CN107653209A - 苯酚降解微生物菌剂、固定化小球及制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种苯酚降解微生物菌剂、固定化小球及制备方法，所述微生物菌剂中的微生物从自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料中分离提取，经过在含锰MSVP液体培养基、含锰MSVP固体培养基中培养筛选、以及在TSB培养基中活化后，制成微生物菌剂。本发明还提供了将该微生物菌剂制备成微生物固定化小球的方法，制备了以二氧化硅或二氧化锰和海藻酸钠的交联聚合产物为载体，包埋微生物菌剂而形成的凝胶小球。所述的微生物菌剂可应用于地下水的低温无氧中性条件，快速降解苯酚。所述的微生物菌剂固定小球可以提供稳定降解环境，更适应毒性环境，处理浓度更高的地下水苯酚污染。

Description

苯酚降解微生物菌剂、固定化小球及制备方法
技术领域
本发明属于微生物修复地下水有机污染物技术领域，具体涉及一种苯酚降解微生物菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
苯酚是常见的有机污染物，是毒性最大的酚类化合物，在自然状态下难以降解，残留物在环境中可以维持较长时间，长期污染环境。苯酚是一种重要的有机合成原料，在造纸、农药、纺织、染料、医药、塑料等行业以及生产表面活性剂、炸药、化肥、脱漆剂、抗氧化剂、固化剂等方面有广泛应用。苯酚对人体和环境有极大危害。与人体接触会导致皮肤灼伤，神经、肝肾等损伤，长期饮用被酚污染的水可引起头昏、头痛、贫血、蛋白质凝固等各种症状，严重者引起蛋白尿及各种神经系统疾病。水体中低浓度酚(1.5-9mg/L)能使鱼类血细胞数目减少，机体破坏；较高浓度酚(5-20mg/L)能使鱼急性中毒而死亡。当饮用水中含酚0.002-0.015mg/L时，加氯消毒会产生毒性更大的氯酚，具有恶臭味，严重影响饮用水的质量。中国早在2001年就将苯酚列入“优先污染物”，并规定III类地下水苯酚浓度的最大限值为0.002mg/L。我国部分地区地下水苯酚污染程度较为严重，污染浓度在2mg/L以上，因此寻找一种在地下水环境中具有良好苯酚去除性能的方法尤为重要。
目前，地下水中苯酚的去除方法主要集中在物理吸附和化学降解，利用(改性)纳米材料可以对地下水中的苯酚有良好的吸附作用，采用活性炭等活化剂活化过硫酸盐产生具有较高氧化还原电位的过硫酸根自由基可以较好的氧化苯酚，实现苯酚的降解，利用高锰酸盐氧化苯酚也是苯酚的去除途径之一。但由于物理和化学的途径去除苯酚具有二次污染、成本较高等缺点，微生物去除地下水中的苯酚是研究的热点之一。但由于地下水特殊的低温、低氧、中性、黑暗等环境，微生物的活性是解决地下水苯酚降解面临的主要问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种苯酚降解微生物菌剂、其固定化小球及制备方法，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。
作为本发明的一方面，提供一种苯酚降解微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料，对所述表层滤料接种和活化培养制备第一菌液；
(2)将第一菌液接种至含锰MSVP液体培养基中培养，生成较多黑褐色颗粒物，制成第二菌液，其中，含锰MSVP液体培养基为加入有Mn2+浓度为20-40mg/L的MnCl2的MSVP液体培养基，pH为7.25-7.3；
(3)将第二菌液接种至含锰MSVP固体培养基中，倒置培养，生成较多黑褐色颗粒物，挑取生成黑褐色颗粒物的菌落接种至1-3％TSB培养基，活化后制成微生物菌剂，其中，含锰MSVP固体培养基为加入有0.1-0.5mL Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液的MSVP固体培养基，pH为7.25-7.3。
优选地，所述步骤(1)中，接种和活化培养方法包括以下步骤：
(11)选取的自来水厂的水源为高锰地下水，将所述表层滤料接种至加入2.38g/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、pH为7.25-7.3的LB培养基中，活化12-24h；
(12)将活化后的菌液再次接种LB培养基中培养12-24h，制备所述第一菌液。
优选地，所述步骤(2)中，所述第一菌液在含锰MSVP液体培养基中的接种量按体积计为1-1.5％，接种时OD600(指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值)值为0.9-1.1，培养温度为25-28℃，培养时间为12-24d；
