CN110468079A

CN110468079A - 一种污泥降解菌种及其应用

Info

Publication number: CN110468079A
Application number: CN201910803946.4A
Authority: CN
Inventors: 刘莉; 王娜; 史吉平; 颜薇芝; 任秋慧; 李泳洪
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2019-11-19
Also published as: CN111073840B; CN111073840A

Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种污泥降解的菌种及其应用。本发明提供一种粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN‑H1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018652；所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN‑H1能有效提高废水中VSS的去除率或污泥中有机物的降解率；可用于有机废水处理过程中的污泥、市政污泥、河道底泥等的减量化和稳定化处理，具有较高的应用价值。

Description

一种污泥降解菌种及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种污泥降解的菌种及其应用。

背景技术

污泥是污水处理过程的副产物，是一种由有机物、微生物菌体、无机颗粒、胶体等组成的极其复杂的非均质体。近年来，虽然世界各地已经有许多污泥处置技术应用于各类污水处理，也能够有效地去除污泥中的有机物，但仍然会产生大量的污泥并且得不到及时处理。据统计，我国年均产湿污泥2.4亿吨，其中仅城镇污水处理厂每年的湿污泥产生量达到4000多万吨，预测到2020年，我国城镇污泥的产生量将达到每年6000-8000万吨。污泥成分复杂，其中含有大量难降解物质，致病微生物、寄生虫卵以及重金属等有毒有害物质，如处理不当，容易对环境造成二次污染，更给人类的生存环境带来严峻挑战。因此，减少污泥的产生已成为研究热点，寻找更经济和环境友好的污泥降解替代方案越来越受到重视。

目前，国内外污泥处置的主要方法有卫生填埋、污泥堆肥、农业使用和污泥焚烧等，但由于场地限制、基础设施和运营管理成本高等原因，污泥处置问题尚未得到根本解决。污泥降解的本质和难点是污泥有机成分、微生物以及胞外聚合物(EPS)组成的絮体的裂解及降解。为了进一步降解和利用污泥，释放被包裹的有机物质和增加溶解性有机物质的含量，研究者们也开发了许多污泥降解方法来裂解EPS和内部微生物，如化学方法有臭氧化、过氧乙酸氧化、加碱等；物理方法有超声处理、热处理等；生物法有投加微生物菌剂、酶制剂、微型动物捕食等；机械方法有污泥浓缩、高压均质等；联合处理方法有臭氧化和超声联合处理等一系列处理方式。其中，这些物理方法和化学方法受自然条件限制，生产能耗较大，且对设备有一定的腐蚀性，会带来高成本和二次污染问题。生物法中投加微生物菌剂降解污泥主要利用微生物的生长及其分泌的酶水解污泥中的可降解成分，从而实现污泥减量。微生物降解污泥技术由于其经济效益好、操作方便、无污染的优势，近年来受到越来越多的关注，成为新型的污泥减量解决方案。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种污泥降解菌种及其应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种污泥降解菌种，经鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌种名称为Serratia marcescens SN-H1，保藏日期为2018.9.25，保藏编号为CCTCC NO：M2018652。

所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1，其特征在于，其为革兰氏阴性菌，短杆状，菌落形态为深红色圆形，边缘整齐，表面光滑湿润。

所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1，含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

所述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1在污泥液体培养基中培养四周，VSS去除率达48％以上。

