CN116555127B - 一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用。一种微生物复合菌剂，由维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌组成。通过将上述菌种混合即可得到降解有机磷农药的微生物复合菌剂，利用解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌通过磷元素的募集效应对有机磷农药进行招募，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌之间进行优势互补，协同发挥作用，实现对有机磷农药的降解以及水质的改善。

Description

一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及水体修复领域，具体涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
水资源作为必不可少的可再生资源，近年来由于工业、农业、生活废水的排放造成了严重的水体污染，尤其是化肥、农药的大量使用和滥用，成为农业水污染现象的主要源头。
乙酰甲胺磷（Acephate）又名高灭磷、菜康宝、虫立清或杀虫灵，化学名称为O，S-二甲基-N-乙酰基硫代磷酰胺，是一种低毒类内吸性杀虫剂。乙酰甲胺磷由于其极为有效的植物病虫害防治的优势而被广泛使用，乙酰甲胺磷的过量施用引起的残留，不仅会通过各种途径危害环境安全，而且其对神经毒性的危害和致癌性会直接损害人体和动物体的生命健康。目前，乙酰甲胺磷的去除主要利用电化学催化技术，但该方法依赖于电极性能，且目前仍停留于试验阶段，研究者尝试采用竹炭颗粒吸附乙酰甲胺磷，吸收量最高只能达到0.21mg/mL/d，吸附率最高只能达到82.3%，吸附法吸附效果不佳，且可持续性较差，应用场景也极为受限。
目前，微生物法治理已经受到越来越多的研究者的青睐，开发了许多经济高效的新型微生物污水净化法，为修复水域污染提供了重要参考。微生物投入使用不会增加水体负担，能够提升水质，净化水体，恢复水质，对生态环境友好。现有技术通常采用单一菌株处理乙酰甲胺磷，存在降解效率低且降解率不高的问题，因此，亟需开发一种普适性高、成本低、降解率高、再生性强的微生物复合菌剂，用于降解乙酰甲胺磷等有机磷农药，实现对污染水体的修复。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术对乙酰甲胺磷降解率低的缺陷，从而提供一种微生物复合菌剂，利用该微生物复合菌剂制得的水体净化材料能够在宽泛的环境条件中实现对有机磷农药特别是乙酰甲胺磷的高效降解，稳定性和可持续性好，生产成本较低，适于大规模的投产应用。
本发明提供一种微生物复合菌剂，由维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）、里拉微球菌（Micrococcus lylae）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、以及地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）组成。
维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的质量比为1-3：4-5：2-3：2-5：2-5。
优选的，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的质量比为1：5：2：2：2。该比例复合得到的微生物复合菌剂能够在72h内将100-3000mg/L浓度的乙酰甲胺磷完全降解。
本发明提供一种水体净化材料，包括上述所述的微生物复合菌剂。
所述水体净化材料还包括包埋剂，所述包埋剂由海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙组成，海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙的质量比为2-5:3-8:2-6:2-4。优选的，所述海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙的质量比为2:6:3:2。优选质量比的包埋剂能够更有效包裹微生物复合菌剂。
本发明提供一种水体净化材料的制备方法，包括如下步骤：S1，将维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌剂按照一定质量比进行混合并溶解，制备为复合菌悬液，各菌株的菌剂菌活为6×1012-7×1012CFU/mL；S2，将海藻酸钠和聚乙烯醇溶解于灭菌水中，加入活性炭和步骤S1制备的复合菌悬液，搅拌均匀，之后再缓慢加入氯化钙饱和水溶液，钙化，成型为颗粒，洗涤。
