JP6769615B2 - 硝酸性窒素の除去方法及び硝酸性窒素除去剤 - Google Patents
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Description
これは、不適切に処理された家畜排せつ物あるいは過剰に施用された肥料や生活用水に含まれる窒素が、アンモニア性窒素、亜硝酸性窒素や硝酸性窒素になって地下に浸透するためである。
アンモニア性窒素は、土壌に固定されやすく、亜硝酸は不安定であり、すぐに酸化されて硝酸に変化するため、主として硝酸性窒素のみが地下水に移行して、地下水の硝酸性窒素の汚染につながっている。
従って、地下水中の硝酸性窒素の除去対策に有効な手段を構築することの社会的意義は大きい。
イオン交換法による脱窒素は強塩基性イオン交換樹脂に硝酸イオンを吸着したに過ぎず、イオン交換樹脂の再生時にNO3 −を含む高塩濃度廃液を生じるため、その処理が問題となり、環境に対する配慮が十分な方法ではなく、処理に設備等の投入が必要となる。
しかし、これらの方法では、NH4 +あるいはNO2 −の存在が必須条件であるため、地下水中の脱窒素には適用することが困難な課題を含んでいる。
これは、NH4 +は比較的強固に土壌中に保持され、NH4 +が酸化されたNO3 −として地下水へ溶脱するので、地下水中の窒素は、NO3 −に顕著に偏っているためである。
特に、本発明による硝酸同化作用は、NO3 −のみを直接除去できるため、地下水等の環境水等の好気性条件での脱窒素処理法として有効に機能することができる。
また、本発明においては、硝酸性窒素除去剤は、硝酸性窒素を含む酸性雨及びクヌギやスギ等の樹幹雨流とその根圏土壌中に端を発した天然由来の既知の菌であり、かつ菌体の安全性にも問題はないため、地下水中等の環境水や土壌中の硝酸性窒素の除去に極めて有効に適することができる。
本発明の硝酸性窒素の除去方法は、ロドトルーラ属に属し、硝酸性窒素を同化する能力のある酵母、その培養物又はその抽出物を、硝酸性窒素を含む地下水等の環境水又は土壌と接触させて除去する、硝酸性窒素の除去方法であり、具体的には、ロドトルーラ属グラミニス、ピヒア属カプシュラータ又はロドスポリジウム属スファエロカルパムに属し、硝酸性窒素を同化する能力のある酵母、その培養物又はその抽出物を、硝酸性窒素を含む環境水又は土壌と接触させて除去する、硝酸性窒素の除去方法である。
これらの酵母は、好気性下で硝酸を取り込み、酵母のアミノ酸やたんぱく質として同化できる能力を有する酵母であるため、硝酸性窒素を有効に同化することが可能となる。
硝酸性窒素を含有する地下水等の環境水中に、酵母等をそのまま投入しても、また担体に固定化等して用いても、地下水等の環境水と十分に接触できれば、いずれの方法を適用してもよく、固定床で用いても流動状態で用いてもいずれの方法であってもよい。
例えば、本発明の硝酸性窒素除去剤を、硝酸塩過剰の土壌に添加し、更に必要に応じて土壌と混合して、土壌中に含まれる硝酸性窒素を除去するものである。土壌と上記酵母とを直接散布混合しても、また担体に固定化されたものを用いても、土壌と十分に接触できれば、いずれの方法でもかまわない。
(使用試薬)
・Glucose(式量=180.16)和光純薬工業(株)
・Peptone 和光純薬工業(株)
・Yeast extract 和光純薬工業(株)
・Malt extract 和光純薬工業(株)
・硫酸マグネシウム(式量=246.47)(試薬) 片山化学工業(株)
・塩化カリウム(式量=74.55)(試薬)片山化学工業(株)
・硫酸第一鉄・7水塩(式量=278.02)(試薬) 関東化学(株)
・硫酸マグネシウム・7水塩 (式量=246.47)(試薬)片山化学工業(株)
・塩化ナトリウム (式量=58.44)(試薬)ナカライテスク(株)
・硝酸ナトリウム (式量=84.99)(試薬)和光純薬工業(株)
・リン酸二水素カリウム(式量=141.96)(試薬)ナカライテスク(株)
・リン酸水素二カリウム(式量=174.18)(試薬)和光純薬工業(株)
・ソモギー銅液 和光純薬工業(株)
・ネルソン液 和光純薬工業(株)
・滅菌イオン交換水(CPW−200 アドバンテック(株)製)
・アクアリウム用人工海水の素(製品名 レッドシーソルト、レッドシー(株)製)
・ポリビニルアルコール(PVA) 和光純薬工業(株) [160-11485](ケン化度;約98%、重合度;1600〜1800)
酵母:ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)NBRC 0190
酵母:ロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)
NBRC 1939
