KR20160089221A - 음식물류 폐기물에 대한 분해능이 우수한 신규한 미생물 균주 - Google Patents
음식물류 폐기물에 대한 분해능이 우수한 신규한 미생물 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 음식물 폐기물의 발효소멸용 미생물 균주에 관한 것으로서, 하수처리장의 활성오니로부터 성장이 빠른 균주들을 분리하고, 이들을 대상으로 고분자 유기탄소화합물에 대한 효소활성을 측정하는 방식으로 선정된 Bacillus subtilis strain KHNS-1 균주(이하 KHNS-1 균주라 한다)에 관한 것이다. 상기 균주는 16S rRNA 염기서열 분석을 거친 후 미생물자원센터(기탁번호 KCTC 12737BP)에 기탁되었다. 본 발명에 따른 KHNS-1 균주는 종래기술에서 보고된 타 균주들과 비교하여 볼 때 넓은 pH 범위에서, 그리고 높은 염분 농도에서도 성장할 수 있는 장점이 있다. 또한 KHNS-1 균주는 고분자 유기화합물에 대한 효소활성이 매우 우수하여 탄수화물, 섬유소, 지질, 단백질류 기질을 분해하여 단위체(monomer)로 신속하게 전환시킬 수 있고, 이렇게 발생한 단량체들을 이산화탄소로 완전히 분해할 수 있는 특징을 가지고 있다.
Description
본 발명은 생활 폐기물 중 유기성 폐자원인 음식물찌꺼기의 발효 소멸화를 위한 신규한 균주 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것이다.
우리나라에서 매일 발생되는 음식물류 폐기물(이하 음폐물이라 한다)은 14,000여 톤(환경부, 2010년 기준)으로 전체 쓰레기 발생량의 28.7%를 차지하고 있으며, 음식문화, 생활수준의 향상, 식생활의 고급화 등으로 매년 3% 가량 증가하는 추세에 있다(환경부, 2014). 음폐물은 막대한 경제적 손실을 가져오고 있는데, 매년 처리비용 8천억 원, 연간 20조원 이상의 경제적 손실 (식량자원 가치)을 초래하고 있을 뿐 아니라 온실가스 배출(연간 885만 톤 CO2e), 악취 발생, 음식물폐수 (음폐물 중량의 5.8%)로 인한 수질오염 등 주요한 환경오염을 야기시키고 있다.
현재 분리 수거되는 음폐물은 자원화(사료화 47.4%, 퇴비화 38.1%), 소각(소각물의 13.2%), 매립(매립물의 9.63%)으로 처리되고 있으나, 종량제의 합리적 운영을 위한 정책적 지원 및 관리체계의 부족, 사회·환경적 문제, 종량제 실시에 따른 각 배출원의 경제적 부담, 처리방법의 편리성에 대한 필요성으로 음폐물을 처리할 수 있는 다양한 기술 개발 및 그 기술의 실생활 적용에 대한 수요가 점점 높아져 가고 있는 실정이다.
2013년 환경부는 자원순환사회로의 전환을 위한 '2020년까지 재활용자원 매립 제로화' 정책을 발표함으로써 발생하는 모든 음폐물의 자원화는 의무사항이 되었고, 폐기물은 발생원에서 분리하여 직접 처리, 최소화되는 것이 가장 효율적, 경제적, 환경친화적이라는 결론에 도달하게 됨에 따라 가정용 음폐물 처리기에 대한 관심이 높아지기 시작했다. 이에 다양한 업체에서 가정용 음폐물 처리기를 개발하여 출시하고 있으며, 크게 열풍건조식, 분쇄건조식, 냉동보관방식, 가정용 음식물분쇄기 (디스포저) 방식, 미생물발효소멸방식으로 분류된다. 그러나 미생물발효소멸방식을 제외한 타 처리기술은 그 처리산물을 수거하여 2차 처리나 매립을 해야 하기 때문에 정부의 자원순환형 폐기물관리정책에 부응하지 못한다는 문제점을 갖는다. 따라서 지속가능한 폐기물 관리 전략에 있어서 발생량 감소와 재활용을 제외한다면 최우선 순위 또한 가정용 미생물발효소멸을 이용한 퇴비화라는 것을 알 수 있다.
그러나 미생물 발효소멸방식 음폐물 처리기의 장점에도 불구하고 아직 가정용 및 소규모 음폐물 처리기의 이용률은 미미한 수준에 머물고 있는데 이는 악취 발생, 사용하는 미생물제재의 낮은 활성도로 인한 불완전 소멸화, 소음, 전기료, 사용의 불편함으로 인한 소비자들의 낮은 신뢰성 때문인 것으로 분석된다. 현재까지 개발된 음폐물 처리기는 극히 초보적 수준으로, 음폐물 분해 과정은 블랙박스로 간주하여 오로지 유입과 유출의 관계만을 고찰의 대상으로 삼기 때문에 발효능 평가나 발효물의 수분함량조차 고려하지 않은 채 감량 여부만으로 발효소멸 되었다고 주장하고 있는 경우가 대부분이다. 속성발효를 위해 50~60℃의 온도에서 성장이 가능한 미생물 균주를 확보하여 접종하여도 미생물의 발효소멸 능력, 함수율, 산소 공급 등이 적절한 유지되지 않는 조건에서는 단순건조 또는 부분발효-건조가 이루어지고 있는 경우가 대부분인 것으로 분석되고 있다. 이러한 분석을 단적으로 증명하는 것이 발효과정에서 발생하는 극심한 악취이다. 악취발생은 음폐물의 완전한 분해가 이루어지지 않고 건조가 진행됨에 따른 현상이며, 특히 단백질 및 지질의 분해가 완전하게 이루어진다면 악취 발생 또한 발효소멸이 이루어지는 장치 내에서 최소화 될 수 있다.
