床中在温度121℃下灭菌20min，得到CMA液体培养基。

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比30:8:50:5:1.5:0.2:0.1进行混合，得到一种固体发酵物料；

然后按照以固体发酵物料重量计8％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度25℃的条件下进行固体发酵培养6d，然后机械翻拌、在温度28℃的条件下低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

其次，剥去平菇菌渣外层薄膜，使用常见的粉碎机粉碎，收集粒度为80～100目的平菇菌渣。

然后，将湖北绿天地生物科技有限公司销售的地衣芽孢杆菌菌粉、青岛地恩地生物科技有限公司销售的细黄链霉菌粉、上述制备的寡雄腐霉发酵物、沂源康源生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的平菇菌渣食用菌菌渣、复硝酚钠与α-萘乙酸钠按照重量比0.5：3：8：5：65：0.18：0.05混合，得到本发明的抗重茬菌剂。

采用本说明书中描述的方法检测，本实施例制备的抗重茬菌剂的的总有效活菌数2.2亿/g、纤维素酶活268U/g、蛋白酶活132U/g。本发明抗重茬菌剂的含水量为以重量计30％，pH值为7.2。

实施例2：本发明抗重茬菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

首先，制备寡雄腐霉发酵物

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g由北京金久丰科技发展有限公司提供的寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

按照与实施例1相同的方式制备PDA培养基。

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

按照与实施例1相同的方式制备CMA培养基。

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比35:5:45:6:1.0:0.3:0.2进行混合，得到一种固体发酵物料；然后

按照以固体发酵物料重量计5％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度28℃的条件下进行固体发酵培养5d，然后机械翻拌、在温度25℃的条件下低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

按照与实施例1相同的方式预处理香菇菌渣。

然后，将湖北启明生物工程有限公司销售的地衣芽孢杆菌菌粉、保定瑞谷生物科技有限公司销售的细黄链霉菌粉、上述制备的寡雄腐霉发酵物、山东长泰生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的香菇菌渣食用菌菌渣、复硝酚钠与α-萘乙酸钠按照重量比0.8：7：12：8：80：0.22：0.20混合，得到本发明的抗重茬菌剂。

采用本说明书中描述的方法检测，本实施例制备的抗重茬菌剂的的总有效活菌数2.0亿/g、纤维素酶活200U/g、蛋白酶活100U/g。本发明抗重茬菌剂的含水量为以重量计25％，pH值为5.5。

实施例3：本发明抗重茬菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

首先，制备寡雄腐霉发酵物

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g由北京比奥瑞生物科技有限公司提供的寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

按照与实施例1相同的方式制备PDA培养基。

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

按照与实施例1相同的方式制备CMA培养基。

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比32:10:48:8:0.5:0.3:0.2进行混合，得到一种固体发酵物料；然后

按照以固体发酵物料重量计10％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度26℃的条件下进行固体发酵培养6d，然后机械翻拌、在温度35℃的条件下低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

按照与实施例1相同的方式预处理金针菇菌渣。

然后，将扬州市海诚生物技术有限公司销售的地衣芽孢杆菌菌粉、青岛地恩地生物科技有限公司销售的细黄链霉菌粉、上述制备的寡雄腐霉发酵物、沂源翰林农业发展有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的金针菇菌渣食用菌菌渣、复硝酚钠与α-萘乙酸钠按照重量比1.2：4：5：12：70：0.1：0.08混合，得到本发明的抗重茬菌剂。

采用本说明书中描述的方法检测，本实施例制备的抗重茬菌剂的的总有效活菌数2.8亿/g、纤维素酶活410U/g、蛋白酶活110U/g。本发明抗重茬菌剂的含水量为以重量计35％，pH值为8.5。

实施例4：本发明抗重茬菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

首先，制备寡雄腐霉发酵物

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g由北京金久丰科技发展有限公司提供的寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

按照与实施例1相同的方式制备PDA培养基。

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在由上海博迅实业有限公司医疗设备厂以商品名生化培养箱销售的恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

按照与实施例1相同的方式制备CMA培养基。

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在震荡培养摇床中在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比34:6:45:6:0.8:0.2:0.1进行混合，得到一种固体发酵物料；然后

按照以固体发酵物料重量计6％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度26℃的条件下进行固体发酵培养5d，然后机械翻拌、在温度30℃的条件下低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

按照与实施例1相同的方式预处理茶树菇菌渣。

然后，将保定瑞谷生物科技有限公司销售的地衣芽孢杆菌菌粉、保定瑞谷生物科技有限公司销售的细黄链霉菌粉、上述制备的寡雄腐霉发酵物、沂源康源生物科技有限公司销售的绿色木霉菌粉、上述预处理的茶树菇菌渣食用菌菌渣、复硝酚钠与α-萘乙酸钠按照重量比1.5：6：15：15：74：0.3：0.18混合，得到本发明的抗重茬菌剂。

