CN110760460B - 一种可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂及应用。所述复配菌剂包括保藏号为CCTCC NO:M2019423的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJB18046和保藏号为CCTCC NO:M2019424的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB18047。使用本发明复配菌剂能够对餐厨垃圾中的高浓度油脂组分,尤其对较难降解的长链脂肪酸酯实现高效降解。
Description
技术领域
本发明涉及生物降解技术领域,特别是涉及一种可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂及应用。
背景技术
餐厨垃圾指食物在加工处理(包括烹煮)后所剩的部分(如菜叶、果皮、果渣等)或者消费食物的过程中产生的食物废料、餐饮剩余物、食品加工废料以及各类油水混合物,是城市生活垃圾的主要组成部分之一。近年来,我国餐厨垃圾年产生量不断增加,环境处理负担日益加重,全国三分之二的城市面临垃圾围城现状,亟需要建立一种高效、可控的餐厨垃圾减量化、无害化处理技术。传统的厌氧堆肥技术存在发酵周期长、腐熟度低;厌氧发酵处理设备要求高,工艺复杂,对村、镇等餐厨垃圾产生密度低、集中处理成本高的地区适用性较差。
近年来,微生物好氧堆肥原位减量技术成为餐厨垃圾高效减量化处理的新举措。微生物好氧堆肥处理技术是在有氧条件下,利用好氧微生物对餐厨垃圾进行氧化、分解,实现高效降解,是一种传统好氧堆肥技术与外源微生物强化结合的现代堆肥技术。我国餐厨垃圾油脂比例高(约占干基25-30%),且大部分组分为较难降解长链脂肪酸(如亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸等)与甘油形成的油脂,其在餐厨垃圾中的含量会显著影响餐厨垃圾的粘度,降低堆肥过程的物质交换及处理效率,最终导致处理周期长、发酵腐熟度低等问题。
目前,餐厨垃圾油脂降解仍面临复合菌剂中降解菌株种类多,制备成本高,但总体效率低,处理周期较长等局限。近年来,针对餐厨垃圾油脂降解开展了系列研究,包括油脂降解菌株的筛选及复配,降解工艺的优化等策略。田兴平等(CN102586112 A)将芽孢杆菌属和假丝酵母属作为脂肪降解菌,与淀粉降解菌、纤维素降解菌、蛋白质降解菌作为菌剂降解餐厨垃圾,10天后降解率为78%;宋建国等(CN103756941 A)将产脂肪酶地衣芽孢杆菌CICC21085作为脂肪降解菌,与其他降解菌(蛋白、淀粉、纤维素降解菌)协同添加后应用于餐厨垃圾的降解,但未具体阐述油脂组分的降解过程。刘可星等(CN109022306A)制备了针对污水处理过程的油脂降解菌剂,利用地衣芽孢杆菌∶枯草芽孢杆菌∶解阮假丝酵母菌∶假丝酵母菌复配比率为5~10∶10~20∶10~15∶5~20比例制备得到油脂降解微生物复合菌剂,在最适降解条件下(3%接种量,30℃培养温度,油脂降解培养基初始pH=7.0),降解3天后10g/L油脂的降解率为90%。综上所述,餐厨垃圾微生物减量化处理中,油脂组分的减量处理仍面临降解周期长,效率低的瓶颈,成为微生物降解餐厨垃圾快速减量化的关键限制步骤。因此,高效油脂降解菌剂的制备与应用是实现餐厨垃圾快速减量化处理的突破口。
发明内容
本发明通过高油脂培养基条件下的多轮次筛选,获得了具有较好餐厨垃圾降解油脂能力的优势菌株,并结合脂肪酶活力、油脂降解率及长链脂肪酸降解产物分析等多参数评价餐厨垃圾油脂降解过程,筛选并制备了具有高效协同降解油脂能力的复配菌剂,并应用于高浓度油脂组分餐厨垃圾的快速减量化降解,具体内容包括:
一种可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂,包括一株解淀粉芽孢杆菌和一株恶臭假单胞菌,其中,解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZJB18046,保藏号为CCTCC NO:M2019423,恶臭假单胞菌命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJB18047,保藏号为CCTCC NO:M2019424。上述菌株于2019年6月4日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
优选的,复配菌剂中所述解淀粉芽孢杆菌和恶臭假单胞菌重量比为1∶0.5~2。最优选的,两种菌株的重量比为1∶1。
本发明又提供了所述复配菌剂在降解餐厨垃圾油脂组分中的应用。
优选的,待降解的餐厨垃圾油脂的脂肪酸为碳链长度不小于C18的长链脂肪酸。
本发明还提供了一种餐厨垃圾降解方法,所述餐厨垃圾含油脂组分,使用所述的复配菌剂降解餐厨垃圾。
优选的,所述复配菌剂的加入量至少为待处理餐厨垃圾重量的1%。降解时间不少于48h。
优选的,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度不超过8%。当餐厨垃圾中含油量不超过8%时,油脂降解率较高。更优选的,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度为1%~8%。进一步优选的,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度为1%~4%。最优选的,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度为1%~2%。当餐厨垃圾中含油量为1%~2%时,油脂降解率能够达到70%以上。
本发明可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJB18046和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB18047复配所得,能够对餐厨垃圾中的高浓度油脂组分,尤其对较难降解的长链脂肪酸酯实现高效降解。
说明书附图
图1各菌株脂肪酶活力比较
图2单一菌株与复配菌株对橄榄油的降解率
图3单一菌株与复配菌株对餐厨垃圾油酯的降解率
图4复合菌剂降解餐厨垃圾油脂过程中长链脂肪酸降解产物分析
具体实施方式
实施例1
油脂降解优势菌种的筛选与鉴定。