所述步骤S1中，各菌株的菌剂的制备方法包括如下步骤，分别将各菌株活化，扩大培养后再进行发酵培养，待发酵液的OD600值大于等于0.8且稳定后停止发酵，得到各菌株的菌液为各菌的菌剂；或者，将上述制得的各菌株的菌液离心，干燥，得到各菌株的菌粉为各菌的菌剂；
可选的，各菌株的扩大培养条件为温度28-30℃，转速100-200 rpm，时间1-2天；
可选的，各菌株的发酵培养的条件为温度28-30℃，转速200-220rpm，培养基pH为6.8-7.1，培养时间72-78h；
可选的，干燥的温度为25-30℃；
可选的，所述菌粉的含水量不超过3wt%；
可选的，所述钙化处理为，将加入氯化钙饱和水溶液后的混合体系缓慢搅拌至少10h；步骤S2中所述成型颗粒的步骤为，将完成钙化后的混合体系缓慢倾倒至微生物固定化制粒器中，制备得到粒径为2-3mm的球形颗粒。
本发明提供的微生物复合菌剂和水体净化材料应用于降解有机磷农药，当所述有机磷农药的浓度为2500mg/L~4000mg/L时，所述水体净化材料的添加量为10 g/L -40 g/L，反应时间为至少72h；所述有机磷农药为乙酰甲胺磷。
本发明提供的微生物复合菌剂和水体净化材料应用于污染水体修复的方式为生物修复。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的微生物复合菌剂，由维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）、里拉微球菌（Micrococcus lylae）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）组成。本发明利用地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的聚磷、溶磷的能力，将含磷化合物招募至微生物复合菌剂附近，同时快速矿化有机磷农药中的营养物质，再利用维罗纳假单胞菌、里拉微球菌和嗜麦芽寡养单胞菌的相互作用，优势互补，协同增效，实现对有机磷农药的高效降解；并且本发明的微生物复合菌剂中各菌株之间相互无抑制影响，能够快速形成优势菌群，可以同时分解不同有机物、降解水中的氨基氮和硝基氮、降低水体中磷素浓度以及抑制藻类和有害菌的生长，达到修复污染水体的目的。
2.本发明提供的水体净化材料，包括本发明提供的微生物复合菌剂，因此水体净化材料也具有上述优点。进一步地，本发明的水体净化材料还包括包埋剂，所述包埋剂包括海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙。通过将包埋剂与微生物复合菌剂进行结合，所形成的材料不仅具有较高生物活性，而且不易崩解，性能稳定性强，能够长期存储，适宜进行大批量、规模化生产和应用，同时，固化的微生物复合菌剂（即水体净化材料）在去除水体中的有机磷农药时，可以通过快速方法快速和规模化移除，不会对水体造成二次环境污染。
本发明提供的水体净化材料能够实现对有机磷农药尤其是乙酰甲胺磷的降解，在72小时的处理时间内对浓度为2500mg/L的乙酰甲胺磷的降解率能够达到99.9%；当乙酰甲胺磷的浓度在3000mg/L时，加入的水体净化材料的质量浓度在10 g/L -40 g/L，反应72h即能够将水溶液中的乙酰甲胺磷全部降解，这显著高于目前本领域已知的任何菌剂或吸附法对乙酰甲胺磷的降解率。
3.本发明提供的水体净化材料的制备方法，包括，制备含有维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的复合菌悬液，将海藻酸钠和聚乙烯醇溶解于灭菌水中，加入活性炭和复合菌悬液，搅拌均匀，之后再缓慢加入氯化钙饱和水溶液，钙化，成型为颗粒，洗涤后即得水体净化材料。本发明的制备方法简便，能够制得性能稳定、能长期保存且具有较高活性的固化的微生物复合菌剂（即水体净化材料）。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例1制备的水体净化材料在1000倍数下的微观结构图；
图1b为本发明实施例1制备的水体净化材料的在40000倍数下的微观结构图；
图2是本发明实施例1、3、4和对比例8制备的水体净化材料在不同处理时间下对乙酰甲胺磷的去除率。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例和对比例中所使用的菌株都是现有的，维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）的保藏编号为CCTCC NO：M209313；里拉微球菌（Micrococcus lylae）的保藏编号为CCTCC NO:M2019339；嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的保藏编号为CCTCC NO:M20191025；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的保藏编号为CCTCC NO：M2020164；地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）的保藏编号为CCTCC NO：M2011423。
