CN104593350A

CN104593350A - 一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104593350A
Application number: CN201410808473.4A
Authority: CN
Inventors: 郭书海; 李凤梅; 王卅; 吴波
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用。酶制剂为具有芳烃降解功能的土著微生物经发酵培养后超声破碎提取胞内混合物，再经固定化处理制成酶剂；其中，具有芳烃降解功能的土著微生物为荧光假单胞菌，已于2011年7月22日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2011260。本发明的酶制剂的应用较菌体高效、快速，且无二次污染，为有机污染物的环境污染治理提供一种新的生物修复途径和思路。

Description

一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用。

背景技术

芳烃类物质作为一种分子中含有苯环结构的碳氢化合物，土壤环境中因富含有机质，芳烃的亲脂性使其常被吸附在土壤颗粒表面，减弱了其可降解性；低分子量的芳烃类物质易挥发，具有一定的水溶性，亲脂性差，是水体污染的主要部分之一。关于土壤及水体中芳烃类有机污染物修复方法研究已广泛开展，包括化学修复、生物修复及化学-生物联合修复等多种方式。生物修复中以微生物强化修复措施的研究和应用最为广泛。然而，依靠微生物代谢有机污染物的方式进行有机污染治理存在周期较长，微生物群落易变等劣势，微生物群落的演替使该方法很难保证稳定的芳烃降解能力；再有，外源微生物物种的添加存在潜在的生态风险，即改变固有微生物群体结构，破坏原有生境状态。

生物酶剂修复技术是人为提取具有降解功能的微生物细胞内的降解酶类，依赖于酶对有机污染底物的直接催化加氧等作用达到高效快速降解污染物的目的，避免了有机物分子转移进入微生物细胞内进行代谢的耗时过程，有效解决了功能微生物群落难以稳定持续存在的问题，同时回避了外源微生物群落入侵等造成的二次污染问题。酶制剂应用的理论基础源于人们对微生物代谢石油污染物的代谢通路的认知。芳烃作为石油组成成分的一种，主要以加氧氧化的方式开始被降解的过程。其中，真菌和细菌分别以单加氧和双加氧的方式将空气中的氧添加到芳烃的环状结构内，形成单、双羟基化的中间分子，再通过C-O键的断裂步骤开启开环降解的过程，并结合脱氢、加氢、水解、水合、脱羧、乙酰化等步骤逐级代谢，最终将芳烃大分子完全矿化为CO₂和H₂O。在矿化的整个酶促反应过程中，第一步的芳烃开环反应被认为是限速步骤，而原核生物体的开环催化反应多由多组件形成的酶体复合物及辅酶的共同参与完成，各组成成员接力完成递H和加氧的过程。由此，在多环芳烃生物代谢的全过程中，需要单、双加氧酶(包括NADH辅酶、铁硫氧化还原蛋白、铁硫氧化还原蛋白还原酶、加氧活性中心)、脱氢酶、水解酶、水合酶、乙酰化酶等多种酶体或酶系的共同参与。鉴于此，在有机污染治理的工程应用中以原核生物细胞内的混合发酵酶液作为研究对象，可以涵盖多种芳烃代谢通路中的关键酶类，达到广泛深度代谢的效果。

酶作为生物蛋白类的活性物质，离体条件下易受极端环境影响而失去功能。生物固定化技术通过载体材料对降解酶的固定化作用，有效增强生物酶对离体环境的冲击，提高对极端pH、极端温度等条件的耐受能力。同时，降解酶经固定化所形成的酶剂提高了污染环境中降解酶类的分布密度，疏松多孔的载体结构又具有较高的吸附有机物分子的能力，从而有效提高酶剂活性位点与污染底物的接触几率，在延长生物蛋白酶寿命的同时提高对底物的降解效率。目前，酶固定化的方法包括吸附法(物理吸附和离子吸附)、包埋法(脂质体包埋、微囊型包埋和网格型包埋)、交联法和共价键结合法等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种芳烃降解酶制剂，酶制剂为具有芳烃降解功能的土著微生物经发酵培养后超声破碎提取胞内混合物，再经固定化处理制成酶剂；其中，具有芳烃降解功能的土著微生物为荧光假单胞菌，已于2011年7月22日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2011260。

一种芳烃降解酶制剂的制备方法，将具有芳烃降解功能的土著微生物进行诱导发酵培养，发酵物进行超声处理破碎细胞，而后离心收集上清液得芳烃降解粗酶液，粗酶液经固定化处理即为芳烃降解酶制剂。

