CN114437982B - 一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其在农业生产中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌筛选自贵州省遵义市山区的石灰性土壤，已于2020年6月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020164。该菌株具有很强的解磷、固氮、解钾功能，且能有效防治番茄、黄瓜等作物的根结线虫病害，有利于提高作物产量和品质，减少农药对环境的污染，应用前景广泛。

Description

一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
微生物菌肥是依据植物营养学原理、微生态学原理和“有机农业”的概念而研制出来的。它是以活性微生物的生命活动帮助农作物吸收养分的辅助性肥料。微生物菌肥是通过微生物生命活动及自身活动代谢产物使土壤增加养分，有效促进有机物分解，增强植物对土壤中微量元素的吸收，提高有机肥料的利用率，降解土壤中的重金属和农药残留物，减少对土壤的污染。
微生物菌肥按照作用机理可分为传统微生物菌肥和新型微生物功能菌肥。传统微生物菌肥，如固氮菌肥、解磷菌肥、解钾菌肥等；新型微生物功能菌肥，如细菌肥、放线菌肥、真菌类菌肥、际促生菌等。按照制品可分为单一微生物菌肥和复合微生物菌肥。按照使用的类型可以分为微生物菌肥和微生物菌剂，微生物菌肥主要是应用在大量种植的农田中，或是在小区种植区域与土搅拌混合使用，微生物菌剂主要是应用在农作物后期的追肥或者是对叶面喷施。
固氮菌肥主要可分为三类:共生固氮菌肥、自生固氮菌肥和联合固氮菌肥。共生固氮菌是一类在与其它生物共生时才能起到固氮作用的原核微生物。固氮菌遇到适合与其共生的豆科类植物根系时，会在植物根系周围大量的繁殖，同时产生使根毛尖端细胞壁软化的分泌物。根瘤菌是我国应用最广泛的一类共生固氮菌，根瘤菌与豆科类植物根部共生有专一性，对不同豆科类植物应选择对应的根瘤菌接种。自生固氮菌是通过自身自由活动固定大气中氮素的原核生物。自生固氮菌是一种中温型细菌，它能独立的将空气中的氮分子转化为有机态氮，稳定土壤中氮元素含量，为农作物生长时所需的氮素提供营养。同时，自生固氮菌在代谢时会产生维生素物质，可以促进农作物的生长。联合固氮菌是定殖于土壤中植物根系的一类细菌，这类细菌依靠植物根系分泌物生存及繁殖，宿主植物不形成分化结构。联合固氮菌肥主要与农作物中的粮食作物共生，不同的地区和气候条件对农作物中的水稻、小麦和玉米都有不同程度的增产作用。
磷细菌肥料是一种将土壤中无效磷转化为有效磷的微生物制剂。磷元素是农作物生长的必需矿物质元素，也是土壤液中溶解度很小的一种矿物质元素,它对农作物的生长具有重要作用。Belimov等发现，磷细菌与固氮菌混合可以平衡农作物的营养吸收，加强对氮和磷的吸收，提高农作物的产量。
钾细菌肥料又称硅酸盐菌剂，主要成分是硅酸盐细菌。钾细菌肥料施入土壤后，能够迅速从土壤中分解出硅酸钾盐类的一类细菌，将矿物质中难以溶解的钾转化为可被作物吸收的一类芽孢细菌，同时还可以将矿物质中的磷分解为有效态磷，供植物吸收利用。
枯草芽孢杆菌肥料主要分布在土壤和腐蚀后的有机物中，属于需氧型细菌，其生长速度快，营养需求少，能高效分解蛋白质及代谢产物。王立国等用侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌制备的微生物有机肥，可提高农产品质量、改良土壤结构、提高化肥利用率，减少病虫危害、提高单位面积产量。
放线菌主要分布在土壤中的微生物类群中，由于其能够产生胞外水解酶，降解土壤中部分不溶或难溶的有机物质，为作物细胞的新陈代谢提供营养，其可以矿化有机物。因此，放线菌对改良土壤、净化环境、促进自然界物质之间良性循环起着重要作用。早期用于农业的抗生素是链球菌产生的链霉素和土霉素，主要是对果树和蔬菜起到防治病害的作用，在果蔬种植中取得了比较好的效果。
微生物菌肥对农作物没有毒副作用、对环境不会产生污染、前期成本投入低、对农作物的益处客观，可以弥补化肥所带来的缺点和不足。因此，适时、适量的对农作物施用微生物菌肥可以促进生态环境良性循环，对推进农作物健康生长和增加产量的可持续发展有积极重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其在农业生产中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌具有很强的解磷、固氮、解钾功能，且能有效防治番茄、黄瓜等作物的根结线虫病害，有利于提高作物产量和品质，减少农药对环境的污染，应用前景广泛。
本发明一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌LLH-A3(Bacillus amyloliquefaciensLLH-A3)，已于2020年6月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020164。
本发明一方面提供了所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3在制备生物肥中的应用。
本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3在植物病害防治中的应用。
所述植物病害为根结线虫病、根腐病或枯萎病。
本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3。
所述微生物制剂还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、植物乳杆菌、哈茨木霉、淡紫拟青霉、沼泽红假单胞菌、乳酸菌、泾阳链霉菌、白浅灰链霉菌、克鲁斯假丝酵母、菌根真菌、棕色固氮菌、光合细菌、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉中的任意一种或两种或多种的组合。
所述微生物制剂中解淀粉芽孢杆菌LLH-A3的活菌量至少为109CFU/g。
本发明还提供了上述微生物制剂在制备生物肥中的应用。
本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。
所述植物病害为根结线虫病、根腐病或枯萎病。