本发明实施例和对比例中所使用的海藻酸钠（纯度>99%）、聚乙烯醇（纯度>99%）、活性炭（纯度>99%）、无水氯化钙（纯度>99%）均购于 Solarbio公司，为固体粉末或颗粒状。
本发明实施例和对比例中所用的微生物固定化制粒器为实验室自制，具体参考CN102505011A公开的加压式装置对完成钙化后的混合体系进行制粒。
LB培养基的制备方法为，将胰蛋白栋 1%，氯化钠 1%，酵母提取物 0.5%，其余为水，混合，调节pH为 7.0，在121℃灭菌 20min。
扩大培养基的制备方法为，将胰蛋白栋 3 g/L，乙酸钠2.1g/L，K2HPO420mg/L，NH4Cl 80.0 mg/L，MgSO432 .4mg/L，CaCl220.12 mg /L，HEPES 3.5 g/L，微量元素液0.2%，其余为水，混合，调节pH为 7.0-7.4，在121℃灭菌 20min。
微生物复合菌培养基的制备方法为，将乙酸钠2.6 g/L，柠檬酸三钠1.5 g/L，NH4Cl 0.9 g/L，NaNO30.50g/L，K2HPO450mg/L，KH2PO480mg/L，MgSO40.72 g/L，NaCl 0.3 g/L，CaCl20.05g/L，FeSO4·7H2O 0.06g/L，CuSO4·5H2O4g/L，微量元素1.5 m L/L，其余为水，混合，调节pH为 7.0-7.2，在121℃灭菌 20min。
取维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在LB 固体培养基上分别两两交叉划线，并做好标记，倒置于 30℃恒温培养箱中培养20 h 后，观察菌落生长情况，判断菌株是否有拮抗现象发生，结果发现各菌株均长势良好；
采用LB培养基分别将维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌活化，1d后，在无菌条件下，移取各菌株的种子液悬浮液分别接种于装有扩大培养基的灭菌锥形瓶中，并置于30 ℃震荡培养箱中120 rpm 培养2d，收集各管中的培养物，分别取50mL各菌株的培养物混合于微生物复合菌培养基中进行培养得到混合菌群，于3d内进行3-5次镜检观察和分类学鉴定，测得混合菌群具有最大的生物活力CFU在8.4×1011~3.2×1012CFU/mL，可知，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌5种菌可以共存，没有竞争排斥。
实施例1
本实施例提供一种水体净化材料的制备方法，具体步骤和参数如下：
分别取活化后的维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌10mL接种于90 mL LB培养基的250 mL灭菌锥形瓶中，并置于30 ℃震荡培养箱中120 rpm 培养2d，得到各菌株扩大培养产物；
取各菌株的扩大培养产物在28-30℃和pH6.8-7.1条件下于微生物复合菌培养基的发酵罐中分别培养，其中，里拉微球菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在72h时停止发酵，维罗纳假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌在78h停止发酵，对各菌株的菌液离心，收集各菌株的菌泥放入不锈钢盘中，送入冷冻干燥机进行干燥处理，产品最后阶段的干燥温度控制于25-30℃之间，稳压保持1h后取出，冷冻干燥至水分在3%以下，获得各菌株相应的固态菌粉，各菌株的菌活为6~7×1012CFU/mL；
取维罗纳假单胞菌菌粉10g，里拉微球菌菌粉50g，嗜麦芽寡养单胞菌菌粉20g，解淀粉芽孢杆菌菌粉20g，地衣芽孢杆菌菌粉20g，混合，得到复合菌剂；
取上述制备的复合菌剂12g注入50mL水中，重悬制成菌悬液，取25g海藻酸钠，15g聚乙烯醇，注入500mL的灭菌水中形成第一混合液，杯口封膜后于80℃水浴锅水浴2h，而后取出冷却至室温，将菌悬液和10g的活性炭加入第一混合液中，缓慢搅拌形成第二混合液，混合均匀后用5mL 注射器将20g的CaCl2饱和水溶液缓慢加入第二混合液，搅拌，钙化10h，将混合体系的溶液缓慢倾倒至微生物固定化制粒器中将其制备成球形颗粒，取出于10×PBS 缓冲液中洗涤，用滤纸吸干表面水分，即为水体净化材料，置于4℃冰箱中储存备用。
本实施例制得的水体净化材料的扫描电镜SEM结果如图1a和图1b所示，图1a和1b分别显示了在1000倍和40000倍的倍数下水体净化材料的微观结构，可见这些复合菌颗粒为球形结构，表面均匀多孔，这些孔状结构形成了不同大小的微室，从而为菌群的生长和繁殖提供了空间。
实施例2
本实施例提供一种水体净化材料的制备方法，具体步骤和参数如下：