所述VSS去除率为将菌液接种至污泥液体培养基中，采用下述方法检测获得。

污泥液体培养基成分为：

湿污泥(含水量为84％，VSS含量为64％，均为质量分数)加水调节浓度为10g/L，pH值7.0～7.5。

测定步骤：

(1)将污泥液体培养基离心，保留固体；

(2)将固体样品干燥，研磨成粉末状；

(3)称量坩埚的重量，记为m₀；

(4)称取步骤2中的粉末状样品于步骤3中的坩埚中，加热到550℃灼烧240min，待炉内温度降低后取出，干燥冷却并称重，记为M；

(5)根据称量数据及计算公式①计算样本VSS％：

VSS％＝(M－m₀)/M_样×100％ ①

M_样为步骤4中粉末状样本的重量。

(6)根据计算公式②计算VSS的去除率：

[VSS₍₂₈₎-VSS₍₀₎]/VSS₍₀₎×100％ ②

VSS₍₂₈₎为接种菌株之日起第28天取样的样本的VSS％，

VSS₍₀₎为未接种菌株的污泥液体培养基初始的VSS％。

培养四周，VSS去除率即为自接种菌株之日起28天取样获得的VSS去除率。

本发明第二方面提供粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1在污泥降解中的应用。

所述的污泥，包括有机废水处理过程中的污泥、市政污泥、河道底泥等。

所述的有机废水，包括畜禽养殖废水、工业有机废水、生活废水、垃圾渗滤液、沼液等。

一种污泥降解方法，至少包括如下步骤：

(1)将粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1的种子液接种至污泥并混匀；

(2)在适宜的温度、pH值、DO值(溶解氧含量)条件下好氧培养进行污泥的降解。

所述的接种的接种量为污泥体积的1～10％，优选为2～5％；

所述的温度为20～40℃，优选为30℃；

所述的pH值为6～8，优选为7～7.5；

所述的DO值为3～7mg/L，优选为3～5mg/L。

如上所述，本发明的污泥降解菌种及其应用，具有以下有益效果：

(1)高效降解污泥中的蛋白质、纤维素、淀粉等有机物，有效提高废水中VSS去除率或污泥中有机物的降解率，同时对污泥混合液中的TN和COD均有去除能力；(2)扩大培养后应用于可应用于有机废水处理过程中的污泥、市政污泥、河道底泥等的减量化和稳定化处理，具有很高的应用价值；

(3)处理效率高、经济效益好、操作方便、无污染。

附图说明

图1显示为本申请的污泥降解菌株SN-H1的系统进化树图谱。

图2显示为本申请的污泥降解菌株SN-H1对污泥液中VSS去除率的情况。

图3显示为本申请的污泥降解菌株SN-H1对畜禽养殖废水处理中污泥降解的情况；

图4显示为本申请的污泥降解菌株SN-H1对河道底泥降解的情况；

图5显示为本申请的污泥降解菌株SN-H1对餐厨垃圾沼液中污泥的降解情况。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

本发明第一方面提供一种粘质沙雷氏菌，所述粘质沙雷氏菌从污水处理池中的污泥混合液中分离纯化后，经鉴定得到粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1。

该菌株已于2018年9月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2018652。

所述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1的主要特征为革兰氏阴性菌，短杆状，菌落形态为深红色圆形，边缘整齐，表面光滑湿润。

所述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

污泥液体培养基成分为：湿污泥(含水量为84％，VSS含量为64％，均为质量分数)加水调节浓度为10g/L，pH值7.0～7.5。

所述污泥包括有机废水处理过程中的污泥、市政污泥、河道底泥等。

所述的有机废水，包括畜禽养殖废水、工业有机废水、生活废水、垃圾渗滤液、沼液等。本发明第三方面提供一种污泥降解方法，至少包括如下步骤：

所述的接种的接种量为污泥体积的1～10％，优选为2～5％；

所述的温度为20～40℃，优选为30℃；

所述的pH值为6～8，优选为7～7.5；

所述的DO值为3～7mg/L，优选为3～5mg/L。

实施例1：

污泥降解菌SN-H1的分离筛选及性能测定

所用到的培养基及成分如下：

LB液体培养基：10g/L氯化钠，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，pH值7.0～7.5。

LB固体培养基：10g/L氯化钠，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L的琼脂粉，pH值7.0～7.5。

污泥液体培养基：湿污泥(含水量为84％，VSS含量为64％，均为质量分数)加水调节浓度为10g/L，pH值7.0～7.5。

污泥固体培养基：湿污泥(含水量为84％，VSS含量为64％，均为质量分数)加水调节浓度为30g/L，琼脂20g/L，pH值7.0～7.5。

产蛋白酶筛选培养基：干酪素10g/L，10g/L氯化钠，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L的琼脂粉，pH值7.0～7.5。

产纤维素酶筛选培养基：羧甲基纤维素钠10g/L，10g/L氯化钠，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L的琼脂粉，pH值7.0～7.5。

产淀粉酶筛选培养基：可溶性淀粉10g/L，10g/L氯化钠，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L的琼脂粉，pH值7.0～7.5。

以上培养基配制好后，均在121℃下高压蒸汽灭菌20min，备用。

分离纯化：试验样品污泥混合液采集自各个不同来源的污水处理池，取5mL污泥混合液至45mL灭菌的LB液体培养基中，混合均匀后放置于30℃、180r/min的摇床中富集培养24h；将培养好的富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于LB固体培养基；在30℃恒温培养箱中培养24h后，挑取菌落形态各异的单克隆，划线纯化后编号保藏。经分离纯化共得到18个菌株。

初筛：将分离纯化得到的纯菌株，采用点接的方法接种到污泥固体培养基上，进行初筛，将接种的平板在30℃恒温培养箱中培养48～72h后，挑取在污泥琼脂培养基上生长较好的菌株，划线纯化并编号保藏。经初筛共得到7个菌株。

