CN108823119A - 一种解淀粉芽孢杆菌及菌剂和其在处理餐厨垃圾中的应用 - Google Patents
一种解淀粉芽孢杆菌及菌剂和其在处理餐厨垃圾中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18，其保藏编号为CCTCC NO：M2018135，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了一种解淀粉芽孢杆菌的制备方法及其液体菌剂和固体菌剂以及其在处理餐厨垃圾中的应用。本发明可以对在餐厨垃圾中含量较高的淀粉和蛋白能够快速降解并抑制臭味的产生，可以用于餐厨垃圾的快速处理，实现餐厨垃圾的快速生物减量化和稳定化。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌及菌剂和应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高与餐饮行业的不断发展，餐厨垃圾的数量也呈逐年增长趋势，占城市生活垃圾的近一半，若不能妥善处理，厨余垃圾会污染环境、滋生蚊蝇、造成疾病传播，以致危害人类健康。餐厨垃圾主要来源于剩余食物，其中含水率达70％，因此不适合采用焚烧的方式处理，而卫生填埋会占用大量的土地资源，因此餐厨垃圾处理问题随着餐厨垃圾数量的不断增大变得日趋严重。生物处理方式已经成为餐厨垃圾处理的首选方式，但餐厨垃圾还通常含有高盐分、高蛋白、高碳水化合物和高油脂含量的特点，采用生物处理方式时容易产生臭味。因此最重要的是分离筛选适宜的餐厨垃圾处理微生物菌株，能进行高效的餐厨垃圾降解，快速将餐厨垃圾中的有机质降解成为水和二氧化碳，实现餐厨垃圾的减量化和无害化，并且同时抑制产生臭味的微生物的生长，减少餐厨垃圾处理过程中臭味的产生。
目前，生物处理以生物快速降解技术为核心，但需要垃圾分类收集等过程。而生物处理主要有两个方向，一个生物处理能源化研究；例如江苏洁净环境科技有限公司(张龙生等，2009)研究的回收餐厨垃圾中的油质成分转化生物柴油，韩国科学院的Sunkeehan研究组(2004)将垃圾转化制氨气，而中国方面中科院的肖本益研究员(2004)发明了两相厌氧发酵技术，提高了餐厨垃圾中有机质生物质能的回收，国外还有回收餐厨垃圾发酵产玻巧酸和了二酸钢的报道(Doyle et al，1982)，这些研究工作为餐厨垃圾的能源化研究提供了很多有益的探索，但是因为生物新能源的应用还有很多瓶颈性问题，因此目前这些研究多仍然停留在科研层面。而另一个方向是生物发酵资源化处理，目前生产上普遍应用得到认可的就是餐厨垃圾的堆肥化应用，餐厨垃圾丰富的营养物质能满足微生物生长的营养需求，非常适用于用作堆肥原料，堆肥技术很早就出现，但是现在，仍然有很多问题需要研究，如何选育搭配高效快速的降解菌种，如果保藏菌种，使其得以商品化，如何去除餐厨垃圾降解过程中对于环境的污染，如何适应社会上对于餐厨垃圾堆肥处理规模的多个要求等等。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌，可以对在餐厨垃圾中含量较高的淀粉和蛋白能够快速降解并抑制臭味的产生，可以用于餐厨垃圾的快速处理，实现餐厨垃圾的快速生物减量化和稳定化。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18，其保藏编号为CCTCCNO：M2018135，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
作为进一步的方案，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌体为短小的杆状菌，可产芽孢，菌落形态为中间凹陷，周围突起的火山口状菌落，周围周围粗糙且不规则，在生长后期表面非常粗糙，且中间凹陷不明显。
本发明的第二个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，该菌剂含有本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，具体方案如下：
一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18的浓度为109CFU/mL-1010CFU/mL。
本发明的第三个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，包括
发酵步骤：用平板活化培养基将冻存的淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18菌种进行平板划线，35-40℃培养过夜；
发酵液体种子的制备步骤：挑取平板生长良好菌落于种子培养基中，35-40℃，180r/min培养过夜，得液体种子；
制备液体菌剂的步骤：上述液体种子用发酵培养基接种量5-10％，置于30-37℃，150-220r/min，发酵12-24h，得到解淀粉芽孢杆菌液体菌剂。
作为进一步的方案，本发明所述的平板活化培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；平板活化培养基的pH为7.2-7.4。
作为进一步的方案，本发明所述的种子培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；种子培养基的pH为7.2-7.4。