酵母:ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)NBRC 1770
各実施例中、硝酸イオン濃度は、イオン分析計(IA−100、東亜DKK(株)製またはIA−200、東亜DKK(株)製)を用い、イオンクロマトグラフ法により測定した。
まず、[NO3-]=1、2、5、10、20ppmの各標準溶液を調製し、サンプル注入量が20μLになるようイオン分析計に注入し、得られるクロマトグラムの硝酸イオンの保持時間における導電率値より検量線を作成した。
具体的には、評価対象の培養液サンプルをメンブレンフィルターでろ過後、注射器で適量分取し、上記イオン分析計に上記と同様に注入した。
硝酸イオンの保持時間における導電率値と前記作成した検量線より、培養液サンプル中の硝酸イオン濃度を求めた。
培養液に含まれるグルコース(残糖)濃度の測定は、吸光光度計(UVmini 1240 島津製作所(株))を用い、ソモギー・ネルソン法による吸光光度分析法にて測定した。具体的には、以下のとおりである。
まず、グルコース濃度が0.01、0.05、0.10、0.15、0.20g/Lの各標準溶液を調製し、前記各溶液1mLをそれぞれ試験管に入れ、ソモギー銅液1mLを添加してビー玉で蓋をし、沸騰水浴中で10分間加熱した。
次いで、流水で5分間急冷し、ネルソン液を1mL添加して発色させ、8分間静置した後、メスフラスコを用いて全量で25mLとなるよう希釈し、15分間静置した。
前記吸光光度計を用いて、波長:660nm、対照液:イオン交換水、光路長:1cmにおける吸光度を測定し、各グルコース濃度に対する吸光度の値にて検量線を作成した。
具体的には、評価対象の培養液サンプルをメンブレンフィルターでろ過し、ろ液をグルコース濃度が検量線濃度範囲内になるよう滅菌イオン交換水で希釈した。
この希釈サンプル1mLを、上記標準溶液と同様に発色させ、吸光度測定を行った。
得られた吸光度の値を前記作成した検量線に照らし合わせると共に希釈倍率を乗じて、培養液サンプル中のグルコース(残糖)濃度を求めた。
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター(NBRC)より分譲された上記3種の酵母(酵母:ロドトルーラ属グラミニス NBRC 0190、酵母:ロドスポリジウム属スファエロカルパム NBRC1939、酵母:ピヒア属カプシュラータ NBRC1770)の凍結乾燥標品を復元して用いた。
復元方法は、公知の方法を適用して復元することができるが、具体的には例えば、以下のようにして復元した。
開封後直ちに滅菌したパスツールピペットを用いて、下記表1に示す復水液(下記表1の各試薬を添加してイオン交換水で1Lとなるように希釈し、121℃で15分間オートクレーブ滅菌後に放冷したYM液体培地)約0.2mLを、各アンプルに添加した。
その後十分に攪拌して、各菌体を懸濁させた後、YM培養基(下記表2中の粉末寒天を除いた各試薬を添加してイオン交換水で1Lとなるように希釈して調製したYM液体培地)、またはYM寒天斜面培地及びYM寒天平板培地(下記表2の各試薬を添加してイオン交換水で1Lとなるように希釈して調製)に接種し、25℃の水浴中80rpmの条件で振とう(液体の場合)又は静置して、一定期間(2〜7日程度)培養し、該菌の増殖を確認後5〜8℃の冷蔵庫内に保存した。
前培養培地として、上記(1)で調製したYM液体培地又は、滅菌イオン交換水1Lあたり下記表3に示す無機塩とグルコースとを溶解させ、オートクレーブ滅菌(121℃、15分)と放冷を行ったツァペック液体培地を用い、これらの培地に、上記(1)で復元された各酵母をそれぞれ適量(液体であれば1%体積量程度)接種し、25℃で数日間、80rpmで振とう培養した各培養液を3000rpmで15分間遠心分離して、上澄み液を除去し、沈殿した菌体を滅菌イオン交換水で懸濁させた。
遠心分離による液相の除去と滅菌イオン交換水による懸濁の操作を、更に1回から2回程度繰り返して、培地の除去と菌体の洗浄を行った。得られた最終懸濁液を本培養の種菌(酵母)として用いた。
下記表6に示すように、イオン交換水1Lあたりに各種無機塩を溶解して調製した(炭素及び窒素を含まない)ツァペック液体培地を模した液体培地に、硝酸態窒素濃度([NO3 ―‐N])が25.5ppm又は99.8ppmとなるように硝酸ナトリウムを添加し、更にC/N比が20となるように炭素源となるグルコースを添加するとともに、塩化ナトリウム濃度が0〜3.0w/w%となるように塩化ナトリウムをそれぞれ添加して、各液体培地を調製した。
その結果を図1及び図2に示す。
また図2より、[NO3 ―‐N]が高濃度の112ppmの場合では、海水レベルの塩濃度である塩化ナトリウム濃度が3.0w/w%であっても除去速度は緩やかであるが硝酸イオンが低下することが認められ、他の濃度においては9日目において硝酸イオン除去率は95%以上となり、本菌が広い塩濃度の環境水中で硝酸イオン除去能を発現することが明らかとなった。