复筛：将初筛得到的纯菌株，采用点接的方法接种到产蛋白酶筛选培养基、产纤维素酶筛选培养基和产淀粉酶筛选培养基上，进行菌株产酶能力的测定，从而进行复筛。将接种的平板在30℃恒温培养箱中培养48～72h后，测量菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算D/d如表1所示，挑选出产酶能力较强的菌株，划线纯化并编号保藏。经复筛共得到3个菌株，SN-H1产酶能力最高，最终选择SN-H1作为后续污泥降解实验。

表1菌株产酶能力测定结果

污泥降解性能测定：将复筛得到的菌株接种至LB液体培养基中，在30℃、180r/min摇床中培养16h，取2％(体积比)菌液离心后用无菌生理盐水洗涤、重悬，接种至灭菌的污泥液体培养基中。在30℃、180r/min摇床中培养，每隔一周定期取样测污泥混合液中VSS的去除率，与不加菌的对照组相比，评价菌株降解污泥的性能。

VSS的测定步骤：

(1)将污泥混合液在10000r/min下离心10min后，固体用来测定污泥的VSS含量；

(2)将得到的部分固体样品在105℃烘箱下烘至恒重，研磨成粉末状以备用；

(3)将干净的坩埚放入105℃烘箱中干燥两小时，取出放在干燥器中冷却并称重，直至恒重，记为m₀；

(4)称取1.00g粉末状样品于重量为m₀的坩埚中，将其移入马弗炉中，加热到550℃灼烧240min(从温度达到550℃开始计时)，待炉内温度降低至100℃，取出放在干燥器中冷却并称重，直至恒重，记为M；

(5)根据称量数据及计算公式①计算样本VSS％：

VSS％＝(M－m₀)/M_样×100％ ①

M_样为步骤4中粉末状样本的重量。

(6)根据计算公式②计算VSS的去除率：

[VSS_(x)-VSS₍₀₎]/VSS₍₀₎×100％ ②

VSS_(x)中，x代表取样时间点，VSS_(x)为在x时间点取样的样本的VSS％，

VSS₍₀₎为未接种菌株的污泥液体培养基初始的VSS％。

四周VSS去除率即为自接种菌株之日起28天取样获得的VSS去除率。

(7)根据计算公式③计算VSS提高率：

[VSS_(SN-H1)-VSS_(对照)]/VSS_(对照)×100％ ③

其中，VSS_(SN-H1)为接种SN-H1菌株样本的VSS％，VSS_(对照)为同一取样时间点，未接种菌株的对照样本的VSS％。

由图2可以看出，培养4周后，菌株SN-H1对VSS的去除率达到48.8％，与对照组VSS去除率40.7％相比，提高了19.9％。说明菌株SN-H1具有显著的污泥降解效果。

实施例2：菌株SN-H1CCTCC NO：M 2018652的分子生物学鉴定

菌株鉴定采用16S rDNA序列比对法。按照现有技术提取菌株SN-H1的基因组DNA，并以此为模板，利用一对通用引物(27F，1492R)扩增菌株16S rDNA。上游引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)，下游引物为1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

PCR反应体系(20μL)如下：模板DNA 0.5μL，PCR Taqmix 10μL，上下游引物各0.6μL，加ddH₂O至反应体系为20μL。

PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min 30s，以上共循环30次，72℃延伸10min，最后在4℃保存。

由上海杰李生物技术有限公司进行PCR产物的纯化和测序。在NCBI提交通过测序获得的16S r的DNA序列，通过软件与GenBank进行同源性序列比对分析，应用MEGA 6软件构建该菌株系统发育树(如图1所示)。

菌株SN-H1的基因有效序列长度为1430bp，见基因序列表SEQ ID NO.1。经过比对，该序列与NCBI数据库的Serratia marcescens(NCBI登录号为：AB680131.1)同源性达99.9％，属于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，将其命名为粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens SN-H1。

实施例3：污泥降解菌SN-H1对畜禽养殖废水中污泥的降解效果

畜禽养殖废水取自某养猪场废水处理过程中初沉池的混合液，原液的TSS含量为26g/L，VSS含量为17g/L，pH值为8.5。

将菌株SN-H1接种LB液体培养基中，在30℃、180r/min摇床中培养16h，按照5％体积比将处于对数生长期的菌液离心、洗涤后投加入反应器，控制条件为：电动搅拌器的转速180r/min、DO值3mg/L、温度30℃、pH值7。在反应过程中每2d取一次样，按照实施例1中VSS的测定步骤测定废水中的VSS去除率。

图3显示为菌株SN-H1在24d内对养猪场废水中污泥的降解情况，可以看出，菌株SN-H1对VSS的去除率最高值达到79.6％，比对照组不接菌的VSS去除率53.0％相比，提高了50.2％。说明菌株SN-H1对养猪场废水中的污泥具有显著的降解效果。