所述步骤(3)中，所述第二菌液在含锰MSVP固体培养基中的接种量为0.5-1mL，接种时OD600值为0.9-1.1；筛选的菌落在1-3％质量含量的TSB培养基中在25-28℃温度下，活化12-24小时。
优选地，所述步骤(2)中，含锰MSVP液体培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，HEPES2.38g/L，VB120.002g/L，Mn2+浓度为20-40mg/L的MnCl2，pH为7.25-7.3；
所述步骤(3)中，含锰MSVP固体培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，琼脂2-5％，HEPES2.38g/L，VB120.002g/L，Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液0.1-0.5mL，pH为7.25-7.3；
所述含锰MSVP固体培养基的制备方法为：向灭菌后的含有(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、无水CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、丙酮酸钠、琼脂的培养基中加入过0.22μm灭菌滤膜的HEPES和VB12混匀、凝固后，加入MnCl2溶液并使MnCl2溶液在培养基表面涂匀，静置使Mn2+渗透至培养基中。
作为本发明的再一方面，提供一种如上所述的制备方法制得的微生物菌剂。优选地，按质量百分数计，所述微生物菌剂包含假单胞菌属72.2-76.1％、代夫特菌属9.6-13.3％、贪噬菌属2.4-8.0％、、土壤杆菌属3.5-4.0％、Herminiimonas属0.8-1.3％、柄细菌属0.2-1.5％、包西氏菌属0.3-0.7％、鞘脂单胞菌属0.1％-0.8％、氮单胞菌属0.2-0.4％、生丝微菌属0.1-0.7％、黄杆菌属0.1-0.7％、氨基杆菌属0.2-0.6％、Terrimonas属0.1-0.5％、志贺氏杆菌属0.2-0.5％、Sphingopyxis属0.2-0.4％、嗜酸菌属0.04-0.4％、棒状杆菌属0.01-0.1％。
作为本发明的又一方面，提供一种如上所述的微生物菌剂的固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
(1)取活化后的菌体制备菌悬液；
(2)将步骤(1)制备的菌悬液以体积计15-20％的接种量接种至加入有质量含量为2-5％SiO2或MnO2粉末的MSVP培养基，pH为7.25-7.3，吸附12-36h；
(3)将步骤(2)所得菌液以10-15％的体积比加入5-8％质量浓度的海藻酸钠溶液中，得到菌体包埋液；
(4)将所述菌体包埋液缓慢加入质量浓度为5-8％CaCl2交联液中，交联凝固成球，经无菌水洗涤得到所述微生物菌剂的固定化小球。
作为本发明的又一方面，提供一种如上所述制备方法制得的微生物菌剂的固定化小球，以二氧化硅/二氧化锰和海藻酸钠的交联聚合产物为载体，包埋微生物菌剂而形成的凝胶小球。
作为本发明的又一方面，提供一种如上所述的微生物菌剂在降解地下水苯酚污染中的应用。
作为本发明的又一方面，提供一种如上所述制备方法制得的微生物菌剂的固定化小球在降解地下水苯酚污染中的应用。
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明的苯酚降解微生物菌剂用于降解苯酚时，具有经济高效、无二次污染等优点，可在缺氧甚至无氧条件下完全降解浓度为2mg/L的苯酚，可以被用于地下水低温条件下苯酚污染的降解；可在低温环境下，完全降解浓度为2mg/L的苯酚，可以被用于地下水低温条件下苯酚污染的降解；
本发明采用固定化手段将上述微生物菌剂固定后可对外界环境的变化起到缓冲作用，可以提供稳定降解环境，更适应毒性环境，处理浓度更高的地下水苯酚污染，并延长微生物菌剂的使用时间和次数。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明的苯酚降解微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料，对所述表层滤料接种和活化培养制备第一菌液，其中“生物锰砂滤池”是目前自来水厂较为成熟的生物除锰工艺设施，其表层滤料容易获取，尤其是对于我国北方城市，自来水厂的原水主要来源是高锰含量的地下水，本发明的生物锰沙滤池的表层滤料则优选来自水源为高锰含量地下水的自来水厂，此地下水源水中只含有较高浓度的锰离子，此外，并无其他污染，经过生物锰砂滤池后可去除90％以上的锰离子；生物锰砂滤池中产生的锰氧化物较为成熟，较易获得具有较高锰氧化能力的锰氧化菌群。