(1)透明圈平板实验初筛脂肪酶活力
取土样10g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中,30℃,200r/min震荡30min,在超净台中进行菌悬液梯度稀释,浓度梯度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。吸取200μL各浓度的菌悬液接种于LB固体培养基平板上(LB固体培养基:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%,pH为7,琼脂2%、水1L,pH自然)。
用封口膜将平板封口后倒置,放于37℃恒温培养箱中培养24h。在菌落数合适的平板上,挑选单菌落,经分离纯化后,分别接种至脂肪鉴别培养基平板上,其中脂肪鉴别培养基组分为:(NH4)2SO4 2g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,琼脂20g,水1L,pH自然;橄榄油乳化液12mL(橄榄油20g与聚乙烯醇(PVA)60g混合,转速10000r/min,5min),加溴甲酚紫0.8mL。均匀涂布菌液后,将培养皿用封口膜封口后倒置放于37℃恒温培养箱中。培养24h后,通过观察和计算透明圈的直径和菌落直径比,筛选直径比值较大的菌株,分别接种至LB液体培养基。培养24h后,取适量菌液用30%甘油保藏于-80℃冰箱;取部分菌液进行生理生化和分子生物学鉴定。
用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取DNA,扩增引物为细菌16s RNA的通用引物:
27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3';
1492R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
PCR扩增后送样测序,将获得的DNA序列用Blast程序与数据库中的序列进行比对,选择合适的DNA序列建立系统发育树,再结合形态、生理生化鉴定结果,确定其种属。
(2)比色法测定脂肪酶活力及脂肪降解菌株复筛
筛选获得脂肪酶活力较高的菌株,进一步划线分离得到单一菌落,接种至降解培养基(橄榄油1%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l)加水100ml,于45℃摇床震荡培养48小时,发酵液4℃,8000r/min离心10min,取上清测定脂肪酶酶活。采用对硝基苯酚法测定上清液中的脂肪酶活力:溶液A组分:0.062g棕榈酸对硝基苯酚酯(p-Nitrophenyl palmitate)加入至10ml异丙醇中,超声6min;溶液B组分:1.51gTris完全溶解到200ml蒸馏水中,依次加1ml triton X-100、0.25g阿拉伯胶、0.72ml浓HCl,定容至250ml。取0.45ml A液加入至4.05ml B液中,加入1mol/l CaCl2 10μL,45℃预热5-10min,在样品中加入0.5ml酶液(对照组加入100℃水浴处理15min的失活酶液),然后45℃恒温水浴10min,后在0℃冰上放置5min终止反应。酶活力定义:55℃,pH为7.0时,1ml上清液每分钟水解油脂产生1μmol的可滴定的脂肪酸,即为1个酶活力单位,以“U”表示。
通过透明圈初筛和脂肪酶活力复筛的结果,如图1所示。筛选所得脂肪酶活力较高的菌株分别为:恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(16s RNA序列如SEQ ID No.2所示)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(16s RNA序列如SEQ ID No.1所示)。
将筛选所得解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌ZJB18046,于2019年6月4日保藏于位于中国武汉武汉大学的典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC NO:M2019423;恶臭假单胞菌命名为恶臭假单胞菌ZJB18047,于2019年6月4日保藏于位于中国武汉武汉大学的典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC NO:M2019424。
实施例2
油脂降解菌株的培养、复配及其在橄榄油降解中的应用。
①斜面培养
恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB斜面上,37℃恒温培养24h,进行菌株活化培养。
②液体培养
所得活化后的恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB液体培养基,分别于37℃、150r/min摇床振荡培养24h;分别得恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046种子液。
③降解处理:
将步骤②所得的恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046种子液按接种量浓度稀释成为OD600为0.5,吸取的解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047=1∶1(0.5ml∶0.5ml)、2∶1(0.66ml∶0.33ml)、1∶2(0.33ml∶0.66ml)的比例分别接种到降解培养基(橄榄油1%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水至100ml),45℃、150r/min处理48h。步骤③所降解的液体在8000r/min、10min、4℃条件下离心取上清液,用40ml石油醚萃取,然后通过脂肪测定仪(SOX406)测定剩余油脂含量。
油脂降解率(%)=(A-B)/A×100%
