CN109337837B - 一种嗜热芽孢杆菌df7菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嗜热芽孢杆菌DF7菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16459。本发明的菌株在有氧发酵的条件下可以高效的水解抗生素菌渣，使胞内有机物质溶出，促进后续资源化利用，并可以促进E.coli细胞的裂解。

Description

一种嗜热芽孢杆菌DF7菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种嗜热芽孢杆菌DF7菌株及其应用。

背景技术

我国已成为世界上最大的抗生素生产国，抗生素生产过程中会产生大量抗生素菌渣。依据2008年修订后的《国家危险废物名录》，抗生素菌渣属于化学药品原料药生产过程中的培养基废物，须按危险废物进行管理，其用做动物饲料或饲料添加剂以及生产有机肥均被明令禁止。另外，抗生素菌渣含有丰富的有机质，抗生素菌渣（干基）中蛋白质（约占干基的30%~40%）和其它有机物含量高达90%以上，具有较高的生物质能，直接焚烧处置是对资源的极大浪费。因此，如果能对其中的有机物质（如蛋白质）进行资源化提取回收，将是安全、有效、合理、经济地处置和利用抗生素菌渣的一条有效途径。

然而，由于抗生素菌丝体具有刚性的细胞壁，胞内有机质释放困难，难以得到充分利用。因此，抗生素菌渣资源化的关键环节是实现其高效水解。

通常，通过物理和化学等手段对其进行预处理，虽然都取得了一定效果，但物理方法预处理抗生素菌渣存在的缺陷是能耗过大成本高，而化学方法需要投加药剂容易与污泥中的一些物质产生有毒的产物，对环境不利，会对后续沉淀提取固态蛋白产生不利影响。

生物处理技术具有低能耗、低污染、低成本、高效、安全、无污染等特点。其中嗜热酶溶解技术（Solubilization by Thermophilic Enzyme，简称S-TE）更是优势明显，其是通过优势嗜热溶胞菌/酶在适宜条件下分泌的胞外酶（主要为蛋白酶和淀粉酶）进行生物溶胞作用，从而使菌体短时、高效溶解，大分子有机物质溶出，为后续水解产物中氮源蛋白质的提取提供帮助。

目前，S-TE技术用于剩余污泥水解研究较多，而用于抗生素菌渣破壁溶胞鲜有报道，这主要是因为抗生素菌渣现有的处理处置技术主要为焚烧、肥料化、饲料化、填埋和能源化等，预处理技术多为物理、化学和其他生物处理法。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热芽孢杆菌，其在有氧发酵的条件下可以高效的水解抗生素菌渣，促进其后续资源化利用，并可以促进E.coli细胞的裂解。

本发明采用如下技术方案：

一种嗜热芽孢杆菌（热堆肥芽孢杆菌，Bacillus thermocopriae）DF7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年9月11日，保藏编号为CGMCC No.16459。

进一步的，其培养温度为60℃。

进一步的，其可产蛋白酶。

进一步的，其可产淀粉酶。

进一步的，培养所述菌株获得的发酵液的上清液可溶解细菌细胞。

进一步的，所述细菌为大肠杆菌。

一种上述的菌株在处理抗生素菌渣中的应用。

具体的，所述应用通过如下步骤实现：

（1）取一环冷冻保存的嗜热芽孢杆菌DF7菌株接种于固体培养基中，在60℃、150r/min的恒温摇床上通气培养24h，获得活化后的嗜热芽孢杆菌DF7；

（2）取一环活化后的嗜热芽孢杆菌DF7接种于液体培养基中，在60℃下培养24h，获得嗜热芽孢杆菌DF7菌液；

（3）取50mL的嗜热芽孢杆菌DF7菌液的上清液，投加入含水率为95%~98%的抗生素菌渣中，得到100mL的混合液，将混合液置于60℃水浴孵育14h，完成抗生素菌渣微生物水解。

所述抗生素菌渣包括但不限于头孢菌素菌渣、土霉素菌渣、红霉素菌渣和青霉素菌渣。

一种上述的菌株在溶解细菌中的应用。

所述嗜热芽孢杆菌DF7菌株通过如下方法获得：取芦苇秸秆与石家庄某污水处理厂所取活性污泥按体积比为2∶1进行混合好氧堆肥，好氧堆肥后的堆肥基质中较中心处取出样品，然后将样品与液体培养基按体积比为1∶10混合，置于50~60℃、140~150r/min条件下恒温培养60~72h；采用梯度稀释法将稀释液滴加到固体培养基中进行平板涂布分离，50~60℃条件下静置培养20~24h，得到目标菌株。

所述液体培养基为：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃条件下灭菌20 min。

所述固体培养基为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂10g，水1000mL，pH=7.0，121℃条件下灭菌20min。

本发明的有益效果在于：本发明分离筛选得到的嗜热细菌在牛肉膏蛋白胨培养基60℃培养12h，菌落呈圆形、乳白色、半透明，凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐。