具体地，取10g生物锰砂滤池表层滤料接种至加入10颗玻璃珠121℃灭菌20min的LB培养基中，所述LB培养基灭菌前pH调节至7.25-7.3，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液，25-28℃、100-150rpm/min活化12-24h后，将活化后的菌液再次接种至121℃灭菌20min的LB培养基中，25-28℃、100-150rpm/min培养12-24h，制成菌液1。
(2)配制含锰MSVP液体培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7.3的HEPES、0.002g/L VB12和Mn2+浓度为20-40mg/L的MnCl2溶液。
(3)按体积计以1-1.5％的接种量将菌液1接种至配好的含锰MSVP液体培养基中，接种时OD600值为0.9-1.1，25-28℃、100-150rpm/min培养12-24d后，生成较多黑褐色颗粒物，制成菌液2。
(4)配制含锰MSVP固体培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，琼脂2-5％(以质量计)，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7.3的HEPES、0.002g/L VB12，混匀后，缓缓倒至已灭菌的平板培养皿中，培养基凝固后用灭菌枪头加入0.1-0.5mL Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液并用涂布棒在培养基表面涂匀，于超净工作台中静置10-12h使Mn2+渗透至培养基中。
(5)取1mLOD600值为0.9-1.1菌液2接种至含锰MSVP固体培养基，用涂布棒在培养基表面涂匀，待菌液吸收进培养基后，将平板于25-28℃倒置培养10-20d后，生成较多黑褐色物质，挑取生成黑褐色颗粒的菌落接种至1-3％质量含量的TSB培养基，在25-28℃下，活化12-24h后，制成微生物菌剂。
本发明还提供了上述微生物菌剂的固定化小球的制备方式如下：
(1)取活化后的菌体于4℃，1000rpm/min的条件下离心5min，在超净工作台中取出上清液后，加入pH调节至7.25-7.3的无菌水洗涤3次，用无菌水将菌液的OD600值调节至1.0左右获得菌悬液。
(2)按质量计取2-5％的SiO2粉末或MnO2粉末加入等待灭菌的无碳源MSVP培养基中，于121℃灭菌20min，灭菌完成后加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液、0.002g/L VB12。
(3)以5-8％的质量浓度配制海藻酸钠溶液，并于121℃灭菌20min，灭菌完成后加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液，备用。
(4)取步骤(1)所获得的菌悬液，按体积计以15-20％的比例接种至步骤(2)配制的培养基中，吸附12-36h。
(5)取步骤(4)中获得的吸附12-36h后的菌液，以10-15％的体积比例加入步骤(3)配制的海藻酸钠溶液中，获得菌体包埋液。
(6)用无菌注射器取步骤(5)中获得的菌体包埋液缓慢加入质量浓度为5-8％的CaCl2交联液中，交联凝固成球，收集后用无菌水洗净得到所述的微生物菌剂固定化小球，于4℃下保存备用。
本发明所制备的微生物菌剂中的微生物含量大于0.1％的微生物成分为：假单胞菌属(Pseudomonas)、代夫特菌属(Delftia)、贪噬菌属(Variovorax)、土壤杆菌属(Sediminibacterium)、Herminiimonas属、柄细菌属(Caulobacter)、包西氏菌属(Bosea)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、氮单胞菌属(Azomonas)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氨基杆菌属(Aminobacter)、Terrimonas属、志贺氏杆菌属(Shinella)、Sphingopyxis属、嗜酸菌属(Acidovorax)、棒状杆菌属(Corynebacterium)其含量分别为：72.2-76.1％、9.6-13.3％、2.4-8.0％、3.5-4.0％、0.8-1.3％、0.2-1.5％、0.3-0.7％、0.1-0.8％、0.2-0.4％、0.1-0.7％、0.1-0.7％、0.2-0.6％、0.1-0.5％、0.2-0.5％、0.2-0.4％、0.04-0.4％、0.01-0.1％，其中随着富集次数的增加，假单胞菌属、Herminiimonas属、氮单胞菌属、生丝微菌属、Terrimonas属等含量呈增加趋势，其余的种类的细菌呈减少趋势。
上述微生物菌剂的微生物量采用OD600值来确定，OD600＝0.978时，细菌个数为3*108CFU/mL，OD600＝1.386时，细菌个数为2.7*109CFU/mL。