作为进一步的方案，本发明所述的发酵培养基包含牛肉膏10g/L、可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L；发酵培养基pH 7.0-7.2。
本发明的第四个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌固体菌剂，由该固体菌剂由本发明所述的解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品混合而成，其中解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品的质量比为(10-15)∶35。
由于本发明所述的解淀粉芽孢杆菌具有降解餐厨垃圾的活性，因此本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌在处理餐厨垃圾中的应用。优选的具体应用方法是：将待处理的餐厨垃圾拣去骨头、塑料袋后适当粉碎，离心脱水，制成厨余垃圾混合料，在厨余垃圾混合料中加入含有解淀粉芽孢杆菌的固体菌剂，加入量为垃圾重量的8-15％，搅拌混合均匀后分别在20-60℃进行发酵，每4-5小时进行一次通风搅拌。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
1.本发明所筛选的解淀粉芽孢杆菌活性高，高活性蛋白水解酶和淀粉水解酶活性，并能在降解淀粉的过程中产酸，对高温具有耐受性；
2.本发明所述的解淀粉芽孢杆菌对餐厨垃圾的可以用于餐厨垃圾的快速处理，实现餐厨垃圾的快速生物减量化和稳定化，同时解决餐厨垃圾在生物处理过程中臭味释放的问题；减重率较高，解淀粉芽孢杆菌使餐厨垃圾减量能力随着温度的升高而逐渐增强，当温度升高至60℃时，解淀粉芽孢杆菌的减量能力依然可达80％。
本发明的菌种保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCC NO：M2018135。分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18。保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编430072。
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明餐厨垃圾垢中分离餐厨垃圾的初筛图；
图2是本发明所述的解淀粉芽孢杆菌在淀粉培养基生长上菌落图；
图3是本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的进化树图；
图4是本发明所述的解淀粉芽孢杆菌在不同接种量下处理餐厨垃圾减量图；
图5是本发明所述的解淀粉芽孢杆菌在不同温度下处理餐厨垃圾减量图。
具体实施方式
本发明所述的一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18，其保藏编号为CCTCC NO：M2018135，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
作为进一步的方案，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌体为短小的杆状菌，可产芽孢，菌落形态为中间凹陷，周围突起的火山口状菌落，周围周围粗糙且不规则，在生长后期表面非常粗糙，且中间凹陷不明显。
本发明的第二个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，该菌剂含有本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，具体方案如下：
一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18的浓度为109CFU/mL-1010CFU/mL。
本发明的第三个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，包括
发酵步骤：用平板活化培养基将冻存的淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18菌种进行平板划线，35-40℃培养过夜；
发酵液体种子的制备步骤：挑取平板生长良好菌落于种子培养基中，35-40℃，180r/min培养过夜，得液体种子；
制备液体菌剂的步骤：上述液体种子用发酵培养基接种量5-10％，置于30-37℃，150-220r/min，发酵12-24h，得到解淀粉芽孢杆菌液体菌剂。
作为进一步的方案，本发明所述的平板活化培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；平板活化培养基的pH为7.2-7.4。
作为进一步的方案，本发明所述的种子培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；种子培养基的pH为7.2-7.4。
作为进一步的方案，本发明所述的发酵培养基包含牛肉膏10g/L、可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L；发酵培养基pH 7.0-7.2。