分别取活化后的维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌10mL接种于90 mL LB培养基的250 mL灭菌锥形瓶中，并置于30 ℃震荡培养箱中120 rpm 培养2d，得到各菌株扩大培养产物；
取各菌株的扩大培养产物在28-30℃和pH6.8-7.1条件下于微生物复合菌培养基的发酵罐中分别培养，里拉微球菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在72h时停止发酵，维罗纳假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌在78h停止发酵，所得各菌株的菌活为6~7×1012CFU/mL；
取维罗纳假单胞菌菌液10g，里拉微球菌菌液50g，嗜麦芽寡养单胞菌菌液20g，解淀粉芽孢杆菌菌液20g，地衣芽孢杆菌菌液20g，混合，得复合菌悬液；
取10g海藻酸钠和30g聚乙烯醇，注入500mL的灭菌水中形成第一混合液，杯口封膜后于80℃水浴锅水浴2h进行溶解，而后取出冷却至室温，将上述制备的复合菌悬液50g和15g的活性炭加入第一混合液中，缓慢搅拌形成第二混合液，用5mL 注射器将10g的CaCl2饱和水溶液缓慢加入第二混合液中，搅拌，钙化10h后，将所得混合体系缓慢倾倒至微生物固定化制粒器中制备成球形颗粒，取出并于10×PBS 缓冲液中洗涤，用滤纸吸干表面水分，即得水体净化材料，置于4℃冰箱中储存备用。
实施例3
本实施例提供的水体净化材料的制备方法基本与实施例1相同，唯一不同之处在于，维罗纳假单胞菌菌粉、里拉微球菌菌粉、嗜麦芽寡养单胞菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉与地衣芽孢杆菌菌粉的质量比为2：4：3：2：2。
实施例4
本实施例提供的水体净化材料的制备方法基本与实施例1相同，唯一不同之处在于，其中，维罗纳假单胞菌菌粉、里拉微球菌菌粉、嗜麦芽寡养单胞菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉与地衣芽孢杆菌菌粉的质量比为3：5：3：5：5。
实施例5
本实施例提供一种水体净化材料的制备方法，具体步骤和参数如下：
分别取活化后的维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌10mL接种于90 mL LB培养基的250 mL灭菌锥形瓶中，并置于30 ℃震荡培养箱中120 rpm 培养2d，得到各菌种扩大培养产物；
取各菌种扩大培养产物分别于在28-30℃和pH6.8-7.1条件下于微生物复合菌培养基的发酵罐中分别培养，里拉微球菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在72h时停止发酵，维罗纳假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌在78h停止发酵，对各菌种的菌液离心，然后收集各菌菌泥放入不锈钢盘，送入冷冻干燥机进行干燥处理，产品最后阶段的干燥温度控制于25-30℃之间，稳压保持1h后取出，冷冻干燥至水分在3%以下，获得各菌种相应的固态菌粉，各菌种的菌活为6~7×1012CFU/mL；
取维罗纳假单胞菌菌粉10g，里拉微球菌菌粉50g，嗜麦芽寡养单胞菌菌粉20g，解淀粉芽孢杆菌菌粉20g，地衣芽孢杆菌菌粉20g，混合，得到复合菌剂；
取上述制备的复合菌剂12g注入50mL水中，重悬制成菌悬液，取25g海藻酸钠，40g聚乙烯醇，注入500mL的灭菌水中形成第一混合液，杯口封膜后于80℃水浴锅水浴2h进行溶解，而后取出冷却至室温，将菌悬液和30g的活性炭加入第一混合液，缓慢搅拌形成第二混合液，混合均匀后用5mL 注射器将15g的CaCl2饱和溶液缓慢加入第二混合液，搅拌，固化10h，将混合体系的溶液缓慢倾倒至微生物固定化制粒器中将其制备成均匀的球形颗粒，取出于10×PBS 缓冲液中洗涤，用滤纸吸干表面水分，即为水体净化材料，置于4℃冰箱中储存备用。
对比例1
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由维罗纳假单胞菌，里拉微球菌组成，其中，维罗纳假单胞菌与里拉微球菌的质量比为1:5（复合菌剂总量为120g）。
对比例2
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌组成，其中，解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的质量比为1:1（复合菌剂总量为120g）。
对比例3
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由维罗纳假单胞菌、里拉微球菌和嗜麦芽寡养单胞菌组成，其中，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌与嗜麦芽寡养单胞菌的质量比为1：5：2（复合菌剂总量为120g）。