上述微生物菌剂的短期保存条件为4℃，长期保存条件为V甘油：V水：V菌液＝1∶1∶2，-20℃，其中甘油和水以1∶1配好后于121℃灭菌20min，灭菌完成后加入菌液。
上述微生物菌剂降解苯酚前，按体积计先取1％保存的菌液接种至1-3％质量含量的TSB液体培养基中活化。在一示例性实施例中，降解苯酚时，采用的是人工配制的苯酚废水，初pH调节至7.25-7.3，以模拟地下水的中性条件。上述微生物菌剂降解苯酚时，对苯酚浓度小于500mg/L的浓度，均可在24h内降解完全。上述微生物菌剂降解苯酚时，缺氧甚至无氧条件亦可完全降解浓度为2mg/L的苯酚，可以被用于地下水缺氧条件下苯酚污染的降解。上述微生物菌剂降解苯酚时，低温环境时，对苯酚降解的时间增长，但亦可完全降解浓度为2mg/L的苯酚，可以被用于地下水低温条件下苯酚污染的降解。
上述微生物菌剂降解苯酚后，各微生物的含量有较大改变，具体表现在以下方面：贪噬菌属、土壤杆菌属、Herminiimonas属、氮单胞菌属、棒状杆菌属的含量有不同程度的增加，Terrimonas属、嗜酸菌属的含量基本维持在范围内，其余菌种的含量均有所减少。其中增加贪噬菌属最多，假单胞菌属减少最多。本发明所使用的SiO2可以回收后重复利用。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明提供了一种应用于地下水苯酚污染降解的微生物菌剂的制备方法，该微生物菌剂是从沈阳一家水源为高锰地下水的自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料中分离提取的，提取方法如下：
(1)取10g生物锰砂滤池表层滤料接种至加入10颗玻璃珠的LB培养基中。培养基灭菌前pH调节至7.25-7.3，灭菌条件为121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液，28℃、150rpm/min活化24h后，将活化后的菌液再次接种至121℃灭菌20min的LB培养基中，28℃、150rpm/min培养12h，制成菌液1。
(2)配制含锰MSVP液体培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7.3的HEPES、0.002g/L VB12和Mn2+浓度为20mg/L的MnCl2溶液。
(3)以1％(以体积计)的接种量将菌液1接种至配好的含锰MSVP液体培养基中，28℃、150rpm/min培养12d后，生成较多黑褐色颗粒物，制成菌液2。
(4)配制含锰MSVP固体培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，琼脂3％，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7.3的HEPES、0.002g/L VB12，混匀后，缓缓倒至已灭菌的平板培养皿中，培养基凝固后用灭菌枪头加入0.3mL Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液并用涂布棒在培养基表面涂匀，于超净工作台中静置12h或Mn2+渗透至培养基中。
(5)取1mL菌液2接种至含锰MSVP固体培养基，用涂布棒在培养基表面涂匀，待菌液吸收进培养基后，将平板于28℃倒置培养10d后，生成较多黑褐色物质，挑取生成黑褐色颗粒的菌落接种至1-3％TSB培养基，活化12h后，制成微生物菌剂。
将上述微生物菌剂于4℃，1000rpm/min的条件下离心5min，在超净工作台中取出上清液后，加入pH调节至7.25-7.3的无菌水洗涤3次，用无菌水将菌液的OD600值调节至1.0左右获得菌悬液。
使用所述微生物菌剂用于降解苯酚时，采用的是人工配制的苯酚废水，初pH调节至7.25-7.3，以模拟地下水的中性条件。使用所述微生物菌剂降解苯酚前，按体积计先取1％保存的菌液接种至1-3％的TSB液体培养基中活化。
取体积比为1％-5％的菌悬液加入人工配制的只含有苯酚的废水中，改变不同的环境条件，确定苯酚的降解效率。其中，苯酚浓度通过HPLC测定，运行条件为：(1)检测器：紫外检测器；(2)柱温：30℃；(3)流动相：45％的甲醇和55％的水；(4)流速：0.1mL/min(5)进样量：20μL；(6)检测波长：270nm；(7)保留时间：5.5min，出峰时间为4.3min左右。降解率计算公式：C0和C分别为苯酚的初始浓度和平衡浓度。具体试验情况可见下表所示：
表1苯酚降解试验结果
实施例2
本实施例提供了一种应用于地下水中度苯酚污染的微生物处理方法，其包括以下步骤：
按照实施例1获得微生物菌剂的菌悬液。
配制含苯酚的无碳源MSVP培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7-3的HEPES、0.002g/L VB12，1mg/L、5mg/L、10mg/L苯酚溶液，配制成一系列浓度梯度的苯酚废水。