本发明的第四个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌固体菌剂，由该固体菌剂由本发明所述的解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品混合而成，其中解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品的质量比为(10-15)∶35。
由于本发明所述的解淀粉芽孢杆菌具有降解餐厨垃圾的活性，因此本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌在处理餐厨垃圾中的应用。优选的具体应用方法是：将待处理的餐厨垃圾拣去骨头、塑料袋后适当粉碎，离心脱水，制成厨余垃圾混合料，在厨余垃圾混合料中加入含有解淀粉芽孢杆菌的固体菌剂，加入量为垃圾重量的8-15％，搅拌混合均匀后分别在20-60℃进行发酵，每4-5小时进行一次通风搅拌。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，所用到的培养基分别列举如下：
蛋白质培养基：含有脱脂奶粉50g/L，可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2。
淀粉培养基：含有可溶性淀粉20g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2。
平板/种子培养基：含有肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，琼脂20g/L，pH 7.2-7.4。
发酵培养基：含有牛肉膏10g/L，可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 7.0-7.2。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌的分离筛选
本发明解淀粉芽孢杆菌的分离过程：试验样品采集自南京大学食堂餐厨垃圾运载车的盛装桶内。从桶内刮取残留的餐厨垃圾垢，装于塑料密封袋内，储藏于室温下。因样品较难溶于水，在水中无法分离完全，使得得到的稀释液中降解菌数量较少，故本采用直接固体分离的方式。从采集的餐厨垃圾中取直径约为1cm的样品接于淀粉和蛋白质培养基中央，置于37℃的培养箱中培养，观察菌落的生长情况。若培养基中长有霉菌，在对细菌进行划线分离时会造成污染，故分离时在所用的培养基内添加制霉菌素以抑制霉菌的生长。
对生长的菌落，挑取形态差异较大的划线分离纯化，得到纯培养物后编号并保存于斜面培养基。直接将餐厨垃圾垢放置涂布在蛋白质降解和淀粉培养基上，待长出菌落后，用接种环挑取菌落，分别在蛋白质降解和淀粉降解培养基上划线分离，以获得单菌落的纯菌。同时，观察淀粉降解和蛋白质降解透明圈，挑取对蛋白质和淀粉具有较好降解能力的单菌落选一步纯化培养和驯化诱变以提高其降解性能。
纯化培养：将获得的单菌落在平板活化培养基上划线，37℃培养24h后，挑取单菌落。将每个单菌落单独在一块平板上划线培养，检查菌落的单一性，直至得到菌落形态相同的单一的菌落，即完成了纯化培养。
对划线纯化后得到的单菌，采用点接的方法接种在淀粉降解培养基和蛋白降解培养基上，进行菌株降解能力的测定，在37℃下培养24h后，测量菌落直径(d)和透明圈直径(D)测定计算D/d，进行淀粉和蛋白降解能力的初筛，挑选同时具有淀粉和蛋白降解能力的菌株以备复筛。
将实验初筛得到20株菌株，进行淀粉和蛋白降解能力的复筛，共有5株在12h内呈现较好的淀粉和蛋白降解性能(在淀粉和蛋白平板上形成的透明圈大)。选取同时在淀粉和蛋白培养基形成透明圈最大的菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18，其保藏编号为CCTCC NO：M2018135，主要生物学特性为G+，菌落形态为中间凹陷，周围突起的火山口状菌落，周围周围粗糙且不规则，在生长后期表面非常粗糙，且中间凹陷不明显。菌体为短小的杆状菌，可产芽孢。所述菌株的16S rDNA序列如SEQID NO：1所示，对16S rDNA的序列进行比对，并做进化分析后得到如图3所示的进化树图。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌液体菌剂的制备
该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18的浓度为109CFU/mL-1010CFU/mL；其制备方法，包括
发酵步骤：用平板活化培养基将冻存的淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)A18菌种进行平板划线，35-40℃培养过夜；
发酵液体种子的制备步骤：挑取平板生长良好菌落于种子培养基中，35-40℃，180r/min培养过夜，得液体种子；
制备液体菌剂的步骤：上述液体种子用发酵培养基接种量5-10％，置于30-37℃，150-220r/min，发酵12-24h，得到解淀粉芽孢杆菌液体菌剂。
实施例3：含解淀粉芽孢杆菌固体菌剂的制备
含解淀粉芽孢杆菌固体菌剂的制备，包括
发酵步骤：用平板活化培养基将冻存的菌种进行平板划线，37℃培养过夜。