下記表6のようにイオン交換水1Lあたりに各種無機塩を溶解して調製した(炭素及び窒素を含まない)ツァペック液体培地を模した液体培地に、硝酸性窒素濃度([NO3 ―‐N])が25.5ppm又は99.8ppmとなるように硝酸ナトリウムを添加し、更にC/N比が20となるように炭素源となるグルコースを添加し、各培地のpHが4.5〜8.5となるようにリン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムより調製したpH緩衝溶液を添加して、各液体培地を調製した。
その結果を図3及び図4に示す。
下記表6のようにイオン交換水1Lあたりに各種無機塩を溶解して調製した(炭素及び窒素を含まない)ツァペック液体培地を模した液体培地に、硝酸性窒素濃度([NO3 ―‐N])が25、50、100、200ppmとなるように硝酸ナトリウムを、炭素濃度が500、1000、2000、4000ppmとなるようにグルコースを添加して、各液体培地を調製した。
その結果を図5に示す。
滅菌イオン交換水1Lに、上記(2)で調製した表3のツァペック改変液体培地(C/N比=32、pH≒6.9)を調製し、これを淡水培地とした。
次いで、25℃、65rpmで振とう培養すると共に、培地の硝酸イオン濃度の経時変化を上記イオン分析計を用いてイオンクロマトグラフで分析した。
これらの結果を、淡水培地の場合を図6に、また人工海水培地の場合を図7にそれぞれ示す。
特にRhodosporidium属は淡水中での硝酸同化速度が優れており、Rhodotorula属では硝酸同化速度の変化が淡水及び海水でほとんど差はない。また、Pichia属は、淡水及び海水でも硝酸同化能を発現することが可能であるが、Rhodotorula属のほうが、より硝酸同化速度に優れ、かつ硝酸イオン除去する程度も高いことがわかる。
特にRhodotorula属のRhodotorula graminis NBRC 0190の適用が好適である。
i)ツァペック液体培地の組成
イオン交換水1Lに下記表6のように無機塩を溶解し、硝酸イオン、有機成分および寒天質を含まない液体培地を調製した。この液体培地に、硝酸イオン濃度が所望の濃度([NO3 −]=885、443、221、111、44.3、22.1ppm)となるようにそれぞれNaNO3を添加し、さらに硝酸性窒素と有機体炭素のモル比が、C/N=20となるようにグルコースを添加して、各ツァペック培地を調製した(pH≒6.7〜7.0)。
25℃、65rpmで振とう培養すると共に、培地の硝酸イオン濃度の経時変化を、上記イオン分析計を用いて分析した。
その結果を図8及び図9に示す。
i)ツァペック液体培地の組成
上記(2)で調製した表3と同様のツァペック液体培地を調製した。
上記(2)で得られたロドトルーラ(Rhodotorula)属酵母を固定化するための担体として、ポリビニルアルコール(PVA)を用いた。
上記(2)で得られたロドトルーラ(Rhodotorula)属酵母懸濁液を、上記表3のツァペック液体培地に添加して、振とう培養(25℃、100rpm)した。
115℃で15分間、オートクレーブ滅菌したPVAの10w/w%水溶液に、培養したRhodotorula属酵母懸濁液を、前記PVA水溶液の20v/v%量で添加して混和した後、96穴マイクロプレート(well径5mm)に200μLずつ分注した。
凍結と解凍の操作を5回反復して、弾力性のある上記Rhodotorula属酵母固定化PVAディスク(約φ5mm×8mm,円柱状)を製造した。
その結果を図10に示す。
地下水(熊本県、井戸水)を2種類採取して、地下水中に含まれる硝酸性窒素の除去試験を行った。
なお、各地下水のpHは、ガラス電極pH計(D−71 堀場製作所(株)製)を用いて測定し、陽イオン濃度は原子吸光分析装置(AA−6200 島津製作所(株)製)を、陰イオン濃度はイオン分析計(IA−100、東亜DKK(株)製)用いて測定した。またTOC(有機体炭素)はTOC計(TOC−5000A 島津製作所(株)製)を用いて測定した。
前培養培地としては上記表3のツァペック液体培地に、上記(2)で得られたロドトルーラ(Rhodotorula)属酵母懸濁液を、当該培地の1%体積量で接種し、20℃で4日間程度振とう培養した培養液を3000rpmで15分間遠心分離した。次いで、上澄み液を除去し、沈殿した菌体を滅菌イオン交換水に懸濁した。遠心分離による液相の除去と滅菌イオン交換水による懸濁の操作を、1乃至2回繰り返して、培地の除去と菌体の洗浄を行った。その最終懸濁菌液を本培養の種菌として用いた。
本培養においては、地下水Aと地下水Bの100mLに、以下の1)〜3)の処理を行った後、種菌懸濁液1mLをそれぞれ植菌した。