实施例4：污泥降解菌SN-H1对河道底泥的降解效果

河道底泥取自上海市某河道的底泥，即来源于生活、工业的污染物质经物理、化学和生物作用沉积于河床底部，形成富含有机质和营养盐的灰黑色淤泥。供试的河道底泥含水率为89％，干基中有机物含量为8～9％，pH值为6.5～7.5。

将菌株SN-H1接种至LB液体培养基中，在30℃、180r/min摇床中培养16h，按照3％体积比将处于对数生长期的菌液离心、洗涤后投加入反应器，控制条件为：电动搅拌器的转速180r/min、DO值3mg/L、温度30℃、pH值7。在反应过程中每12h取一次样，按照实施例1中VSS的测定步骤测定河道底泥液的VSS去除率。

图4显示为菌株SN-H1在72h内对河道底泥的降解情况，可以看出，菌株SN-H1对VSS的去除率最高值达到14.6％，比对照组不接菌的VSS去除率8.9％相比，提高了64.0％。说明菌株SN-H1对河道底泥具有显著的降解效果。

实施例5：污泥降解菌SN-H1对餐厨垃圾沼液中污泥的降解效果

餐厨垃圾沼液取自某餐厨垃圾处理厂沼气发酵罐排出的沼液，原液的TSS含量为11％，VSS含量为9.7％，pH值为5.0～6.0。

将菌株SN-H1接种至LB液体培养基中，在30℃、180r/min摇床中培养16h，按照3％体积比将处于对数生长期的菌液离心、洗涤后投加入反应器，控制条件为：电动搅拌器的转速180r/min、DO值4mg/L、温度30℃、pH值6.5。在反应过程中每1d取一次样，按照实施例1中VSS的测定步骤测定餐厨垃圾沼液中VSS的去除率。

图5显示为菌株SN-H1在7d内对餐厨垃圾沼液中污泥的降解情况，可以看出，菌株SN-H1对VSS的去除率最高值达到77.2％，比对照组不接菌的VSS去除率62.5％相比，提高了23.5％。说明菌株SN-H1对餐厨垃圾具有显著的降解效果。

综上所述，本发明通过LB培养基分离纯化、污泥琼脂培养基初筛、产酶培养基复筛、污泥降解性能验证，得到一株高效污泥降解菌株，命名为SN-H1。通过菌落和细胞形态、生理生化特征、16S rDNA基因序列测定等数据综合分析，鉴定该菌株的分类学地位为：粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏名称为Serratia marcescens SN-H1，保藏日期为2018.9.25，保藏编号为CCTCC NO：M2018652，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种污泥降解菌种及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<400> 1

gcggcggctt acacatgcaa gtcgagcggt agcacagggg agcttgctcc ctgggtgacg 60

agcggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga 120

aacggtagct aataccgcat aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg 180

ccatcagatg tgcccagatg ggattagcta gtaggtgggg taatggctca cctaggcgac 240

gatccctagc tggtctgaga ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact 300

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc 360

cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agcgaggagg aaggtggtga 420

gcttaatacg ttcatcaatt gacgttactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca 480

gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac 540

gcaggcggtt tgttaagtca gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttga 600

aactggcaag ctagagtctc gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag 720

gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc tgtaaacgat 780

gtcgatttgg aggttgtgcc cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc 840

gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 900

ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca 960

gagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc 1080

tttgttgcca gcggttaggc cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa 1140

ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat 1200

ggcgtataca aagagaagcg acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tacgtcgtag 1260

tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca 1320

gaatgctacg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1380

gggttgcaaa agaagtaggt agcttaacct tcgggagggc gctaccact 1429

Claims

1.一种粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1，其保藏编号为CCTCC NO：M2018652。

2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

3.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1在污泥液体培养基中培养四周，VSS去除率达48％以上。

4.粘质沙雷氏菌Serratia marcescens SN-H1在污泥降解中的应用。

5.根据权利要求4所述的在污泥降解中的应用，其特征在于，所述污泥选自有机废水处理过程中的污泥、市政污泥、河道底泥。

6.根据权利要求5所述的在污泥降解中的应用，其特征在于，所述有机废水包括畜禽养殖废水、工业有机废水、生活废水、垃圾渗滤液、沼液。

7.一种污泥降解方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

(2)在适宜的温度、pH值、DO值条件下好氧培养进行污泥的降解。

8.根据权利要求7所述的污泥降解方法，其特征在于，还包括以下条件中的一种或几种：

(1)所述接种的接种量为污泥体积的1～10％；

(2)所述温度为20～40℃；

(3)所述pH值为6～8；

(4)所述DO值为3～7mg/L。