CN110791446B - 一种生态厕所处理菌种及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种生态厕所处理的菌种及其应用。本发明提供一种莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM‑Y3，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019815；所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM‑Y3能有效提高粪污中有机物的分解率；可用于生态厕所处理过程中的粪污的减量化和稳定化处理，具有较高的应用价值。

Description

一种生态厕所处理菌种及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种生态厕所处理菌种及其应用。
背景技术
厕所在人们的日常生活中起到至关重要的作用，每天接纳、蓄积并排除人类日常生理活动中排泄的绝大部分废弃物。而这些粪污排入城市下水道后变成了生活污水中污染物的重要来源，也是城市污水污染物的重要组成部分。因此，粪污所造成的环境污染问题越来越受到管理部门的重视。
在当今提倡“环保”、“绿色”和“生态”的社会，生态厕所应运而生。生态厕所是指具有不对环境造成污染，并且能充分利用各种资源，强调污染物自净和资源循环利用概念和功能的一类厕所。目前国内生态厕所的主流产品为粪尿混合处理型，主要是通过环境工程的手段，利用微生物的新陈代谢作用和物理化学作用，完成对粪尿污染物的降解。其中，微生物菌种的研发无疑是核心技术，优势的微生物菌种可利用粪尿中的营养物质生长繁殖，从而对其中的大分子有机物质进行生物降解，并且竞争性地抑制并杀死粪便中的病原微生物，实现粪便的无害化、资源化处理，能达到零排放的功能，对环境不造成污染。
微生物降解粪便技术主要依赖于高效的功能微生物。目前，日本和欧洲在研究微生物降解粪便方面取得了丰富的成果，而我国虽已有自主研发的功能微生物，但效果不甚理想。此外，微生物菌种的生长环境比较苛刻，若环境不适，即温度、水分活度等达不到合适的条件，微生物分解粪便中的有机物、杀死病原性微生物的效率会大大降低。因此，厕所这种对微生物生长条件比较苛刻的环境，严重制约了微生物在生态厕所中的应用，研发高效功能微生物菌种是亟须突破的重点与难点。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的在于提供一种高效降解人体粪污的微生物菌种，从而实现粪污的快速、高效生物减量化和稳定化。
本发明的又一目的在于提供所述的菌株在生态厕所中的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案予以实现：
本发明提供一株粪污高效降解菌株BM-Y3，通过16S rDNA序列比对，与莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）相似性高达99%。结合菌株的形态特征、生理生化特性，菌株BM-Y3被分类为莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），名称：Bacillus mojavensisBM-Y3，保藏日期：2019年10月12日，保藏号：CCTCC M 2019815。
所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，为革兰氏阴性，杆状。在LB固体培养基平板上培养16h，可形成3.0~5.0mm的菌落，菌落形态为白色不规则状、表面褶皱、边缘不整齐。
本发明提供一种莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3液体菌剂的制备方法，步骤如下：将纯菌接种于10 mL液体种子培养基，于30℃、200r/min的条件下培养16~24 h；然后以体积分数为1%的接种量接入相同的液体培养基中进行扩大培养，在30℃、200r/min的条件下培养16~24 h，即可得到该菌株的液体菌剂。
所述的液体培养基成分为：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L，pH调节为7~7.5。
本发明提供一种莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3固体菌剂的制备方法，步骤如下：由本发明所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌液体菌剂与木屑、稻壳、麦麸等载体混合、干燥制备而成，其中载体与液体菌剂的质量比为1：1~3。
本发明提供了一种莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3在生态厕所中的应用。包括如下步骤：（1）将厕所的粪污中加入莫哈维沙漠芽胞杆菌固体菌剂，固体菌剂与厕所粪液的质量比为1：5~10；（2）将混合物料搅拌均匀，在20~50℃下进行好氧发酵，过程中需不断的通风搅拌，以保证受热均匀且在好氧条件下进行。
与现有的技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，应用的温度范围较广，具有耐高温能力，可在20~50℃的温度条件下快速降解人体粪污。
（2）所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，具有高产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶及脂肪酶的能力，可高效降解人体粪污。
综合以上两个特点，莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3应用于生态厕所处理粪污，可实现粪污的快速、高效生物减量化和稳定化。
附图说明
图1是菌株BM-Y3的系统进化树；
图2是菌株BM-Y3对粪污的干重减量率；
图3是菌株BM-Y3对粪污中湿重减量率。
具体实施方式
下面结合附图和实施案例对本发明进一步说明：
实施例1：生态厕所粪污降解菌的筛选、功能验证及菌种鉴定
本发明用于筛选生态厕所粪污降解菌种的样品采集于某农村旱厕中。样品经过富集培养、分离纯化、粪污降解功能验证、菌种鉴定等实验，最终获得菌株BM-Y3。BM-Y3经鉴定为莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种名称：莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，保藏日期：2019年10月12日，保藏号：CCTCC M 2019815。