本发明分离筛选得到的嗜热细菌，属嗜热芽孢杆菌属，革兰氏阳性，该菌株形态特征为：菌体短杆状，单个排列。经检测，该嗜热细菌最适生长温度为60℃，最适生长pH值为7.0。

本发明提供一种前期经牛肉膏蛋白胨培养基分离筛选出的嗜热细菌加入抗生素菌渣中，其在有氧发酵的条件下抗生素菌渣的水解速率达到70%以上，对抗生素菌渣的水解预处理有很好的效果。

本方法的优点是由于该嗜热细菌可以分泌热稳定酶，从而作用于抗生素菌渣菌丝体细胞之后，可以使抗生素菌渣细胞高效水解，从而使菌体短时、高效溶解，大分子有机物质溶出，使液相中可溶性易水解的有机物增多，从而提高菌渣中氮源的获得，为从后续水解产物中提取蛋白质提供帮助。此预处理方法应用前景更为广阔，具有明显的经济效益、社会效益和环保效益。

附图说明

图1 本发明的嗜热芽孢杆菌DF7的菌落形态图。

图2 本发明的嗜热芽孢杆菌DF7的菌株形态图。

图3 本发明的嗜热芽孢杆菌DF7基于16SrDNA序列构建的系统发育树。

图4 在60℃条件下嗜热芽孢杆菌DF7对E.coli的溶解效果图。

图5 在60℃条件下嗜热芽孢杆菌DF7对抗生素菌渣的溶解效果图。

图6 在60℃条件下嗜热芽孢杆菌DF7的上清液中蛋白酶和淀粉酶的活性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。

实施例1 嗜热芽孢杆菌DF7的分离筛选

本发明嗜热芽孢杆菌DF7的分离筛选方法，是采用梯度稀释分离方法得到的，其方法包括如下步骤：

采集样品：芦苇秸秆与活性污泥依体积比V/V=2∶1进行混合好氧堆肥后的堆肥基质中较中心处取出样品。

样品预处理：取上述样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后均匀震荡10min，静置悬浮液，取上清液离心后取上层菌液为菌悬液，备用。

富集培养：分别取菌悬液2mL接种于200mL液体培养基中，置于60℃恒温培养箱中培养48h，得到扩大菌种培养液。

梯度稀释：将1mL菌液和配制好的生理盐水（0.8% NaCl）混合，即配制成稀释梯度为10^-1的菌液，再取稀释梯度为10^-1的菌液1ml与9ml生理盐水混匀配制成稀释梯度为10^-2的菌液，依此类推，直至得到10^-2~10^-5的稀释液。

平板涂布：在无菌条件下将各个浓度的0.1mL稀释菌液滴加到灭菌后的脱脂乳固体培养基，进行平板涂布分离，并将接种好的固体培养基倒置于恒温培养箱，60℃静置培养20~36h。

选定菌株：挑取有不同形态特征并且菌落周围有水解圈的单菌落，于60℃培养基上扩繁后保存。

最佳生长pH值的测定：配制不同pH值得液体培养基，接种菌悬液后，于60℃、150r/min条件下培养20h，以液体培养基做空白，测定OD_600nm的值。

最佳生长温度的测定：将pH7.0的液体培养基100mL置于250mL锥形瓶中，接种1mL菌悬液，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下培养20h，测定OD_600nm的值。

实施例2 嗜热芽孢杆菌DF7理化性质鉴定

本发明的嗜热芽孢杆菌DF7的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）观察嗜热菌株DF7的菌落形态和菌株形态，本发明嗜热细菌在60℃培养12h，菌落形态特征为：圆形、乳白色，表面光滑、湿润、边缘整齐，如图1所示。

本发明嗜热菌株DF7，属嗜热芽孢杆菌属，革兰氏阳性，该菌株的形态特征为：菌体短杆状，单个排列，如图2所示。

（2）菌株生理生化特性

。

（3）DNA的序列信息及其系统发育学分析

采用MEGA7.0软件，邻位连接法显示嗜热菌株DF7与相关菌株的16SrDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图3中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%的数值。本发明嗜热菌株DF7的16SrDNA序列如SEQID No.1所示。经分析，本发明的嗜热细菌和与之参比的芽孢杆菌属相应标准菌株同源性相似度在99%以上，因此可初步判断菌株属于芽孢杆菌属。本发明菌株与模式菌株Bacillus thermocopriae strain SgZ-7序列的同源性达到100%，因此，鉴定本发明嗜热菌株DF7为嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermocopriae）。

实施例3 嗜热芽孢杆菌DF7溶菌试验

采用处于平台期生长的E.coli作为实验的模式菌株。E.coli的培养液以5000rpm离心10min收集菌体，重悬。将50%（V/V）的嗜热菌（Abs₆₀₀=1.0~1.5）嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermocopriae）DF7上清液投加到溶菌体系中。最后，250mL的锥形瓶中加入100mL的混合菌液60℃处理16h，结果如图4所示。

由图4可知，随着时间的增加，E.coli细胞溶解率持续增大，在14h时达到最大值67%。说明嗜热菌DF7分泌的水解酶将E.coli细胞裂解，胞内有机物质释放出来，上清液中可溶性有机物含量提高。