对比例4
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌和解淀粉芽孢杆菌组成，其中，里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌与解淀粉芽孢杆菌质量比为5∶2∶2（复合菌剂总量为120g）。
对比例5
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌和解淀粉芽孢杆菌组成，其中，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌与解淀粉芽孢杆菌质量比为1∶5∶2∶2（复合菌剂总量为120g）。
对比例6
本对比例提供一种水体净化材料的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由维罗纳假单胞菌，嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中，维罗纳假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的质量比为1∶2∶2∶2（复合菌剂总量为120g）。
对比例7
本对比例提供一种微生物复合菌剂的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，微生物复合菌剂由里拉微球菌，嗜麦芽寡养单胞菌，解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌组成，其中，里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌质量比为5∶2∶2∶2（复合菌剂总量为120g）。
对比例8
本对比例提供一种微生物复合菌剂的制备方法，具体制备方法与实施例1相同，唯一不同之处在于，不包括钙化的步骤。
实验例1
分别准确称取上述实施例1、3、4和对比例1-7制备得到的水体净化材料20g，每个对比例和实施例设置3组平行实验。
为保证实验结果的可重复性，本实验采用人工配制的含有乙酰甲胺磷(Acephate)的水溶液，即自制污染水。从江西抚州市金溪县某农田沟渠中抽取富长水华的污水样品，污水样品中组成成分和含量如下：
CH4N2O（250mg/L）、碳酸氢铵（100mg/L）、淀粉（120mg/L）、K2HPO4·3H2O（90mg/L）、K3PO4·3H2O（50mg/L）、CuSO4·5H2O（0.1mg/L）、MgSO4·7H2O（12mg/L）、CaCl2·2H2O （15mg/L）、NaCl2·2H2O（28mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.6mg/L）、MnCl2·4H2O（0.9mg/L）、ZnSO4·7H2O（0.26mg/L）、Co(NO3)2·6H2O（0.2mg/L）、Fe2(SO4)3（0.05mg/L）；
模拟该样品中的组成和含量配制得到自制污染水。
分别将20g的水体净化材料加入到1L含有100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500mg/L、2000 mg/L、2500 mg/L、3000 mg/L、3500 mg/L、4000 mg/L不同浓度（表示起始浓度）的乙酰甲胺磷溶液（即自制污染水）中，考察了72h后不同浓度下乙酰甲胺磷的降解率，根据已知的基于CdSe/ZnS量子点的荧光检测方法对自制污染水中的乙酰甲胺磷进行检测，所得数值表示对自制污染水进行处理72h后溶液中可检测到的乙酰甲胺磷的残留浓度值，结果见表1，其中，乙酰甲胺磷原药购自上海悦联化工有限公司（上海）。
由表1可知，实施例1、3、4制备的水体净化材料在72h后，对浓度2500mg/L的乙酰甲胺磷的降解率达到99.9%以上，能够高效地实现水污染修复，当乙酰甲胺磷浓度在≥2500mg/L且≤4000mg/L时，虽然乙酰甲胺磷降解率呈现下降趋势，但降解率仍然能够达到87.5%以上，这说明，当水溶液中乙酰甲胺磷的溶解度较高时，其对菌群的胁迫能力强，菌群降解乙酰甲胺磷的速率较强。另外可以发现，解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌通过磷元素的募集效应对乙酰甲胺磷进行招募，其本身几乎不能直接将乙酰甲胺磷进行降解或矿化。在乙酰甲胺磷达到一定程度的富集浓度后，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌相互之间能够进行优势互补，协同发挥作用，快速对乙酰甲胺磷进行矿化为磷酸根，进而高效完成对污染水的净化。
实验例2