所述诱导发酵培养是将具有芳烃降解功能的土著微生物在牛肉膏蛋白胨液体培养基中于28-30℃、160-180 rpm/min的条件下进行小量振荡培养，培养至对数生长期，离心、清洗并收集菌体，用与菌体等体积的磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)重悬后按1-5％(v/v)的接种量将菌液接种至芳烃降解菌无机盐发酵培养基中，于32-35℃培养至OD₆₀₀值为2-5，以7500-8500rpm/min离心收集菌体；上述收集的菌体采用磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)清洗，再以7500-8500rpm/min离心收集菌体，而后加入Tris-EDTA缓冲液重悬菌体，当菌悬液OD₆₀₀值为1时进行超声破碎30-35min，超声在冰浴条件下进行，超声功率为180-250W，超声破碎后离心收集上清液即得芳烃降解菌粗酶液，粗酶液经固定化处理即为芳烃降解酶制剂。

所述固定化处理是将粗酶液与固定化载体活性炭以质量比为1:200-1:250的比例进行混合，4-6℃条件下固定8-10h，即得芳烃降解酶制剂。

所述芳烃降解菌无机盐发酵培养基成分为：0.5g/L NaCl，0.2 g/L MgSO₄，1.0g/L(NH₄)₂SO₄，2.75g/L K₂HPO₄，2.25g/L KH₂PO₄，0.02g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，1ml微量元素，pH 7.0，1g/L葡萄糖、50ppm菲、50ppm芘和50ppm苯并芘。

所述，微量元素为MnSO₄·H₂O，35.5mg/L，ZnSO₄·H₂O，42.8mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，32.5mg/L。

所述Tris-EDTA缓冲液，其成分为：50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100。

一种芳烃降解酶制剂的应用，所述酶制剂作为污染环境中的芳烃降解酶制剂，用于治理污染环境。

所述酶制剂用于降解污染水体或土壤中的芳烃，进而达到修复的目的。

所述酶制剂与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)按质量比为1:4-1:5的比例混合后，施用于污染水体或土壤中进行降解芳烃，进而达到修复的目的。

本发明所具有的优点：

本发明酶制剂以长期受石油污染驯化的土著细菌微生物为主要原料经发酵获得，来源经济、可靠，克服了传统微生物修复速率较慢、稳定性差的缺陷；在使用过程中添加辅助因子，提高了菌体代谢效率，能够安全修复芳烃污染水体和土壤，且无二次污染，为有机污染物的环境污染治理提供一种新的生物修复途径和思路。

附图说明

图1为本发明实施例提供的添加NADH辅助芳烃降解酶剂对水中芳烃降解效果图，其中，箭头所指处为不同处理下降解速率减慢的拐点时刻。

图2为本发明实施例提供的添加NADH辅助芳烃降解酶剂对土壤芳烃降解效果图，其中，箭头所指处为不同处理下降解速率减慢的拐点时刻。

图3为本发明实施例提供的电动-酶组合处理菲和芘共同污染土壤效果图。

具体实施方式

以下的实施例进一步详述本发明的相关内容，便于对本发明进行更好地理解，但不限定本方法。下述实施例中的试验方法均为生物培养及有机物质提取所用的常规方法。

微生物培养所用培养基为牛肉膏/蛋白胨培养基、无机盐培养基，所用缓冲液包括磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)，Tris-EDTA缓冲液(50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100)，上述均可通过市售获得。

实施例1、芳烃降解酶剂的制备及其降解活性测定

1、芳烃降解酶的制备

(1)菌种活化及种子液培养

挑取芳烃降解菌株的单克隆菌落，加入到15ml牛肉膏蛋白胨培养基培养基内，30℃160rpm/min摇床培养24h，获得种子液。所述降解菌株为土著功能微生物的荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)，其于2011年7月22日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2011260。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。

(2)芳烃降解菌株发酵培养

将种子液以8000rpm/min条件下离心5min收集菌体，菌体经磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)清洗菌体两次，离心后用与菌体等体积磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)重悬菌体配置成菌悬浮液，参照5％(v/v)的接种量将菌液接入100ml/瓶的无机盐发酵培养基内，每升发酵培养基内在加入1g葡萄糖和50mg的作为碳源和降解酶诱导剂的石油柱层析分离的芳烃组分，而后在180rpm/min 32℃培养48h。测定发酵液OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到3时，结束发酵。发酵液在8000rpm/min条件下离心5min收集菌体，将菌体经磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)清洗两次，再在8000rpm/min条件下离心收集菌体，而后加入Tris-EDTA缓冲液(50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100)重悬菌体，当重悬菌液OD₆₀₀值为1时备用。