富集培养：取5 g采集的样品接种于装有100 mL液体培养基的三角锥形瓶中培养。液体培养基组成：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。培养条件为30℃、转速为180r/min，培养24h后，取10 mL培养物接种于新鲜的富集培养基中传代，传代条件与上述培养条件一致，传代2~3次结束培养。最终的培养物用于后续有效微生物的分离。
分离纯化：将经过富集培养的培养物进行梯度稀释，均匀涂抹在固体培养基平板上。固体培养基组成：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、琼脂粉15~20g，pH调节为7~7.5。涂布完成后，平板倒置在30℃的恒温培养箱中，培养24 h后结束。根据平板上的菌落形态，挑取形态大小不同的菌落，划线纯化后编号保藏。共分离得到9株菌。
菌种复筛：将初筛得到的纯菌株，采用点接的方法接种到产各种酶的培养基平板上进行复筛，即产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶固体培养基的成分除底物成分（干酪素10 g/L、羧甲基纤维素钠10 g/L、可溶性淀粉10 g/L、乳化橄榄油15 mL/L）不一致，其余成分与分离纯化固体培养基一致。将接种的平板在30℃恒温培养箱中培养24~48 h后，测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算D/d，挑选出产酶种类较多且产酶能力较强的菌株，经复筛得到两株菌种。
表1复筛得到的两株菌种的产酶情况
Figure 438519DEST_PATH_IMAGE002
功能验证：将复筛得到的纯菌株接种至液体培养基中，在30℃、180r/min条件下培养16h。取50 mL培养好的菌液离心后用无菌生理盐水洗涤，重悬至20 mL，附着在30 g木屑上，将其接种于70 g粪污中进行初步验证，结果表明接种菌株BM-Y3的粪污湿重减重率最大，在48 h后达到84%。
菌种鉴定：使用AXYGEN公司的细菌基因组提取试剂盒，提取菌株BM-Y3的基因组，并以此为模板扩增16S rDNA。测序得到菌株BM-Y3的16S rDNA长度为1414bp，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列经过Nucleotide BLAST分析，与NCBI数据库中Bacillus mojavensis（NCBI序列号：NR 112725.1）碱基一致性为1401 bp，相似性达到99%。同时结合细菌的形态特征、生长特性确定筛选的BM-Y3菌株为莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis），将其命名为Bacillus mojavensis BM-Y3。
莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3的生物学特性如下：其为革兰氏阴性，杆状。在LB固体培养基平板上培养16h，可形成3.0~5.0mm的菌落，菌落形态为白色不规则状、表面褶皱、边缘不整齐。
实施例2：莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3菌剂的制备
液体菌剂的制备：将BM-Y3纯菌接种于10 mL液体种子培养基，于30℃、200r/min的条件下培养24 h，然后以体积分数为1%的接种量接入相同的液体培养基中进行扩大培养，同样在30℃、200r/min的条件下培养24 h，即可得到该菌株的液体菌剂。
固体菌剂的制备：将BM-Y3菌株的液体菌剂与木屑混合、干燥制备而成，其中木屑与液体菌剂的质量比为1：2。
实施例3：莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3对人体粪污的处理效果
将待处理的人体粪污中加入BM-Y3菌种固体菌剂，固体菌剂与粪污的质量比为1:3，搅拌均匀后在40℃下进行好氧发酵，过程中需要不间断的通风、搅拌，以保证受热均匀且在好氧条件下进行。每12 h对处理系统进行称重，得到粪污的固体降解率，减重效果如图2所示。从图2中可以看出，接入菌株BM-Y3的实验组比未接种的对照组一直呈现较高的湿重减量率，接入菌种BM-Y3的湿重减量率在48 h时达到76%，比对照组的52%提高了46%。
与此同时，每12 h取样测其干物质的含量，计算粪污的干重减量率，如图3所示。从图3中可知，接入菌株BM-Y3的实验组比未接种的对照组一直呈现较高的干重减量率，接入菌种BM-Y3的干重减量率在48 h时达到48%，而对照组的最大干重减量率才达到11%。
由此可知，莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3可有效分解粪污中的有机物，提高生态厕所中粪污的减量效果，实现粪污的快速、高效生物减量化和稳定化。
序列表
<110> 森诺技术有限公司
<120> 一种生态厕所处理菌种及其应用1 ttctaaaagg ttacctcacc gacttcgggtgttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt61 gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgcggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc121 cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcgatccgaactg agaacagatt tgtgggattg181 gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgttctgtccatt gtagcacgtg tgtagcccag241 gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcatccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag301 tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggcaactaagatc aagggttgcg ctcgttgcgg361 gacttaaccc aacatctcac gacacgagctgacgacaacc atgcaccacc tgtcactctg421 cccccgaagg ggacgtccta tctctaggattgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt481 cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgctccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc541 