选定实验例1配制的乙酰甲胺磷浓度为3000mg/L的自制污染水作为标定溶液，按照水体净化材料在自制污染水中的质量浓度为5g/L、10 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、100g/L，分别将实施例1、3、4和对比例1-2、4制备得到的水体净化材料，投入该标定溶液中，每实施例和对比例制备的水体净化材料设置3组平行试验，并取平均值，考察72h后乙酰甲胺磷的降解率，数值表示剩余溶液中可检测到的乙酰甲胺磷的浓度值。利用与实验例1相同的检测方法对乙酰甲胺磷进行检测，与实验例1的平行测定由于系统误差和随机误差的存在，不同批次之间的微小差值可忽略不计，结果如表2所示：
从表2可以看出，由维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌组成的水体净化材料具有更高的降解乙酰甲胺磷的能力，当乙酰甲胺磷的浓度在3000mg/L时，加入水体净化材料的质量浓度在10 g/L -40 g/L反应72h即能够将水溶液中的乙酰甲胺磷全部降解，这显著高于目前已知的任何菌剂或吸附法的降解效率。
实验例3
乙酰甲胺磷在非禁限农药用品目录中使用最为广泛，其属于最具代表性的广谱有机磷农药（OPPs）。与乙酰甲胺磷结构和性能相似的OPPs包括强毒性的甲胺磷、对硫磷、久效磷、甲拌磷等，这些有机磷农药均由于其较高的毒性和生态风险，基本已经被各地禁止或限制使用。乐果、敌百虫作为相对低毒且广谱性质，与乙酰甲胺磷功能相似。在这项实验例中，多种OPPs仅用于实验室实验数据测定而不作它用，获自华中师范大学杨光富课题组。
本实验例评估了实施例1、3、4制备的水体净化材料对乙酰甲胺磷的降解特异性。将乙酰甲胺磷、甲胺磷、对硫磷、久效磷、甲拌磷、乐果、敌百虫分别按照实验例1中自制污染水的制备方法配置成3000mg/L的标定溶液，按照质量浓度为40g/L，将实施例1、3、4制备的水体净化材料投入不同OPPs溶液中，平行3组取平均值，在72h后测定溶液中的OPPs残留浓度值并计算残留百分比，具体采用钼蓝比色法来直接测定反应后溶液中磷酸根离子的质量，从而间接确定细菌直接矿化有机磷农药的量，对照为未添加水体净化材料的自制污染水的空白对照，结果如表3所示；
由表3的结果可以得出，实施例1、3、4制备的水体净化材料对矿化乙酰甲胺磷具有极强的专一性和有效性，其在完成对乙酰甲胺磷的矿化后能够利用解磷的代谢途径将其作为C/N源充分利用，在保证菌株活性的前提下高效完成污染水体的修复。此外，实施例1、3、4制备的水体净化材料对于甲胺磷、对硫磷、久效磷、甲拌磷、乐果、敌百虫的有机OPPs均具有一定程度的降解作用，其中，甲胺磷的利用效果相对较佳，推测其被菌群分解后的产物由于同样存在甲氨基和磷酸根，因而也存在较为有效的降解代谢途径。虽然甲胺磷、对硫磷、久效磷、甲拌磷、乐果、敌百虫等的利用率低于乙酰甲胺磷，但也显示出了本发明的水体净化材料在同类型污染水体中具有极好的应用前景。
实验例4
本发明实施例1、3、4制备得到的水体净化材料相对于液态菌剂或纯菌的最大优势在于能够保持微生物活性且能够实现重复利用，适合的固定化包埋介质有助于菌体进行物质交换，进行水环境回收，再生性能好，也符合环境可持续发展修复理念。本实验例中测定了水体净化材料的储存稳定性。配置实验例1的自制污染水（其中乙酰甲胺磷的浓度在3000mg/L），保持对比例8和实施例实施例1、3、4水体净化材料的质量浓度在40 g/L，反应72h后测定自制污染水中乙酰甲胺磷的浓度值，以降解量相对于原始浓度计算降解率。
图2显示，储存5d后进行振荡培养，实施例1、3、4制得的水体净化材料能够保持极高的乙酰甲胺磷降解稳定性，能够维持在96.5%以上，而对比例8制备的水体净化材料的降解率则呈现出较大幅度的降低，只有65.2%左右；本发明实施例1、3、4制备得到的水体净化材料在第20 d 时仍然能够达到84.5%以上的降解率，最高仍然能达到93.5%，而对比例8制备的水体净化材料几乎已完全失去了降解活性。结果表明，对比例8制备的水体净化材料随着储存时间的增加容易被外界环境所污染，生长和保存条件受限，长期储存后无法发挥其作用。而本发明实施例1、3、4制备的水体净化材料能够保证菌株能够具备较高的生物活性，且在长期储存后仍能保持良好的降解活性，具有极高的性能稳定性，适宜进行大批量、规模化生产和应用。
实验例5
为进一步探索本发明实施例制备的水体净化材料在富含乙酰甲胺磷的自然污水处理和修复的实际应用效果，抽样选择了3组不同农田排水渠的水源作为实验对象，排水渠样本均来自江西抚州市金溪县，该片区农田以垄创、三唑酮类等有机农药滥用，实验前乙酰甲胺磷含量、氨氮含量等信息为该片农田污染物的未处理前的含量，本实验例按照质量浓度为20g/L，将实施例1制备的水体净化材料投入不同农田排水渠水源样品中，以仅加入固定化空载颗粒（未负载微生物复合菌剂）作为阴性对照组，温度维持在28℃，于48h后得测定不同农田水源样品中乙酰甲胺磷浓度、氨氮浓度和透明度。其中，水质的透明度采用铅字法测定，氨氮浓度采用纳氏试剂分光光度法稀释并制备标准曲线测定，结果如表4所示；