采用本说明书中描述的方法检测，本实施例制备的抗重茬菌剂的的总有效活菌数3.1亿/g、纤维素酶活320U/g、蛋白酶活122U/g。本发明抗重茬菌剂的含水量为以重量计28％，pH值为6.4。

试验实施例1：烤烟抗重茬应用试验

试验品种：秦烟96；

试验时间：2015年5月10日移栽；始采时间2015年7月25日；

试验地点：河南省三门峡市陕县张茅乡。

处理组：大田种植烤烟重茬6年，按照每亩5kg本发明抗重茬菌剂，将本发明抗重茬菌剂拌土在烟苗移栽时进行穴施或环施，其它养护措施均按照当地优质烤烟生长技术规范执行。

对照组：大田与处理组的相同，种植烤烟重茬6年，不施用本发明抗重茬菌剂，其它养护措施均按照当地优质烤烟生长技术规范执行。

试验结果：不同处理对烤烟农艺性状影响试验结果列于表1中。

表1：不同处理对烤烟农艺性状的影响

由表1的结果可以看出，本发明的抗重茬菌剂能够促进烤烟早生快发，使生育期提前1-2d，提高烤烟株高和茎围。

不同处理对烤烟抗病性影响试验结果列于表2中。

表2：不同处理对烤烟抗病性的影响

表2的结果清楚表明，本发明抗重茬菌剂能有效降低烤烟黑胫病、根黑腐病和普通花叶病的发病率、降低病情指数。

不同处理对烤烟烟叶产值和经济性状影响试验结果列于表3中。

表3不同处理对烤烟烟叶的产值和经济性状的影响

处理	亩产量(kg)	亩产值(元)	均价(元/kg)	上等烟比例(％)
					对照(CK)	163.5	2871.06	17.56	15.1
处理	183.4	3567.13	19.45	36.7

表3的结果清楚表明，本发明抗重茬菌剂能够改善烟叶外观质量，提高烤烟烟叶产量7.4-19.9kg/亩，烟叶耐成熟和耐烤性良好，烤后烟叶多橘黄色，中上等烟叶比例大幅度提高，且可提高烤烟烟叶产值297.43-696.07元/亩，与对照相比差异显著。由此可见，施用所述抗重茬菌剂可以促进根系发育、提高土壤养分利用率，防止早衰，提高作物抗旱、抗病能力，从而增加产量提高质量。

本发明抗重茬菌剂不仅可以减少作物重茬病害，对由重茬引起的青枯病、烟草花叶病等病害有很高的防效，能预防根黑腐病、黑胫病、赤星病、枯萎病、黄萎病、根结线虫病、立枯病等多种病害；可以降解农药残留，改善土壤团粒结构，提高作物抗寒、抗旱、耐盐碱等抗逆能力；同时高效转化土壤中N、P、K，提高土壤肥力，减少化肥用量。

试验实施例2：抗重茬菌剂在甜瓜上的应用试验

试验品种：京蜜10号；

试验时间：2015年3月10日移栽；始采时间2015年4月15日；

试验地点：河南省三门峡市陕州区。

试验方法：本试验选春秋棚，种植甜瓜重茬3年，设2个处理和1个对照，3次重复，9个小区，随机区组排列，小区面积20m²，占地180m²。

处理1：按照每667m²施用4kg抗重茬菌剂，将本发明抗重茬菌剂拌土在甜瓜定植前穴施，其它养护措施均按照当地甜瓜种植技术规范执行。

处理2：按照每667m²施用4kg“中农绿康”牌抗重茬菌剂进行试验，在甜瓜定植前穴施，其它养护措施均按照当地甜瓜种植技术规范执行。

对照：不施用抗重茬菌剂，其它养护措施均按照当地甜瓜种植技术规范执行。

试验结果：

主要病害发生调查结果列于表4中。

表4：主要重茬病害发生调查表

处理	根腐病率(％)	枯萎病率(％)
			对照	28.5±0.49a	19.9±0.44a
处理1	3.8±0.21b	2.1±0.31b
			处理2	6.2±0.35c	4.8±0.38c

注:表中a、b、c表示在5％水平上差异显著。

表4的结果清楚说明，处理1和处理2均可在一定程度上减少发病率，提高作物产量，但处理1的作用效果更加明显。其中，处理1可有效防治甜瓜根腐病和枯萎病的发生，它的发病率比处理2分别减少2.4％和2.7％。