ctttgagttt cagtcttgcg accgtactccccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca601 gcactaaggg gcggaaaccc cctaacacttagcactcatc gtttacggcg tggactacca661 gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgctttcgctcctc agcgtcagtt acagaccaga721 gagtcgcctt cgccactggt gttcctccacatctctacgc atttcaccgc tacacgtgga781 attccactct cctcttctgc actcaagttccccagtttcc aatgaccctc cccggttgag841 ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaaccgcctgcgag ccctttacgc ccaataattc901 cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccgcggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt961 tctggttagg taccgtcaag gtaccgccctattcgaacgg tacttgttct tccctaacaa1021 cagagcttta cgatccgaaa accttcatcactcacgcggc gttgctccgt cagactttcg1081 tccattgcgg aagattccct actgctgcctcccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc1141 cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggctacgcatcgt tgccttggtg agccgttacc1201 tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtccatctgtaagtg gtagccaaag ccacctttta1261 tgtttgaacc atgcggttca aacaaccatccggtattagc cccggtttcc cggagttatc1321 ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgttactcacccgt ccgccgctaa catcagggag1381 caagctccca tctgtccgct cgacttgcat taa
<160> 0
<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (10)

1.一种莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期：2019年10月12日，保藏号：CCTCC M 2019815。
2.根据权利要求1所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，其特征在于，所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
3.根据权利要求1所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3，其特征在于，该菌为革兰氏阴性，杆状，菌落形态为白色不规则状、表面褶皱、边缘不整齐。
4.一种如权利要求1-3任一所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3的液体菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将纯菌接种于10 mL液体培养基中，于30℃、200r/min条件下培养16~24 h；
（2）以体积分数为1%的接种量接入液体培养基中扩大培养，30℃、200r/min条件下培养16~24 h。
5.根据权利要求4所述的液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述的液体培养基成分为：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、FeSO4·7H2O0.1 g/L，pH值调节为7~7.5。
6.一种如权利要求1-3任一所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3的固体菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将纯菌接种于10 mL液体培养基中，于30℃、200r/min条件下培养16~24 h；
（2）以体积分数为1%的接种量接入液体培养基中扩大培养，30℃、200r/min条件下培养16~24 h，得液体菌剂；
（3）将载体与所述的液体菌剂按照质量比为1：1~3的比例混合；
（4）将步骤（3）的混合物进行干燥。
7.根据权利要求6所述的固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述的液体培养基成分为：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、FeSO4·7H2O0.1 g/L，pH值调节为7~7.5。
8.根据权利要求6所述的固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述的载体选自木屑、稻壳、麦麸中的一种或几种。
9.一种如权利要求1-3任一所述的莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3在生态厕所中的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3的固体菌剂；
（2）将厕所的粪污加入所述莫哈维沙漠芽孢杆菌的固体菌剂中，所述固体菌剂与厕所粪污的质量比为1：5~10；
（3）将混合物料搅拌均匀，在20~50 ℃下进行好氧发酵，过程中不间断的通风搅拌。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述莫哈维沙漠芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）BM-Y3的固体菌剂的制备如权利要求6-8任一所述固体菌剂的制备方法的步骤。
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