由表4可以看出，本发明实施例1制备的水体净化材料可以宽泛地应用于污染水质的净化和修复。其不仅对乙酰甲胺磷具有极高的降解率，对氨氮也具有一定程度的催化分解能力。对于一般的污染水域进行处理，48h即能够使得水质得到明显改善，对水质的提高具备极大的应用潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种微生物复合菌剂在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，所述微生物复合菌剂由维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）、里拉微球菌（Micrococcus lylae）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）按照质量比为1-3：4-5：2-3：2-5：2-5组成，所述维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）的保藏编号为CCTCCNO：M209313，所述里拉微球菌（Micrococcus lylae）的保藏编号为CCTCC NO:M2019339，所述嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的保藏编号为CCTCC NO:M20191025，所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的保藏编号为CCTCC NO：M2020164，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的保藏编号为CCTCC NO：M2011423，所述有机磷农药为乙酰甲胺磷。
2.根据权利要求1所述的微生物复合菌剂在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的质量比为1：5：2：2：2。
3.一种水体净化材料在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，所述水体净化材料包括权利要求1-2任一项所述的微生物复合菌剂，和包埋剂，所述包埋剂由海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙组成，其中，海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙的质量比为2-5:3-8:2-6:2-4，所述有机磷农药为乙酰甲胺磷。
4.根据权利要求3所述的水体净化材料在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，所述海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭和氯化钙的质量比为2:6:3:2；和/或，
所述包埋剂与所述微生物复合菌剂的质量比为5:1~7:1。
5.权利要求3-4任一项所述的水体净化材料在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将维罗纳假单胞菌、里拉微球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌剂按照质量比进行混合制备为复合菌悬液，各菌剂的菌活为6×1012-7×1012CFU/mL；
S2，将海藻酸钠和聚乙烯醇溶解于灭菌水中，加入活性炭和步骤S1制备的复合菌悬液，搅拌均匀，之后再缓慢加入氯化钙饱和水溶液，钙化，成型为颗粒，洗涤。
6.根据权利要求5所述的水体净化材料在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，所述步骤S1中，各菌剂的制备方法包括如下步骤，分别将各菌株活化，扩大培养后再进行发酵培养，待发酵液的OD600值大于等于0.8且稳定后停止发酵，得到各菌株的菌液，将制得的各菌株的菌液离心，干燥，得到各菌株的菌粉；
各菌株的扩大培养条件为温度28-30℃，转速100-200rpm，时间1-2天；
各菌株的发酵培养条件为温度28-30℃，转速200-220rpm，培养基pH值为6.8-7.1，培养时间72-78h；
干燥的温度为25-30℃；
所述菌粉的含水量不超过3wt%；
所述钙化处理为，将加入氯化钙饱和水溶液后的混合体系缓慢搅拌至少10h；
步骤S2中所述成型颗粒的步骤为，将完成钙化后的混合体系缓慢倾倒至微生物固定化制粒器中，制备得到粒径为2-3mm的球形颗粒。
7.根据权利要求6所述的水体净化材料在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，当所述有机磷农药的浓度为2500mg/L~4000mg/L时，所述水体净化材料的添加量为10 g/L -40g/L，反应时间为至少72h。
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