其中,A:投入降解培养基中的油脂重量(g);B:处理完成后油脂的重量(g)。根据公式计算得到以下结果:单一菌株降解条件下,仅接种恶臭假单胞菌ZJB18047的油脂降解率为69.89%;仅接种解淀粉芽孢杆菌ZJB18046的油脂降解率为61.98%,在复配条件下,解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047接种量按1∶1处理后,降解率为80.39%;解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047接种量按2∶1时,降解率为70.81%;解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047接种量按1∶2时,降解率为75.69%(图2)。以上结果显示,通过解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047的协同降解(最适添加比例为1∶1),能够显著促进橄榄油的降解效率。
实施例3
油脂复配菌剂在餐厨垃圾油脂组分降解中的应用。
①斜面培养
恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB斜面上,37℃恒温培养24h,进行菌株活化培养。
②液体培养
所得活化后的恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046分别接种于LB液体培养基,分别于37℃、150r/min摇床振荡培养24h;分别得到恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046种子液。
③降解处理
将步骤②所得的解淀粉芽孢杆菌ZJB18046、恶臭假单胞菌ZJB18047种子液用LB培养基分别稀释菌液浓度至OD600=0.5,分别取0.5ml菌液接种到降解培养基(餐厨垃圾油1%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml),45℃、150r/min,降解48h。
步骤③所降解的液体在8000r/min、10min、4℃条件下离心取上清液,用40ml石油醚萃取,然后脂肪测定仪(SOX406)上测定剩余油脂含量。
单一菌株降解条件下,仅有恶臭假单胞菌ZJB18047的降解率为53.47%,仅有解淀粉芽孢杆菌ZJB18046的降解率为45.89%。在复配条件下,解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047接种量1∶1的条件下,降解率为74.84%(图3)。
实施例4
油脂复配菌剂在餐厨垃圾不同浓度油脂组分降解中的应用。
①斜面培养
恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB斜面上,37℃恒温培养24h,进行菌株活化培养。
②液体培养
所得活化后的恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB液体培养基,分别于37℃、150r/min摇床振荡培养24h;分别得恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046种子液。
③降解处理
将步骤②所得的解淀粉芽孢杆菌ZJB18046、恶臭假单胞菌ZJB18047种子液按1∶1的接种比例分别接种到降解培养基(餐厨垃圾油2%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml)、(餐厨垃圾油4%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml)、(餐厨垃圾油6%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml)、(餐厨垃圾油8%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml)混菌的总投入量为1%(质量比),45℃、150r/min,降解48h。
步骤③所降解的液体在8000r/min、10min、4℃条件下离心取上清液,用40ml石油醚进行萃取,然后脂肪测定仪(SOX406)上测定剩余油脂含量。
餐厨垃圾含油量为2%时,油脂降解率为70.87%;餐厨垃圾含油量为4%时,油脂降解率为65.49%;餐厨垃圾含油量为6%时,油脂降解率为62.47%;餐厨垃圾含油量为8%时,油脂降解率为58.96%。
实施例5
复配菌剂显著促进餐厨垃圾油脂组分长链脂肪酸酯的降解。
(1)培养菌体
①斜面培养
恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB斜面上,37℃恒温培养24h,进行菌株活化培养。
②液体培养
所得活化后的恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046接种于LB液体培养基,分别于37℃、150r/min摇床振荡培养24h;分别得恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046种子液。
③不同脂肪酸链降解率的测定
将步骤②所得的解淀粉芽孢杆菌ZJB18046、恶臭假单胞菌ZJB18047种子液以及按解淀粉芽孢杆菌ZJB18046∶恶臭假单胞菌ZJB18047接种量为1∶1分别以1%的接种量接种到降解培养基中:橄榄油1%,酵母粉3%,蔗糖3%,硫酸钙0.1g/l,磷酸二氢钾0.5g/l,硫酸镁0.1g/l,加水100ml。在45℃,分别在6、12、24、48h条件下取样。每个样品取10ml,进行甲酯化。甲酯化操作过程如下:配制2mol/l氢氧化钾溶液,称取13.1g氢氧化钾用100ml甲醇溶解,取10ml样品溶于4ml乙酸乙酯中,加入0.2ml氢氧化钾溶液,2 000r/min混匀30s,静置5min,5 000r/min离心5min。取上清液放入EP管,再进行气相色谱检测。气相色谱方法为载气:氮气;进样口温度:220℃,分流进样,分流比为10∶1;检测器温度:250℃,尾吹流量(N2):25ml/min;程序升温方法:初温75℃,以10℃/min升至165℃,保持1.5min,以1.5℃/min升至185℃,保持5min,以1.5℃/min升至195℃,保持5min,以3.2℃/min升至240℃,保持8min;载气流速(N2):0.9ml/min;进样量:1.0μl。