取一定量的菌悬液加入上述含培养基的苯酚废水中，对苯酚进行降解，苯酚浓度的测定方法和降解率确定方法与实施例1相同。具体试验情况请参见表2。
表2苯酚降解试验结果
本实施例所制备的微生物菌剂可以快速降解低浓度的苯酚，甚至可以完全降解苯酚浓度在500mg/L一下的苯酚，并在中性条件下取得最好的降解效果，低温低氧条件下，适当延长降解时间，可以高效降解苯酚。
本发明所获得的微生物菌剂在加入适量营养物质的条件下可以更好的应用于地下水环境条件的苯酚污染。
实施例3
本实施例提供了一种地下水锰和苯酚复合污染的微生物处理方法，其包括以下步骤：
配制含苯酚和锰的MSVP液体培养基，培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，将pH调节至7.25-7.3，121℃灭菌20min，灭菌后通过0.22μm的灭菌滤膜加入2.38g/L pH调至7.25-7.3的HEPES、0.002g/L VB12，2-20mg/L的MnCl2溶液和2-20mg/L的苯酚溶液配制成一系列浓度梯度的苯酚和锰复合污染的废水。
取一定量的菌悬液加入上述含培养基的苯酚废水中，对苯酚进行降解，苯酚浓度的测定方法和降解率确定方法与实施例1相同，Mn2+通过ICP-OES测定溶液中的锰离子含量，每次取样后于4℃1000rpm/min的条件下离心10分钟并用硝酸酸化水样待测。具体试验情况请参见表3所示。
表3苯酚降解试验结果
在有碳源存在的条件下，本微生物菌剂可以良好的去除苯酚，并能与Mn2+反应生成生物氧化锰，在有生物氧化锰存在的条件下，可以缩短微生物去除苯酚的反应时间。
本发明所获得的微生物菌剂可以应用于锰离子复合苯酚污染的地下水。
实施例4
本实施例提供了一种微生物菌剂的固定化方法，其包括以下步骤：
(1)使用实施例1中制备的微生物菌剂，取活化后的菌体于4℃，1000rpm/min的条件下离心5min，在超净工作台中取出上清液后，加入pH调节至7.25-7.3的无菌水洗涤3次，用无菌水将菌液的OD600值调节至1.0左右获得菌悬液。
(2)按质量计取2％的SiO2粉末加入等待灭菌的无碳源MSVP培养基中，于121℃灭菌20min，灭菌完成后加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液、0.002g/L VB12。
(3)以5％的质量浓度配制海藻酸钠溶液，并于121℃灭菌20min，灭菌完成后加入2.38g/L pH调节至7.25-7.3的HEPES缓冲溶液，备用。
(4)取步骤(1)所获得的菌悬液，以15％的体积比例接种至步骤(2)配制的培养基中，吸附12h。
(5)取步骤(4)中获得的吸附12h后的菌液，以10％的体积比例加入步骤(3)配制的海藻酸钠溶液中，获得菌体包埋液。
(6)用无菌注射器取步骤(5)中获得的菌体包埋液缓慢加入质量浓度为5％的CaCl2交联液中，交联凝固成球，收集后用无菌水洗净得到所述的微生物菌剂固定化小球，于4℃下保存备用。
本实施例中采用SiO2作为吸附微生物菌剂的材料，SiO2具有较好的吸附性能，且SiO2胶体表面带正电，微生物菌剂表面带负电，能更好的吸附更多的微生物菌剂，且由于SiO2难溶于水的性质，可以较好的从地下水中分离，重复利用。
本实施例采用海藻酸钠作为微生物菌剂的包埋材料，具有安全无害、简单方便等优点。
实施例5-7
本实施例的微生物菌剂的制备方法与实施例1的类似，不同之处主要在于，步骤(2)至(5)中的用于筛选菌种的含锰培养基的不同，可参见表4中所示。并对实施例5-7进行了苯酚降解试验，试验条件同实施例1试验1，试验结果如表4所示，可知含锰MSVP培养基中锰含量越高，对于后续菌液降解苯酚时时间相应增加，其原因是，锰浓度越高，菌液更加适应含锰环境，相应的，处于苯酚环境时，需要的调整期越长。
表4实施例5-7微生物菌剂的制备参数以及苯酚降解效率
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苯酚降解微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料，对所述表层滤料接种和活化培养制备第一菌液；
(2)将第一菌液接种至含锰MSVP液体培养基中培养，生成黑褐色颗粒物，制成第二菌液，其中，含锰MSVP液体培养基为加入有Mn2+浓度为20-40mg/L的MnCl2的MSVP液体培养基，pH为7.25-7.3；
(3)将第二菌液接种至含锰MSVP固体培养基中，倒置培养，生成黑褐色颗粒物，挑取生成黑褐色颗粒物的菌落接种至1-3％TSB培养基，活化后制成微生物菌剂，其中，含锰MSVP固体培养基为加入有0.1-0.5mL Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液的MSVP固体培养基，pH为7.25-7.3。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，接种和活化培养方法包括以下步骤：