所述植物病害为番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病、柑橘根结线虫病、葡萄根结线虫病、甜瓜根结线虫病、番茄枯萎病、黄瓜根腐病中的任意一种。
有益效果
本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3具有很强的解磷、固氮和解钾能力，能有效提高土壤肥力。该菌株在难溶性无机磷固体培养基中培养，所得发酵液中有效磷含量高达779mg/L，解磷效率达78％；与对照菌褐球固氮菌相比，在第2、3、5天时解淀粉芽孢杆菌LLH-A3的固氮量分别提高了19.4％、23.8％、17.4％；解淀粉芽孢杆菌LLH-A3在钾长石液体培养基中培养，所得发酵液中钾含量达到44.1mg/L，解钾效果显著。
所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3还能高效分泌吲哚乙酸，有利于促进作物生长。该菌株在DF培养基和DF+培养基中吲哚乙酸的产量分别达到45.21±0.27mg/L和84.33±0.22mg/L，取得了意料不到的技术效果。
所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能显著提高土壤肥力，改善土壤团粒结构，更有利于保水、保温，进而促进作物生长，显著增加产量。与对照组相比，施用解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉的处理组小麦产量普遍提高24.0％-37.7％；而且处理组土壤中有机质含量增加，土壤总孔隙度和毛管孔隙度均得到明显提高，取得了意料不到的技术效果。
所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能高效杀灭根结线虫的幼虫，显著抑制根结线虫虫卵的发育，可广泛应用于农作物根结线虫病害的生物防治。解淀粉芽孢杆菌LLH-A3发酵上清液16倍稀释液处理48h后，根结线虫的死亡率能达到100％，对虫卵的孵化抑制率为100％。
所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能有效防治线虫病害，促进植物生长，效果显著。番茄盆栽实验结果显示，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对番茄根结线虫病的防治效率高达78.4％，与化学农药噻唑膦的防治效果基本相当。田间黄瓜实验结果显示，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉对黄瓜根结线虫病的防治效率高达73.2％，虽然略低于化学农药处理组，但解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉处理后黄瓜的株高和地上部分植株鲜重明显高于化学农药处理组，病死株率也明显降低，取得了意料不到的技术效果。解淀粉芽孢杆菌LLH-A3还能有效防治柑橘、葡萄、花生、甜瓜等作物的根结线虫病害。尤其对于感染根结线虫的柑橘和葡萄植株，通过环穴灌根处理，能有效杀灭根结线虫，改善植株长势，当年产量普遍提高15％以上，果实糖含量提高22％以上，糖酸比提高，品质得到显著提升。
此外，大田实验结果表明，所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3还能有效防治黄瓜根腐病和番茄枯萎病，防治效率分别达到68.1％和65.5％。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3可单独，或与其他芽孢杆菌、固氮菌、光合细菌、解磷菌、链霉菌等进行组合，用于提高土壤肥力，促进作物生长，促生增产效果达到18％以上。该菌株可广泛应用于农业领域，而且对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
实施例中使用的培养基配方如下：
难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g,KC1 0.3g，MgSO4·7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)2 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)
PDA平板：去皮土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；
NA培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，葡萄糖2g/L，琼脂15g/L，pH7.0；
NB培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0；
DF培养基：蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，蒸馏水1000mL，pH 9.0；
DF+培养基：蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，0.50g/L色氨酸，蒸馏水1000mL，pH 9.0。
实施例1解磷微生物的分离与筛选
1、样品采集自贵州省遵义市山区的石灰性土壤。
2、土壤稀释液的制备：
称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：106-107的土壤稀释溶液。
3、初筛
取0.1ml土壤稀释溶液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g,KC1 0.3g，MgSO4·7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)2 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)上，30℃培养箱中倒置培养3天，观察培养基上长出的菌落，确定每个菌落周围是否有透明圈产生。
结果显示，难溶性无机磷固体培养基上共有18个菌落周围有明显的透明圈产生，将其分别命名为AH1，AH2，AH3，……，AH18。
4、复筛