油脂脂肪酸链的气相色谱分析显示(图4),0h时亚油酸(碳链长度为C18)、花生四烯酸(碳链长度为C20)、γ-亚麻酸(碳链长度为C18)的含量分别为91.0μg/ml、77.5μg/ml、99.3μg/ml;处理6h后,其亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸含量分别为448.5μg/ml、526.5μg/ml、494.4μg/ml;处理12h后,其亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸含量分别为1678.4μg/ml、1889.4μg/ml、1889.3μg/ml。上述结果表明,在降解处理前12h,餐厨垃圾油脂组分被脂肪酶快速水解释放,且主要组分为碳链长度大于等于C18的长链脂肪酸;24h处理后,油脂组分中亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸含量分别为152.0μg/ml、149.6μg/ml、167.5μg/ml。当处理48h后,亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸分别为158.2μg/ml、146.7μg/ml、174.1μg/ml,长链脂肪酸的含量在12-24h处理后显著降低,表明侧链脂肪酸在该阶段被快速地β氧化分解,从而完成了餐油的快速降解。在单一菌株处理的对照组中,油脂组分中仍残留较大量的亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸。单一解淀粉芽孢杆菌ZJB18046降解24h后,亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸含量分别为833.1μg/ml、740.9μg/ml、984.6μg/ml,48h后含量分别为367.9μg/ml、330.9μg/ml、426.1μg/ml;单一恶臭假单胞菌ZJB18047降解24h后,亚油酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸含量分别为534.3μg/ml、499.3μg/ml、637.6μg/ml,48h后含量分别为260.6μg/ml、256.3μg/ml、271.9μg/ml。以上结果表明,通过恶臭假单胞菌ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌ZJB18046的协同复配,餐厨垃圾的油脂组分在处理前期(0-12h)被分泌的脂肪酶快速水解为甘油和脂肪酸,在处理后期(12-24h),长链脂肪酸被快速地β氧化分解。进一步表明通过恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB18047、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJB18046菌种的复配,能够显著加速餐油中甘油三酯的水解及长链脂肪酸氧化降解进程。该方法提供的复配菌剂能够有效利用于含油量较高的餐厨垃圾的降解。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种可高效降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
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<210> 2
<211> 1404
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 2
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atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140
agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt 1200
cgccaagccg cgaggtggag ctaatctcac aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1260
caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcga atcagaatgt cgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caccagaagt 1380
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaggaggtga tccagccgca 20
Claims (8)
1.一种可降解餐厨垃圾油脂组分的复配菌剂,其特征在于,由一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ) 和一株恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida ) 组成,其中,解淀粉芽孢杆菌命名为解淀粉芽孢杆菌ZJB18046,保藏号为CCTCC NO:M2019423,恶臭假单胞菌命名为恶臭假单胞菌ZJB18047,保藏号为CCTCC NO:M2019424,
所述解淀粉芽孢杆菌和恶臭假单胞菌重量比为1∶0.5~2。
2.如权利要求1所述复配菌剂在降解餐厨垃圾油脂组分中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,待降解的餐厨垃圾油脂组分中脂肪酸为碳链长度不小于C18的长链脂肪酸。
4.一种含油脂组分的餐厨垃圾的降解方法,其特征在于,使用如权利要求1所述的复配菌剂对含油脂组分的餐厨垃圾进行降解。
5.如权利要求4所述的含油脂组分的餐厨垃圾的降解方法,其特征在于,所述复配菌剂的加入量至少为待处理餐厨垃圾重量的1%。
6.如权利要求4所述的含油脂组分的餐厨垃圾的降解方法,其特征在于,降解时间不少于48h。
7.如权利要求4所述的含油脂组分的餐厨垃圾的降解方法,其特征在于,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度为1%~8%。
8.如权利要求7所述的含油脂组分的餐厨垃圾的降解方法,其特征在于,所述餐厨垃圾中油脂的质量浓度为1%~4%。
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