CN114164133B - 一种热反硝化地芽孢杆菌dc8菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株及其应用，于2021年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23318。本发明的菌株具有在高温环境下降解剩余污泥提取蛋白质的能力，蛋白质提取率可达29.7％。利用该菌株可以实现污泥中蛋白质的有效利用，提高剩余污泥减量降解效果，具有良好应用前景。本发明可为污水厂剩余污泥的减量，提供了高效的菌源，拓宽了热反硝化地芽孢杆菌的功能应用，具有较强的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于污泥处理的技术领域，具体涉及一种热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株及其应用。
背景技术
污泥作为污水处理过程中产生的废弃物，其自身成分比较复杂，并且携带大量的微生物、病原菌、重金属以及有机污染物等，处置方式主要有土地填埋、弃置、焚烧、资源化等，处理不当容易产生二次污染，不仅会影响污水处理系统的处理能力，也会对生态环境和人类活动造成严重威胁。
剩余污泥中富含有机质，其中胞内和胞外聚合物中蛋白质含量为污泥干质量的30%～60%。为避免资源浪费，回收剩余污泥中的蛋白质是一种重要的剩余污泥处理技术。其主要是将剩余污泥水解，破胞并破坏污泥絮体结构，将蛋白质释放到水相中。与物理和化学水解技术相比，酶解技术具有环境友好、操作简单、水解效果好等特点，在提取蛋白质的过程中还能实现污泥30%～40%的减量化，并使得剩余污泥残渣达到稳定化指标，降低后续处理成本和难度。
现阶段，一些学者试图通过筛选驯化耐热微生物以应用于难降解剩余污泥的生化处理系统，但由于高温有利于剩余污泥溶胞，对于在高温下降解剩余污泥的菌株，在实际分离与筛选中仍存在一定困难，即便分离得到了某些耐热微生物，但其对剩余污泥的水解能力有限，且蛋白质的提取率偏低。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在高温条件下降解剩余污泥并具有优良的提取蛋白质的能力的热反硝化地芽孢杆菌DC8及其应用。
本发明采用如下技术方案：
一种热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）DC8菌株，该菌株于2021年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23318。
进一步的，该菌株的培养温度为60℃。
进一步的，该菌株的可产蛋白酶。
进一步的，该菌株的可产淀粉酶。
进一步的，培养上述菌株获得的发酵液的上清液可溶解细菌。
更加优选的，培养上述菌株获得的发酵液的上清液可溶解E.coli细胞。
一种上述的热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株在溶解细菌中的应用。
一种上述的热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株在处理剩余污泥中的应用。
其中，利用所述的热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株水解剩余污泥并提取蛋白质。
进一步的，具体包括如下步骤：
（1）将4℃斜面保存的热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株活化，将其分别划线于相应固体培养基上，在60℃的恒温摇床上通气培养24h；
（2）挑取活化的菌落，将热反硝化地芽孢杆菌接种于液体培养基中，在60℃下培养24h，获得热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液；
（3）将新鲜的剩余污泥静置后，倒掉上清液，获得原污泥；
（4）将热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液的上清液加入原污泥中，上清液与原污泥体积的体积比为1∶4，制得混合液，将混合液置于60℃、120r/min的恒温培养箱中振荡5h，完成剩余污泥的微生物水解。
本发明的有益效果在于：
本发明分离筛选得到的热反硝化地芽孢杆菌DC8在固体培养基60℃培养12h，菌落呈圆形、淡黄色、半透明，凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐。
本发明分离筛选得到的热反硝化地芽孢杆菌DC8，属嗜热土芽孢杆菌属，革兰氏阳性，该菌株形态特征为：菌体短杆状，单个排列。经检测，该热反硝化地芽孢杆菌DC8最适生长温度为60℃，最适生长pH为7.0。
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌DC8加入剩余污泥中，其在有氧发酵的条件下剩余污泥中蛋白质提取率达到29.7%，对剩余污泥中氮源的回收有很好的效果。
本方法提供的热反硝化地芽孢杆菌DC8可以分泌热稳定酶，作用于剩余污泥细胞之后，可以使剩余污泥细胞高效水解，使菌体短时、高效溶解，大分子有机物质溶出，使液相中可溶性易水解的有机物增多，提高剩余污泥中氮源的获得，为从后续水解产物中提取蛋白质提供帮助。应用前景广阔，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。
附图说明
图1为本发明的热反硝化地芽孢杆菌DC8的菌落形态图。
图2为本发明的热反硝化地芽孢杆菌DC8的菌株形态图。
图3为本发明的热反硝化地芽孢杆菌DC8基于16Sr DNA序列构建的系统发育树。
图4为在60℃条件下热反硝化地芽孢杆菌DC8对E.coli的溶解效果图。
图5为在60℃条件下热反硝化地芽孢杆菌DC8对剩余污泥处理后蛋白质含量变化效果图。
图6为在60℃条件下热反硝化地芽孢杆菌DC8的上清液中蛋白酶和淀粉酶的活性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