将初筛得到的18株菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养3天后，分别测量菌落周围透明圈的大小。结果显示：初筛菌株中透明圈最大的三株菌分别为AH5，AH12，AH14。
将AH5、AH12、AH14三株菌分别接种到50mL难溶性无机磷液体培养基中，30℃，200rpm，培养5天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组；分别检测发酵液中的活菌数量。具体结果见表1。
表1复筛菌株发酵液中活菌含量
5、复筛菌株发酵液中有效磷含量的测定
依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。
在无菌条件下分别取AH5、AH12、AH14三株菌的上述发酵液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表2。
表2复筛菌株发酵液中有效磷含量
样品 有效磷含量(mg/L)
空白对照组 0
AH5 261
AH12 779
AH14 102
从表2中的数据可知，本发明复筛得到的三株菌中AH12菌株的解磷能力最强，其发酵液中有效磷含量高达779mg/L，解磷效率达78％，效果非常显著。
实施例2菌株鉴定
1、菌落形态鉴定
将AH12菌株接于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃恒温培养2天，观察菌落形态。
结果如图1所示，AH12菌株的菌落呈乳白色，近圆形，不透明，有隆起，表面粗糙，边缘不规则，不产色素；革兰氏染色呈阳性；显微镜下观察，AH12菌株呈杆状，产芽孢，芽孢呈椭圆形，局部呈圆形；孢子囊不膨胀。
2、16s rDNA鉴定
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作提取AH12菌株的基因组DNA，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增。
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
胶回收PCR扩增产物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果显示AH12菌株的16srDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，其与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的相似性最高。
SEQ ID NO:1如下所示：
atacatgcaagtcgagcggacaggtgggagattgctccctgatgttaggggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaccggctcaccaaggcgacgatgcggccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgagggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgagcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaaatgaggctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccggctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccaccggtcacacccggagagtttggaacaacggaagttggtgagggaaccttccaggagccagccgccgaccgcc。
结合AH12菌株的菌落形态特征和16srDNA比对结果，申请人确认AH12菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌LLH-A3(Bacillusamyloliquefaciens LLH-A3)。
申请人已于2020年6月1日将上述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3(Bacillusamyloliquefaciens LLH-A3)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020164。
实施例3解淀粉芽孢杆菌LLH-A3固氮能力测定
1、氮标准曲线绘制：
(1)配制氮的含量为1mg/mL的硫酸铵溶液；
(2)分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL溶液于100mL容量瓶，定容，即为氮标准液。
(3)取标准液各1.0mL于15mL刻度试管中，每管加水1.0mL，加奈氏试剂4.0mL，摇匀，水浴加热15min，冷却后于420nm处测定吸光值。
根据不同浓度含氮标准溶液吸光值可得氮标准曲线。
2、固氮效果分析
将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3和对照菌株褐球固氮菌分别接种到固氮菌液体培养基中，同时做不接菌空白对照，30℃，200r/min摇瓶培养分别在第2、3、5天取菌液。
分别吸取上述待测菌液1.0ml于50ml消化管中，加3mL硫酸，0.1g催化剂和5d双氧水消煮至清亮，冷却后加少许蒸馏水，摇匀，滴加400g/L氢氧化钠至出现沉淀，加25％酒石酸钾钠溶液去除沉淀，摇匀。过滤，吸取滤液5.0mL于15ml刻度试管中，加0.5mL氢氧化钠，0.5mL酒石酸钾钠，1.5mL奈氏试剂，摇匀，显色2～3min，于420nm处测定吸光值。计算氮含量，具体结果见表3。
W(氮含量，g/50ml)＝(x×100×50)/(V×1000)。
其中：x—标准曲线上查出的样品含氮量(μg/ml)；
V—吸取固氮液体积(ml)。
表3解淀粉芽孢杆菌LLH-A3的固氮效果分析
从表3的数据可知，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3具有较强的固氮能力。与对照菌相比，在第2、3、5天时解淀粉芽孢杆菌LLH-A3的固氮量分别提高了19.4％、23.8％、17.4％，取得了意料不到的技术效果。