不同处理甜瓜产量及可溶性固形物含量试验结果列于表5中。

表5：不同处理甜瓜产量及可溶性

固形物含量试验结果

表5的结果清楚说明，处理1每667m²产量增加350.2kg，增产率为9.7％，比处理2每667m²产量多增加255.7kg；处理1可溶性固形物含量增1.2个百分点，增加率为11.6％，比处理2可溶性固形物含量多增加1个百分点。

由此可见，本发明的抗重茬菌无论是在抗病防病方面，还是增产提质方面均优于目前市场上现有“中农绿康”牌抗重茬菌剂。

根据Excel2007和DPS7.05对表5中列出的小区产量数据进行了统计分析，其结果列于6和表7中。

表6：小区产量方差分析表

F_区组间＝3.81<F_0.05区组间差异不显著；F_处理间＝53.84>F_0.01处理间差异极显著。

表7：LSD多重比较分析

P_LSD0.05＝2.91P_LSD0.01＝4.81

上述统计分析结果：在抗主要重茬病害方面，本发明产品与对照及处理2相比，差异极显著。在增产提质方面，本发明产品与处理2相比差异不显著，但与对照相比差异显著，由此说明，本发明产品与同类产品一样也具有一定增产提质的功效，且功效略优于同类产品，具体见表6和表7。

由此可见，本发明的抗重茬菌无论是在抗病防病方面，还是增产提质方面均优于目前市场上已有的“中农绿康”牌抗重茬菌剂。

Claims (8)

1.一种抗重茬菌剂，其特征在于该抗重茬菌剂由0.5～1.5重量份地衣芽孢杆菌菌粉、3～7重量份细黄链霉菌粉、5～15重量份寡雄腐霉发酵物、5～15重量份绿色木霉菌粉、65～80重量份食用菌菌渣、0.1～0.3重量份复硝酚钠与0.05～0.20重量份α-萘乙酸钠组成。

2.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于所述的食用菌菌渣是平菇菌渣、香菇菌渣、金针菇菌渣或茶树菇菌渣。

3.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于寡雄腐霉发酵物是按照下述步骤制备得到的：

A、制备CMA培养基

60g玉米粒在1000mL蒸馏水中煮沸90min，使用双层纱布进行过滤，再往得到的滤液中添加20g葡萄糖，接着加水补充至1000mL，分装，在温度121℃下灭菌20min，得到所述的CMA培养基；

将0.1g寡雄腐霉菌接种于200mL CMA液体培养基中，在温度28℃与转速180r/min的条件下进行震荡培养4d；

B、活化培养

使用无菌接种环从步骤A得到的培养液中挑取少量菌丝放入PDA培养基平板中，在温度28℃下在恒温培养箱中恒温培养3d；

C、种子培养

从步骤B的PDA培养基平板上挑取单个寡雄腐霉菌落孢子接种于CMA液体培养基中，在温度28℃与转速180r/min的条件下震荡培养2d；

D、发酵培养

食用菌菌渣、豆粕粉、麸皮、玉米粉、磷酸二氢钾与丙氨酸按照重量比30～35:5～10:45～50:5～8:0.5～1.5:0.2～0.3:0.1～0.2进行混合，得到一种固体发酵物料；

然后按照以固体发酵物料重量计5～10％的接种量，将步骤C得到的寡雄腐霉发酵液接入固体发酵物料中，在温度25～28℃的条件下进行固体发酵培养5～6d，然后机械翻拌、低温烘干与粉碎，得到所述的寡雄腐霉发酵物。

4.根据权利要求2所述的抗重茬菌剂，其特征在于在步骤D中，固体发酵培养产物是在温度25～35℃的条件下进行低温烘干的。

5.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于所述的地衣芽孢杆菌菌粉活菌数≧200亿/g；细黄链霉菌粉活菌数≧10亿/g、绿色木霉菌粉活菌数≧10亿/g与寡雄腐霉发酵物≧10亿/g。

6.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于该抗重茬菌剂由0.8～1.2重量份地衣芽孢杆菌菌粉、4～6重量份细黄链霉菌粉、8～12重量份寡雄腐霉发酵物、8～12重量份绿色木霉菌粉、69～76重量份食用菌菌渣、0.14～0.26重量份复硝酚钠与0.08～0.18重量份α-萘乙酸钠组成。

7.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于该抗重茬菌剂由1.0重量份地衣芽孢杆菌菌粉、5.0重量份细黄链霉菌粉、10.0重量份寡雄腐霉发酵物、10.0重量份绿色木霉菌粉、70～74重量份食用菌菌渣、0.18～0.22重量份复硝酚钠与0.10～0.16重量份α-萘乙酸钠组成。

8.根据权利要求1所述的抗重茬菌剂，其特征在于它的总有效活菌数≧2亿/g、纤维素酶活≧200U/g、蛋白酶活≧100U/g、蛋白酶活≧100U/g、含水量≦以重量计35％，pH值为5.5～8.5。