(3)菌体细胞内粗酶液的提取

重悬菌体在冰浴条件下超声破碎处理，处理条件为180W功率下超声3S，停止3S，共35min，破碎后以8500rpm/min离心10min收集上清液即得芳烃降解菌粗酶液。

(4)考马斯亮蓝法(Bradford法)测定粗酶液蛋白质浓度

标准蛋白质溶液采用牛血清清蛋白(BSA)配制成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。

考马斯亮蓝染料溶液的配置选用考马斯亮蓝G-250染料，称取100mg该染料粉末，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用水稀释至1L，棕色瓶保存。

取多支试管，分别按照表1所示的方法加入上述芳烃降解菌粗酶液样品、水和染料试剂，混合液震荡混合后暗条件下反应5min，使用分光光度计在OD₅₉₅下测定吸光值，采用浓度值为0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/L的标准蛋白样品制作标准曲线，经测定粗酶液蛋白浓度为1.122mg/L。

表1考马斯亮蓝法测定蛋白浓度标准曲线制作及粗酶液浓度测定

(5)酶液的固定化

酶液固定化采用物理吸附法，选用硅藻土作为载体，根据前述方法计算表1中不同粗酶液中蛋白质浓度，而后将表1中不同粗酶样品与载体，按照1:250的粗酶与载体的质量比进行混合，再加入磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)，磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)体积以浸没载体为宜，混合物在4℃条件下固定10h以上即可，固定后以6500rpm/min离心10min分别收集沉淀和上清液，沉淀用等体积磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)清洗，清洗后以6500rpm/min离心，所得上请液与上述离心获得的上清液合并，采用考马斯亮蓝法测定上述合并的2倍稀释的上清液中蛋白质浓度，经计算可得到固定化粗酶的实际浓度，再使用Tris-EDTA缓冲液(50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100)重悬离心后的沉淀即得芳烃高效降解酶酶剂。

2、芳烃降解酶降解水相体系中芳烃的活性测定

水相体系中酶液降解芳烃活性测定体系为：2mg降解酶制剂、20ml 0.2M pH7.5 PBS、100ppm石油柱层析分离的芳烃组分(1mg)，8mg辅酶(NADH，其辅酶与降解酶的质量比4:1)，反应体系pH为7.5；

实验组：2mg降解酶制剂、20ml 0.2M pH7.5 PBS、100ppm石油柱层析分离的芳烃组分(1mg)，反应体系pH为7.5；

对照组：2ml Tris-EDTA缓冲液(50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100)、20ml 0.2M pH7.5PBS、100ppm石油柱层析分离的芳烃组分(1mg)，反应体系pH为7.5；

上述各体系于32℃反应6h。

水相中芳烃的残留采用有机相-水相间的液液萃取法进行测定，选用二氯甲烷：正己烷(2:1)的混合物进行萃取，经浓缩、干燥、正己烷定容等步骤，采用紫外分光光度法测定254nm波长下的吸光值，通过标准曲线法进行芳烃定量。

测定结果如图1所示，酶制剂可以有效去除水中芳烃污染物，处理8h后单独加酶处理(En)水中芳烃的去除率达到35.6％，而加酶和NADH(En-NADH)处理水中芳烃的去除率显著提高，达到了43.5％,降解率提高22.2％。另从图中也可以看出NADH的添加延长了芳烃降解作用时间和降解程度，使酶的作用在6h后得到延续，反映了辅酶添加对芳烃降解酶作用的促进和增强。

3、芳烃降解酶降解土壤中芳烃的活性测定

土壤体系中酶液降解芘活性测定体系为：2mg降解酶制剂、5g100ppm石油柱层析分离的芳烃组分污染土壤、8mg辅酶(NADH，其辅酶与降解酶的质量比4:1)，适量0.2M pH7.5 PBS；

实验组：2mg降解酶制剂、5g 100ppm石油柱层析分离的芳烃组分污染土壤、适量0.2M pH7.5 PBS；

对照组：2ml Tris-EDTA缓冲液(50mM pH 7.9 Tris、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100)、5g 100ppm石油柱层析分离的芳烃组分污染土壤、适量0.2M pH7.5 PBS；