发酵液体种子制备：挑取平板生长良好菌落于种子培养基中，37℃，180r/min培养过夜，得液体种子；
制备液体菌剂：用淀粉培养基按接种量5-10％，置于30～37℃恒温培养，150～220r/min，发酵12-24h，得到解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，菌剂内含有解淀粉芽孢杆菌为109CFU/mL-1010CFU/mL；
制备固体菌剂：向解淀粉芽孢杆菌液体菌剂内加入厨余垃圾腐熟干燥的产品，加入量为厨余垃圾腐熟产品350g解淀粉芽孢杆菌液体菌剂120g，制成解淀粉芽孢杆菌固体菌剂。
实施例4：不同接种量含解淀粉芽孢杆菌：固体菌剂对餐厨垃圾中的降解
将待处理的餐厨垃圾拣去骨头、塑料袋后适当粉碎，离心脱水，制成厨余垃圾混合料，在厨余垃圾混合料中加入解淀粉芽孢杆菌固体菌剂，加入量为垃圾重量的1％-20％，搅拌混合均匀后在40～45℃进行发酵，每4-5小时进行一次通风搅拌。2天后对处理系统进行称重，得到餐厨垃圾的减重率。减重效果如图4所示。1％-20％范围内，解淀粉芽孢杆菌的餐厨垃圾减量能力随着接种量的升高而逐渐增强，在接种量为1％-10％时，减量率增加显著，同时垃圾形态的破碎度增加，当接种量为10％-20％时，随接种量增加的减量率增加较为缓慢。
实施例5：不同温度含解淀粉芽孢杆菌固体菌剂对餐厨垃圾中的降解
将待处理的餐厨垃圾拣去骨头、塑料袋后适当粉碎，离心脱水，制成厨余垃圾混合料，在厨余垃圾混合料中加入解淀粉芽孢杆菌固体菌剂，加入量为垃圾重量的10％，搅拌混合均匀后分别在20～60℃进行发酵，每4-5小时进行一次通风搅拌。2天后对处理系统进行称重，得到餐厨垃圾的减重率。减重效果如图5所示。20-50℃范围内，解淀粉芽孢杆菌的餐厨垃圾减量能力随着温度的升高而逐渐增强，中温环境20-30℃条件下，解淀粉芽孢杆菌的餐厨垃圾减量能力2天内可减量超过35％，在40-50℃高温环境下，解淀粉芽孢杆菌在2天内可将减量超过85.5％；当温度升高至60℃时，解淀粉芽孢杆菌的减量能力稍有下降，但依然可达80％。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18，其保藏编号为CCTCC NO：M2018135，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌体为短小的杆状菌，可产芽孢，菌落形态为中间凹陷，周围突起的火山口状菌落，周围周围粗糙且不规则，在生长后期表面非常粗糙，且中间凹陷不明显。
3.一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，其特征在于，该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18的浓度为109CFU/mL-1010CFU/mL。
4.一种解淀粉芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，其特征在于，包括
发酵步骤：用平板活化培养基将冻存的淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)A18菌种进行平板划线，35-40℃培养过夜；
发酵液体种子的制备步骤：挑取平板生长良好菌落于种子培养基中，35-40℃，180r/min培养过夜，得液体种子；
制备液体菌剂的步骤：上述液体种子用发酵培养基接种量5-10％，置于30-37℃，150-220r/min，发酵12-24h，得到解淀粉芽孢杆菌液体菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述平板活化培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；平板活化培养基的pH为7.2-7.4。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包含牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L；种子培养基的pH为7.2-7.4。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含牛肉膏10g/L、可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L；发酵培养基pH 7.0-7.2。
8.一种解淀粉芽孢杆菌固体菌剂，其特征在于，由权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品混合而成，其中解淀粉芽孢杆菌液体菌剂与厨余垃圾腐熟干燥品的质量比为(10-15)∶35。
9.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在处理餐厨垃圾中的应用。
10.如权利要要求10所述的应用，具体方法是：将待处理的餐厨垃圾拣去骨头、塑料袋后适当粉碎，离心脱水，制成厨余垃圾混合料，在厨余垃圾混合料中加入含有解淀粉芽孢杆菌的固体菌剂，加入量为垃圾重量的8-15％，搅拌混合均匀后分别在20-60℃进行发酵，每4-5小时进行一次通风搅拌。
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