实施例1 热反硝化地芽孢杆菌DC8的分离筛选
本发明热反硝化地芽孢杆菌DC8的分离筛选方法，是采用梯度稀释分离方法得到的，其方法包括如下步骤：
（a）采集样品：从石家庄某厨余垃圾处理处置中心采集高温堆肥基质。
（b）样品预处理：取上述样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后均匀震荡30min，静置悬浮液，取上清液离心后取上层菌液为菌悬液，备用。
（c）富集培养：分别取菌悬液2mL接种于200mL液体培养基中，置于60℃恒温培养箱中培养48h，得到扩大菌种培养液。
（d）梯度稀释：将1mL菌液和配制好的9mL生理盐水（0.8%NaCl）混合，即配制成稀释梯度为10-1的菌液，再取稀释梯度为10-1的菌液1mL与9mL生理盐水混匀配制成稀释梯度为10-2的菌液，依此类推，直至得到10-2~10-5的稀释液。
（e）平板涂布：在无菌条件下将各个浓度的0.1mL稀释菌液滴加到灭菌后的脱脂乳固体培养基，进行平板涂布分离，并将接种好的固体培养基倒置于恒温培养箱，60℃静置培养20~36h，直至有明显菌落出现。
（f）选定菌株：挑取有不同形态特征并且菌落周围有水解圈的单菌落，于固体培养基上反复划线纯化，直至得到单菌落，后置于4℃冰箱内保存备用。
（g）最佳生长时间的测定：将菌悬液接种于液体培养基中，于60℃、120r/min条件下培养，每隔1h测定OD600，直至36h，得出菌株最佳生长时间。
（h）最佳生长pH的测定：配制不同pH的液体培养基，接种菌悬液后，于60℃、120r/min条件下培养24h，以液体培养基做空白，测定OD600。
（i）最佳生长温度的测定：将pH7.0的液体培养基100mL置于250mL锥形瓶中，接种1mL菌悬液，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下培养24h，测定OD600。
实施例2 热反硝化地芽孢杆菌DC8理化性质鉴定
本发明的热反硝化地芽孢杆菌DC8的鉴定方法，包括以下步骤：
（1）观察嗜热菌株DC8的菌落形态和菌株形态，本发明嗜热细菌在60℃培养12h，菌落形态特征为：圆形、淡黄色，表面光滑、湿润、边缘整齐，如图1所示。
本发明嗜热菌株DC8，属嗜热芽孢杆菌属，革兰氏阳性，该菌株的形态特征为：菌体短杆状，单个排列，如图2所示。
（2）菌株生理生化特性
。
（3）DNA的序列信息及其系统发育学分析
采用MEGA7.0软件，邻位连接法显示嗜热菌株DC8与相关菌株的16SrDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图3中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%的数值。本发明嗜热菌株DC8的16Sr DNA序列如SEQ ID No.1所示。
经分析，本发明的嗜热细菌和与之参比的芽孢杆菌属相应标准菌株同源性相似度在99%以上，因此可初步判断菌株属于土芽孢杆菌属。本发明菌株与模式菌株Geobacillus thermodenitrificansstrain WJ-8序列的同源性达到93%，因此，鉴定本发明嗜热菌株DC8为热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）。该菌株于2021年8月30日送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.23318。
实施例3 热反硝化地芽孢杆菌DC8溶菌试验
采用处于平台期生长的E.coli作为实验的模式菌株。E.coli的培养液以5000rpm离心10min收集菌体，重悬。将50%（V/V）的嗜热菌（Abs600=1.0~1.5）热反硝化地芽孢杆菌DC8离心后得到的粗酶液投加到溶菌体系中。最后，250mL的锥形瓶中加入100mL的混合菌液60℃处理16h，结果如图4所示。
由图4可知，随着时间的增加，E.coli细胞溶解率持续增大，在14h时达到最大值63.6%。说明热反硝化地芽孢杆菌DC8分泌的水解酶将E.coli细胞裂解，胞内有机物质释放出来，上清液中可溶性有机物含量提高。
由此可见，在热反硝化地芽孢杆菌DC8分泌的蛋白酶和淀粉酶共同作用促进了E.coli细胞的裂解，且蛋白酶活性在溶解E.coli细胞中占有主导作用。
实施例4 热反硝化地芽孢杆菌DC8在水解剩余污泥提取蛋白质中的应用。
（1）菌种活化
菌种：热反硝化地芽孢杆菌DC8。
将4℃斜面保存的热反硝化地芽孢杆菌活化，将其分别划线于相应固体培养基上，在60℃的恒温摇床上通气培养24h。
（2）菌液制备
挑取活化的菌落，将热反硝化地芽孢杆菌DC8接种于液体培养基中，在60℃下培养24h，获得热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液。
上述液体培养基包括以下组分：酵母浸粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000mL，pH=7.0。
（3）剩余污泥前处理
将新鲜的剩余污泥静置后，倒掉上清液，获得原污泥。
控制嗜热菌粗酶液（热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液的上清液）投加量（V/V）20%，投加入原污泥中，制得100mL的混合液，将混合液置于60℃、120r/min的恒温培养箱中振荡5h，完成嗜剩余污泥的微生物水解。
实验结果显示（如图5），热反硝化地芽孢杆菌DC8对剩余污泥的蛋白质提取率随着时间持续提高，最大值可达29.7%，与未接种菌株的污泥（仅进行步骤（3）的处理）相比蛋白质提取率增加26%。这可以说明，热反硝化地芽孢杆菌DC8分泌了淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，这些胞外酶可以打破污泥细胞壁，将胞内大的复杂分子水解为简单的小分子，从胞内释放出来，提高了可生化性。
蛋白质提取率（Rp）通过如下公式计算：
。
式中：m1为蛋白质提取液中蛋白质含量，mg。m2为原污泥中蛋白质含量，mg。