(11)选取的自来水厂的水源为高锰地下水，将所述表层滤料接种至加入2.38g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、pH为7.25-7.3的LB培养基中，活化12-24h；
(12)将活化后的菌液再次接种LB培养基中培养12-24h，制备所述第一菌液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述第一菌液在含锰MSVP液体培养基中的接种量按体积计为1-1.5％，接种时OD600值为0.9-1.1，培养温度为25-28℃，培养时间为12-24d；
所述步骤(3)中，所述第二菌液在含锰MSVP固体培养基中的接种量为0.5-1mL，接种时OD600值为0.9-1.1，培养温度为25-28℃，培养时间为10-20d；筛选的菌落在1-3％质量含量的TSB培养基中在25-28℃温度下，活化12-24小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，中含锰MSVP液体培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38g/L，VB120.002g/L，Mn2+浓度为20-40mg/L的MnCl2，pH为7.25-7.3；
所述步骤(3)中，含锰MSVP固体培养基成分为：(NH4)2SO40.24g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，无水CaCl20.06g/L，KH2PO40.02g/L，Na2HPO4·12H2O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，琼脂2-5％，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38g/L，VB120.002g/L，Mn2+浓度为1g/L的MnCl2溶液0.1-0.5mL，pH为7.25-7.3；
所述含锰MSVP固体培养基的制备方法为：向灭菌后的含有(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、无水CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、丙酮酸钠、琼脂的培养基中加入过0.22μm灭菌滤膜的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和VB12混匀、凝固后，加入MnCl2溶液并使MnCl2溶液在培养基表面涂匀，静置使Mn2+渗透至培养基中。
5.一种如权利要求1至4中任意一项所述的制备方法制得的微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，按质量百分数计，所述微生物菌剂包含假单胞菌属72.2％-76.1％、代夫特菌属9.6-13.3％、贪噬菌属2.4-8.0％、、土壤杆菌属3.5-4.0％、Herminiimonas属0.8-1.3％、柄细菌属0.2-1.5％、包西氏菌属0.3-0.7％、鞘脂单胞菌属0.1-0.8％、氮单胞菌属0.2-0.4％、生丝微菌属0.1-0.7％、黄杆菌属0.1-0.7％、氨基杆菌属0.2-0.6％、Terrimonas属0.1-0.5％、志贺氏杆菌属0.2-0.5％、Sphingopyxis属0.2-0.4％、嗜酸菌属0.04-0.4％、棒状杆菌属0.01-0.1％。
7.一种如权利要求5所述的微生物菌剂的固定化小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取活化后的菌体制备菌悬液；
(2)将步骤(1)制备的菌悬液以体积计15-20％的接种量接种至加入有质量含量为2-5％SiO2或MnO2粉末的MSVP培养基，pH为7.25-7.3，吸附12-36h；
(3)将步骤(2)所得菌液以10-15％的体积比加入5-8％质量浓度的海藻酸钠溶液中，得到菌体包埋液；
(4)将所述菌体包埋液缓慢加入质量浓度为5-8％CaCl2交联液中，交联凝固成球，经无菌水洗涤得到所述微生物菌剂的固定化小球。
8.一种如权利要求7所述制备方法制得的微生物菌剂的固定化小球，以二氧化硅/二氧化锰和海藻酸钠的交联聚合产物为载体，包埋微生物菌剂而形成的凝胶小球。
9.一种如权利要求5所述的微生物菌剂在降解地下水苯酚污染中的应用。
10.一种如权利要求8所述制备方法制得的微生物菌剂的固定化小球在降解地下水苯酚污染中的应用。
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