由此可见，在嗜热芽孢杆菌DF7分泌的蛋白酶和淀粉酶共同作用促进了E.coli细胞的裂解，且蛋白酶活性在溶解E.coli细胞中占有主导作用。

实施例4 嗜热芽孢杆菌DF7在水解头孢菌渣中的应用

其包括以下步骤：

（1）菌种活化

将4℃斜面保存的嗜热芽孢杆菌活化，将其分别划线于相应固体培养基上，在60℃、150r/min的恒温摇床上通气培养24h；

菌种来源：嗜热芽孢杆菌，自行删选获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16459。

（2）菌液制备

挑取活化的菌落，将嗜热芽孢杆菌接种于液体培养基中，在在60℃下培养24h，获得嗜热芽孢杆菌DF7菌液；

上述液体培养基包括以下组分：

牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0。

（3）抗生素菌渣前处理

头孢菌渣在室温条件下5000rpm离心10min，等体积的新鲜缓冲液（0.05mol/LTris-HCl pH8.5）冲洗一次，重悬；

嗜热菌投加量（V/V）10%，投加入头孢菌渣中，制得100mL的混合液，将混合液置于60℃水浴孵育14h，完成嗜热芽孢杆菌DF7促进抗生素菌渣微生物水解。

实验结果显示（如图5），嗜热芽孢杆菌DF7对头孢菌渣的溶解率随着时间持续提高，最大值可达75%，较对照提高了59.5%。这可以说明，嗜热芽孢杆菌DF7分泌了淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，这些胞外酶可以打破头孢菌渣细胞壁，将胞内大的复杂分子水解为简单的小分子，从胞内释放出来，提高了可生化性。

从图6可以看出，在嗜热芽孢杆菌DF7溶解头孢菌渣的过程中，蛋白酶的活性显著高于淀粉酶的活性，蛋白酶活性的最大值为 25u/mL，而淀粉酶为2.9u/mL，表明抗生素菌渣的溶解率与蛋白酶和淀粉酶活性密切相关，并且蛋白酶和淀粉酶的联合作用促进了抗生素菌渣细胞的裂解，而蛋白酶活性在溶解抗生素菌渣细胞的过程中占有主导作用。

其中，蛋白酶活性定义为：1mL酶液，在一定温度和pH条件下（本专利采用60℃、pH7.0），1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/mL表示；

淀粉酶活性定义为： 1mL酶液，在一定温度和pH条件下（本专利采用60℃、pH7.0）与底物反应，在反应时间（5min）内生成1mg麦芽糖为一个酶活力单位以u/mL表示。

实施例5 嗜热芽孢杆菌DF7在水解其他抗生素菌渣

方法同实施例4，土霉素菌渣和青霉素菌渣进行处理。实验表明，嗜热芽孢杆菌DF7不仅可以高效水解头孢菌渣，对土霉素菌渣的水解也可达68%~70%，对青霉素菌渣的水解可达70%~74%。

根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 一种嗜热芽孢杆菌DF7菌株及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1489

<212> DNA

<213> Bacillus thermocopriae

<400> 1

caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggaccaa tagaagcttg 60

cttctgttgg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg 120

gataacttcg ggaaaccgga gctaataccg gataattcat cccctcgcat gagggggtgc 180

tgaaagtcgg ttcacgctga cacttacaga tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtga 240

ggtaatggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300

ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga 360

cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag cgatgaaggc cttcgggtcg taaagctctg 420

ttgttaggga agaacaagta ccggagtaac tgccggtacc ttgacggtac ctaaccagaa 480

agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg 540

aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg tcctttaagt ctgatgtgaa agcccacggc 600

tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg gacttgagtg cagaagagga aagcggaatt 660

ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt 720

ctggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 780

ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct 840

gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg 900

aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960

accttaccag gtcttgacat ccttacgacc tccctagaga tagggatttc cccttcgggg 1020

gacggaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg 1140

tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200

gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtcg 1260

agccaatccc ataaaaccat tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag 1320

ccggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380

cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taacctttat 1440

ggagccagcc gcctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaaca 1489

Claims (4)

1.一种热堆肥芽孢杆菌（Bacillus thermocopriae）DF7菌株，其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年9月11日，保藏编号为CGMCC No.16459。

2.一种权利要求1所述的菌株在处理抗生素菌渣中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）取一环冷冻保存的热堆肥芽孢杆菌DF7菌株接种于固体培养基中，在60℃、150r/min的恒温摇床上通气培养24h，获得活化后的热堆肥芽孢杆菌DF7；

（2）取一环活化后的热堆肥芽孢杆菌DF7接种于液体培养基中，在60℃下培养24h，获得热堆肥芽孢杆菌DF7菌液；

（3）取50mL的热堆肥芽孢杆菌DF7菌液的上清液，投加入含水率为95%~98%的抗生素菌渣中，得到100mL的混合液，将混合液置于60℃水浴孵育4h，完成抗生素菌渣微生物水解。

4.一种权利要求1所述的菌株在溶解细菌中的应用。

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