从图6可以看出，在热反硝化地芽孢杆菌DC8溶解剩余污泥的过程中，蛋白酶的活性显著高于淀粉酶的活性，蛋白酶活性的最大值为287.7u/mL，而淀粉酶为155u/mL，表明剩余污泥的溶解率与蛋白酶和淀粉酶活性密切相关，并且蛋白酶和淀粉酶的联合作用促进了剩余污泥细胞的裂解，而蛋白酶活性在溶解剩余污泥细胞的过程中占有主导作用。
蛋白酶活性定义为：1mL酶液，在一定温度和pH条件下（本发明采用60℃、pH7.0），1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/mL表示。
淀粉酶活性定义为：1mL酶液，在一定温度和pH条件下（本发明采用60℃、pH7.0）与底物反应，在反应时间（5min）内生成1mg麦芽糖为一个酶活力单位以u/mL表示。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 一种热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> Geobacillus thermodenitrificans
<400> 1
gacggcggct gctataatgc aagtcgagcg gaccgaacga gagcttgctc ttgtttggtc 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcccgc aagaccggga taactccggg 120
aaaccggagc taataccgga taacaccaaa gaccgcatgg tctttggttg aaaggcggct 180
tcggctgtca cttgcggatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cggcctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcgacgc cgcgtgagcg aagaaggcct tcgggtcgta aagctctgtt gtgagggacg 420
aaggagcgcc gtttgaataa ggcggcgcgg tgacggtacc tcacgagaaa gccccggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcgagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt cctttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600
gggtcattgg aaactggggg acttgagtgc aggagaggag agcggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctctc tggcctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg ggtcacaccc tttagtgctg tagctaacgc 840
gataagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ccctgacaac ccaagagatt gggcgttccc ccttcggggg gacagggtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgcctctag ttgccagcat tcagttgggc actctagagg gactgccggc 1140
taaaagtcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatgggcg gtacaaaggg ctgcgaaccc gcgaggggga gcgaatccca 1260
aaaagccgct ctcagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc cggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagcttgca acacccgaag tcggtgaggt aacccttacg ggagccagcc 1440
gccgaagctg caagg 1455
Claims (4)
1.一种热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株，其特征在于，热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillusthermodenitrificans）DC8菌株，该菌株于2021年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .23318。
2.一种如权利要求1所述的菌株在溶解E .coli中的应用。
3.一种如权利要求1所述的菌株在处理剩余污泥中的应用，其特征在于，利用所述的菌株水解剩余污泥并提取蛋白质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）将4℃斜面保存的热反硝化地芽孢杆菌DC8菌株活化，将其分别划线于相应固体培养基上，在60℃的恒温摇床上通气培养24h；
（2）挑取活化的菌落，将热反硝化地芽孢杆菌接种于液体培养基中，在60℃下培养24h，获得热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液；
（3）将新鲜的剩余污泥静置后，倒掉上清液，获得原污泥；
（4）将热反硝化地芽孢杆菌DC8菌液的上清液加入原污泥中，上清液与原污泥体积的体积比为1∶4，制得混合液，将混合液置于60℃、120r/min的恒温培养箱中振荡5h，完成剩余污泥的微生物水解。
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