2)グルコースを各地下水の硝酸イオン濃度に対して、C/N=20となるように量り入れた後、オートクレーブ滅菌(121℃,15分間)し、その後放冷した。
3)他方、グルコースを各地下水の硝酸イオン濃度に対してC/N=20となるように量り入れ、滅菌せずに、解放状態とした。
また、ソモギー・ネルソン法で残糖濃度を分析し、その結果を表9(数値はppm)及び図12に示す。
一方、C/N=20の割合でグルコースを添加することで、1〜2日間で硝酸イオン濃度が0.5ppm未満まで低減していることがわかる。
また、表9及び図12より、C/N=20で仕込んだグルコースも硝酸イオンの除去に伴いほぼ消費され、残糖濃度を有機体炭素濃度(TOC値)に換算しても3ppm未満になっていることがわかる。
Claims (7)
- ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)、ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)又はロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)に属し、硝酸性窒素を同化する能力のある酵母、その培養物又はその抽出物を、硝酸性窒素を含む環境水又は土壌と接触させて、硝酸性窒素を除去することを特徴とする、硝酸性窒素の除去方法。
- 請求項1記載の硝酸性窒素の除去方法において、ロドトルーラ グラミニス(Rhodotorula graminis)に属する酵母はロドトルーラ グラミニス NBRC 0190であり、ピヒア カプシュラータ(Pichia capsulata)の属する酵母はピヒア カプシュラータ NBRC 1770であり、ロドスポリジウム スファエロカルパ(Rhodosporidium sphaerocarpum)はロドスポリジウム スファエロカルパム NBRC1939であることを特徴とする、硝酸性窒素の除去方法。
- 請求項1又は2記載の硝酸性窒素の除去方法において、上記ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)、ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)又はロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)に属する酵母、その培養物またはその抽出物を担体に固定化させて、硝酸性窒素を含む環境水又は土壌と接触させることを特徴とする、硝酸性窒素の除去方法。
- 請求項1乃至3いずれかの項記載の硝酸性窒素の除去方法において、硝酸性窒素を含む環境水又は土壌には、炭素がC/N比(質量比)で15〜30で含まれていることを特徴とする、硝酸性窒素の除去方法。
- ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)、ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)又はロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)に属し、硝酸性窒素を同化する能力のある酵母、その培養物又はその抽出物からなることを特徴とする、環境水又は土壌用硝酸性窒素除去剤。
- 請求項5記載の硝酸性窒素除去剤において、ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)に属する酵母はロドトルーラ グラミニス NBRC 0190であり、ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)に属する酵母はピヒア カプシュラータ NBRC 1770であり、ロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)に属する酵母はロドスポリジウム スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)NBRC1939であることを特徴とする、環境水又は土壌用硝酸性窒素除去剤。
- 請求項5又は6記載の硝酸性窒素除去剤において、上記ロドトルーラ属グラミニス(Rhodotorula graminis)、ピヒア属カプシュラータ(Pichia capsulata)又はロドスポリジウム属スファエロカルパム(Rhodosporidium sphaerocarpum)に属する酵母、その培養物またはその抽出物は、担体に担持されて固定化されていることを特徴とする、環境水又は土壌用硝酸性窒素除去剤。
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