将上述各体系以32℃分别反应2、4、6、8、10、12、14、16h，分析降解效率。

土壤中芳烃的提取方法参照US EPA 3550C方法并做适当改进，取0.5g土壤样品进行有机萃取，检测步骤同2中所述。

酶制剂可以有效去除污染土壤中芳烃污染物，处理12h后单独加酶处理(En)土壤中芳烃的去除率达到36.1％，而加酶和NADH(En-NADH)处理水中芳烃的去除率显著提高，达到了42.9％,降解率提高18.8％。酶剂单一处理8h后降解效率达到最大，NADH促进芳烃污染物的进一步降解达12h的作用时长，反映了辅酶添加对芳烃降解酶作用的促进和增强。

实施例2、电动-芳烃降解酶剂组合式修复菲和芘共同污染土壤

采用电动修复与上述实施例获得的芳烃高效降解粗酶液组合的方式进行芳烃污染土壤修复

试验中采用恒定连续切换电场进行菲和芘共同污染土壤的修复，污染土壤初始芘和菲含量各自均为100ppm，初始pH为6.85，试验在20×10×8cm³的聚氯乙烯塑料盒中进行，电动修复处理20天后采用上述实施例获得的芳烃高效降解粗酶液进行降解处理。

试验结果表明，电动处理(EK-35 d)35d后的土壤中芘和菲的去除率分别达到24.6％和29.98％，酶剂(En-8h处理8h后芘和菲的去除率分别为22.1％和27.3％，反映了酶剂降解的高效性；当电动与酶剂(EK-35d+En-8h)接力处理污染土壤时，芘和菲的总去除率分别达到41.7％和52.4％，由此表明电动与酶剂的联合接力修复方式可到达高效节能的去除土壤中芳烃污染物的目的。

Claims

1.一种芳烃降解酶制剂，其特征在于：酶制剂为具有芳烃降解功能的土著微生物经发酵培养后超声破碎提取胞内混合物，再经固定化处理制成酶剂；其中，具有芳烃降解功能的土著微生物为荧光假单胞菌，已于2011年7月22日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2011260。

2.一种权利要求1所述的芳烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：将具有芳烃降解功能的土著微生物进行诱导发酵培养，发酵物进行超声处理破碎细胞，而后离心收集上清液得芳烃降解粗酶液，粗酶液经固定化处理即为芳烃降解酶制剂。

3.按权利要求2所述的芳烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述诱导发酵培养是将具有芳烃降解功能的土著微生物在牛肉膏蛋白胨液体培养基中于28-30℃、160-180rpm/min的条件下进行振荡培养，培养至对数生长期，离心、清洗并收集菌体，用与菌体等体积的磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)重悬后按1-5％(v/v)的接种量将菌液接种至芳烃降解菌无机盐发酵培养基中，于32-35℃培养至OD₆₀₀值为2-5，以7500-8500rpm/min离心收集菌体；上述收集的菌体采用磷酸盐缓冲液(PBS 0.2M pH7.5)清洗，再以7500-8500rpm/min离心收集菌体，而后加入Tris-EDTA缓冲液重悬菌体，当菌悬液OD₆₀₀值为1时进行超声破碎30-35min，超声在冰浴条件下进行，超声功率为180-250W，超声破碎后离心收集上清液即得芳烃降解菌粗酶液，粗酶液经固定化处理即为芳烃降解酶制剂。

4.按权利要求3所述的芳烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述固定化处理是将粗酶液与固定化载体活性炭以质量比为1:200-1:250的比例进行混合，4-6℃条件下固定8-10h，即得芳烃降解酶制剂。

5.按权利要求3所述的芳烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述芳烃降解菌无机盐发酵培养基成分为：0.5g/L NaCl，0.2g/LMgSO₄，1.0g/L(NH₄)₂SO₄，2.75g/L K₂HPO₄，2.25g/L KH₂PO₄，0.02g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，1ml微量元素，pH 7.0，1g/L葡萄糖、50ppm菲、50ppm芘和50ppm苯并芘。

6.按权利要求3所述的芳烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述Tris-EDTA缓冲液，其成分为：50mM pH 7.9Tris、0.5mMEDTA、50mM NaCl、5％甘油、1％Triton X-100。

7.一种权利要求1所述的芳烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂作为污染环境中的芳烃降解酶制剂，用于治理污染环境。

8.按权利要求7所述的芳烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂用于降解污染水体或土壤中的芳烃，进而达到修复的目的。

9.按权利要求7所述的芳烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)按质量比为1:4-1:5的比例混合后，施用于污染水体或土壤中进行降解芳烃，进而达到修复的目的。