实施例4解淀粉芽孢杆菌LLH-A3解钾能力测定
将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌悬液以3％的接种量接入钾长石液体培养基中，30℃摇床震荡培养72h，同时做三个平行，并设置无接种对照组。
从每个摇瓶中各取发酵液20mL，4℃、5000r/min离心15min；将全部离心上清液放入50mL消煮管中；加入5mL浓硫酸与2mL的过氧化氢溶液在消煮炉消煮，并反复加几次20％过氧化氢溶液，至粘性物质完全消化后，用蒸馏水定容至50mL。使用火焰光度计测定其中K+含量。
结果显示，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3发酵液中钾含量达到44.1mg/L，具有较强的解钾能力。
实施例5解淀粉芽孢杆菌LLH-A3产吲哚乙酸(IAA)能力检测
吲哚乙酸(IAA)是一种广泛存在的植物激素，具有刺激植物生长的作用，可以促进植株抽芽及幼苗生长，刺激根系生长发育，对于植物生长调节有重要作用。
本发明通过Salkowkin比色法测定解淀粉芽孢杆菌LLH-A3发酵液中IAA的含量。
1、将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3接种于50mL LB液体培养基中，35℃摇床震荡培养24h，得到活化后的种子液。
2、将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3种子液按2％的接种量分别接种于DF培养基(蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，蒸馏水1000mL，pH 9.0)和DF+培养基(蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，0.50g/L色氨酸，蒸馏水1000mL，pH 9.0)中，30℃，200rpm摇瓶培养5天；5天后，将发酵液在4℃、12000rpm条件下离心5min，用Salkowkin比色法测定发酵液中吲哚乙酸IAA的含量。
检测结果显示：解淀粉芽孢杆菌LLH-A3在DF培养基和DF+培养基中吲哚乙酸的产量分别达到45.21±0.27mg/L和84.33±0.22mg/L。从而说明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3具有较强的吲哚乙酸分泌能力，有利于促进作物生长，取得了意料不到的技术效果。
实施例6解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对小麦增产的效果实验
1、菌粉制备
将活化后的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3在3吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵；5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量约为2.5×109CFU/g的菌粉。
2、小麦种植实验
实验时间：2019年10月～2020年6月；
试验地点：山东省青岛市平度崔家集镇；
试验小麦品种：山农27号；
供试验土壤：棕壤土，肥力中等，偏碱。
选取20m×30m的区域作为一个实验区，共设置15个实验区，且每个实验区之间保持1米的间隔。每个处理组随机选择5个实验区进行实验。
播前处理：正常整地，浅耕，统一机播，平均行距20～24cm。播量25斤/亩，按常规施底肥。
2020年3月中旬对返青小麦追肥时进行如下处理：
(1)空白对照组：清水浇施小麦根部；
(2)菌粉处理组：将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉随水浇施于小麦的根部，间隔15天用一次，连续使用三次。其中：
处理组1：菌粉用量为2.0kg/亩；
处理组2：菌粉用量为4.0kg/亩。
在小麦成熟期，统一进行收割、脱粒和晾晒，统计各实验区小麦的产量，计算小麦的平均产量，并采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量，利用环刀法计算土壤总孔隙度和土壤毛管孔隙度，结果如表4所示。
表4解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对小麦产量和土壤结构的影响
从表4的实验数据可以看出，与对照组相比，施用本发明所述解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉的处理组小麦产量普遍提高24.0％-37.7％；而且处理组土壤中有机质含量增加，土壤总孔隙度和毛管孔隙度均得到明显提高。从而说明，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能显著提高土壤肥力，改善土壤团粒结构，更有利于保水、保温，进而促进小麦生长，显著增加产量，取得了意料不到的技术效果。
实施例7解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对根结线虫的杀灭效果实验
将解淀粉芽孢杆菌LLH-A3接种于50mL LB液体培养基中，35℃摇床震荡培养24h，将发酵液在4℃、5000r/min条件下离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜除菌，得无菌上清液。
实验组设置5种处理液，分别为无菌上清液的原液、2倍稀释液、4倍稀释液、8倍稀释液、16倍稀释液；对照组为无菌水。
1、解淀粉芽孢杆菌LLH-A3无菌上清液对根结线虫幼虫的杀灭效果
在无菌的24孔细胞培养板中，实验组每孔加1mL上述制备的处理液，对照组加等量的无菌水，每孔挑入30条北方根结线虫的2龄幼虫，置于30℃恒温环境中分别培养24h和48h后，统计每孔中死亡的线虫数量(统计前在各孔中分别滴加1mol/L NaOH溶液，刺激假死线虫复苏，如果线虫仍然僵直不动，则记录为死亡)，计算根结线虫的死亡率。具体结果见表5。
死亡率(％)＝(对照组生存率-实验组生存率)/对照组生存率×100％。
表5解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对根结线虫的杀灭效果
处理组 24h线虫死亡率 48h线虫死亡率
LLH-A3上清液原液 100％ 100％
2倍稀释液 100％ 100％
4倍稀释液 100％ 100％
8倍稀释液 100％ 100％
16倍稀释液 89％ 100％
从表5的数据可以看出，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3无菌上清液原液、2倍、4倍、8倍稀释液处理24h后，根结线虫的死亡率均达到100％；解淀粉芽孢杆菌LLH-A3无菌上清液16倍稀释液处理48h后，根结线虫的死亡率也能达到100％。从而说明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对根结线虫的幼虫具有很强的杀灭效果。
2、解淀粉芽孢杆菌LLH-A3无菌上清液对根结线虫虫卵孵化率的影响
挑取一定数量的雌、雄根结线虫成虫于培养皿中，加适量清水，放置在25℃恒温培养箱中培养。待线虫产出大量卵时，将培养皿中的线虫挑出。在无菌24孔细胞培养板中每孔加入0.5mL线虫虫卵。
实验组每孔加1mL上述制备的处理液，对照组加等量的无菌水，25℃恒温保湿培养，每个处理3个重复。分别在处理24h和48h时，在倒置显微镜下观察线虫虫卵的孵化情况，并统计孵化率。具体结果见表6。
孵化率(％)＝[孵化出的幼虫数/(孵化出的幼虫数+未孵化的卵粒数)]×100％。
表6解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对根结线虫虫卵孵化率的影响
从表6的数据可以看出，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3无菌上清液对根结线虫虫卵的孵化具有极强的抑制作用，稀释16倍后仍能完全抑制虫卵的孵化，而对照无菌水中的虫卵孵化率高达89.1％，抑制效果非常显著。
上述实验结果表明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能高效杀灭根结线虫的幼虫，显著抑制根结线虫虫卵的发育，可广泛应用于农作物根结线虫病害的生物防治。
实施例8解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对盆栽番茄根结线虫的防治效果
盆栽试验在温室中进行，供试作物为番茄，盆栽用土为番茄根结线虫重病田的土壤，花盆直径25cm。
试验设三个处理，其中：
(1)对照组：移栽前不作任何处理；
(2)化学农药处理组：移栽前混土撒施0.3g/盆的10％噻唑膦颗粒剂；
(3)菌液处理组：移栽前每盆灌施50mL解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌液(109CFU/mL)。
选择两叶一心、无线虫侵染的健康番茄苗分别移栽于塑料盆中，每盆1株，每个处理组30株。将盆栽置于20-25℃温室中培养，3d左右浇一次水，根据土壤干湿程度可适当调整，土壤湿度不超过50％。培养45d后，扣盆取根调查统计根结数量。根结严重度分0～10级，利用DPS v7.5(Data Processing System)软件采用Duncan氏新复极差法统计分析各处理组的根结指数和相对防效，具体结果见表7。
根结分级标准：
0级：根部未发现根结；
1级：通过仔细辨认能够发现少量根结；
2级：主根无根结，须根有少量根结能够清晰辨别；
3级：主根无根结，须根上能发现稍大的根结；
4级：主根无根结，须根上以较大根结为主；
5级：50％的根被侵染，主根极少量侵染；
6级：主根上发现根结；
7级：主根大部分被根结侵染；
8级：所有主根被侵染/极少根未侵染；
9级：所有根能被严重侵染/通常植株死亡；
10级：所有根被严重侵染，无根。
根结指数和相对防效计算如下：
根结指数＝[∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100；
相对防效(％)＝(对照组根结指数-处理组根结指数)/对照组根结指数×100％。
表7解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对盆栽番茄根结线虫的防治效果
实验分组 根结指数 相对防效
对照组 70.3 -
化学农药处理组 14.6 79.2％
LLH-A3菌液处理组 15.2 78.4％
从表7的数据可知，与对照组相比，化学农药处理组和解淀粉芽孢杆菌LLH-A3处理组盆栽中番茄的根结指数均明显降低，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对番茄根结线虫病的防治效率高达78.4％，与化学农药噻唑膦的防治效果基本相当。从而说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能有效防治线虫病害，促进植物生长，效果显著。
实施例9解淀粉芽孢杆菌LLH-A3对田间黄瓜根结线虫病的防治效果实验
1、实验地点：
青岛市平度田庄镇黄瓜种植大棚。黄瓜、大蒜轮作，连续种植多年，黄瓜根结线虫病比较严重。
2、实验设计
本实验共三个处理组，每个处理组10垄黄瓜，共1000株，每个处理组之间设立保护行；
(1)对照组：移栽时不作任何处理；
(2)化学农药处理组：使用阿维菌素2000倍稀释液在黄瓜移栽时作灌根处理，黄瓜定植后覆土，阿维菌素使用量：2kg/亩；
(3)菌粉处理组：作底施处理，在黄瓜移栽前开沟施入，解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉(2.5×109CFU/g)使用量：6kg/亩，施用后浇水处理。
滴灌，常规田间管理，移栽后1个月取样调查黄瓜生长情况，统计根结指数，评价防治效果。收获前根据植株地上部生长情况调查统计病死株率。利用DPS v7.5(DataProcessing System)软件采用Duncan氏新复极差法进行统计分析，具体结果见表8。
表8解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌对黄瓜生长影响和根结线虫病的防治效果
从表8的数据可以看出，与对照组相比，化学农药处理组和解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉处理组的黄瓜长势更好，黄瓜病死株率和根结指数显著下降；解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉对黄瓜根结线虫病的防治效率高达73.2％，虽然略低于化学农药处理组，但解淀粉芽孢杆菌LLH-A3菌粉处理后的黄瓜株高和地上部分植株鲜重明显高于化学农药处理组，病死株率也明显降低。从而说明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3能显著促进黄瓜生长，有效防治根结线虫病害，减少死棵发生，取得了意料不到的技术效果。
除了番茄、黄瓜外，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3还能有效防治柑橘、葡萄、花生、甜瓜等作物的根结线虫病害。尤其对于感染根结线虫的柑橘和葡萄植株，通过环穴灌根处理，能有效杀灭根结线虫，改善植株长势，当年产量普遍提高15％以上，果实糖含量提高22％以上，糖酸比提高，品质得到显著提升。
此外，大田实验结果表明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3还能有效防治黄瓜根腐病、番茄枯萎病，防治效率分别达到68.1％和65.5％。
综上所述，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌LLH-A3可单独作为植物病害的生防菌剂、生物肥等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、固氮菌、光合细菌、解磷菌、链霉菌等进行组合，用于提高土壤肥力，促进作物生长，促生增产效果达到18％以上，效果显著，应用前景广阔。
序列表
<110> 青岛力力惠生物科技股份有限公司
<120> 一种提高土壤肥效的解淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
atacatgcaa gtcgagcgga caggtgggag attgctccct gatgttaggg gcggacgggt 60
gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat 120
accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta 180
cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtacc ggctcaccaa ggcgacgatg 240
cggccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300
ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgagggagca acgccgcgtg 360
agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa 420
atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gagcgtaaag ggctcgcagg 540
cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg 600
gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag 660
atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaaatgagg ctgaggagcg 720
aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 780
ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccggct 840
ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900
gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga 960
caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag 1080
ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca 1200
gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg 1260
atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccaccgg tcacacccgg agagtttgga 1380
acaacggaag ttggtgaggg aaccttccag gagccagccg ccgaccgcc 1429

Claims (7)

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2020164。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备生物肥中的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述的植物病害为番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病、柑橘根结线虫病、葡萄根结线虫病、甜瓜根结线虫病、番茄枯萎病、黄瓜根腐病中的任意一种。
4.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中解淀粉芽孢杆菌的活菌量至少为109 CFU/g。
6.权利要求4或5所述的微生物制剂在制备生物肥中的应用。
7.权利要求4或5所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述的植物病害为番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病、柑橘根结线虫病、葡萄根结线虫病、甜瓜根结线虫病、番茄枯萎病、黄瓜根腐病中的任意一种。
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