따라서 가정용 음폐물 처리기의 이용을 국내에 성공적으로 정착시키기 위해서는 음폐물을 완전하게 발효소멸 시킬 수 있는 미생물의 확보가 가장 중요한 요인임을 알 수 있다. 음폐물 처리에 바람직한 미생물이 갖추어야 할 필수조건으로는 첫째, 음식물을 구성하는 탄소원인 탄수화물, 지질, 단백질 고분자화합물을 분해할 수 있는 체외효소(extracellular enzyme)인 amylase 및 cellulase, lipase, protease 활성도가 높아야 하며, 둘째, 이러한 효소 활성에 의해 생산된 분해산물인 단당류, glycerol 및 지방산, 아미노산을 이산화탄소와 물로 완전히 분해할 수 있는 높은 활성을 가져야 한다.
현재까지 음폐물의 발효소멸용 미생물로 개발된 다양한 미생물들의 특성을 살펴보면, 먼저 분류학적으로 세균계의 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 세라티아(Serratia), 카모박테리움(Camobacterium), 아트로박터(Arthrobacter), 방선균(actinomycetes) 속 등, 그리고 진핵생물계의 효모 (Candida, Saccharomyces 속) 등이 있으며 가장 많은 비중(70% 수준)을 차지하는 특허 미생물은 바실러스 속이다. 바실러스 속 세균은 녹말, 섬유소, 지질, 단백질과 같이 세포 내로 흡수될 수 없는 고분자화합물을 체외효소를 이용하여 단위체(monomer)로 분해하는 활성이 매우 우수한 세균으로 널리 알려져 있는 세균이다.
음폐물을 분해하는 바실러스 속 세균과 관련한 종래기술로는 다음을 들 수 있다.
대한민국 등록특허 10-0424419에 개시된 '유기물 분해능이 우수한 신규 바실러스 에스피 균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리방법'이 알려져 있다(특허문헌 1).
또한 대한민국 등록특허 10-0443267에 개시된 '폐유기물 분해활성이 우수한 신균주 바실러스리케니포미스 H-3'가 알려져 있다(특허문헌 2).
또한 대한민국 등록특허 10-0805036에 개시된 '음식물쓰레기의 발효소멸 능력을 보유한 신규한 균주바실러스 세레우스 이엔비-02 및 미생물제제'가 알려져 있다(특허문헌 3).
또한 대한민국 등록특허 10-0879131에 개시된 '바실러스 액시디콜라(Bacillus acidicola) SH-1 균주 및 그를 이용한 음식물쓰레기 퇴비화 방법'이 알려져 있다(특허문헌 4).
또한 대한민국 등록특허 10-0452125에 개시된 '음식물쓰레기의 발효소멸화 능력을 보유한 신규한 균주 바실러스 서브틸리스 BRD-007 및 이를 이용한 음식물 쓰레기의 발효 소멸화용 미생물제제'가 알려져 있다(특허문헌 5).
상기 종래기술의 특허문헌 1 내지 5에서 설시된 균주들은 각각 고유한 특성을 지니고 있으나, 전분, 섬유소, 지방, 단백질 모두에 대해 우수한 분해능을 보유하지는 못한 것으로 평가되고 있다. 이러한 연유로, 종래기술을 사용할 경우 다양한 소스로부터 발생되는 음식물 폐기물에 대한 발효소멸 효율이 낮은 문제점을 지니고 있어 이를 해결해줄 수 있는 신규한 균주를 확보하여야 할 필요성이 대두되고 있다.
본 발명자들은 종래기술에서 보고된 음폐물 발효소멸 균주들이 가지고 있는 문제점을 극복할 수 있는 균주를 확보하기 위하여 용인시 하수처리장의 활성오니를 음폐물에 접종하여 가정용 음폐물 처리기에 투입한 후 30일간 상온에서 운전하며 우점 미생물을 분리하고 이 균주들의 음폐물 분해가능성을 타진하는 실험을 수행하였다. 이 실험을 통하여 선별된 KHNS-1 균주는 균주의 최적 성장 조건, 음식물 분해활성 및 고분자 유기탄소화합물 분해효소 활성의 측면에서 음식폐기물의 발효소멸에 적합함을 발견하여 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 따른 Bacillus subtilis strain KHNS-1 균주(기탁번호: KCTC 12737BP, 이하 KHNS-1 균주라 한다)는 성장 가능한 pH 범위가 넓고, 타 균주에 비하여 높은 염분 농도에서도 성장할 수 있으며 탄수화물, 섬유소, 지질, 단백질류 기질을 분해하여 단위체(monomer)로 신속하게 전환할 수 있는 능력이 우수하며, 이렇게 발생한 단량체들을 이산화탄소로 완전히 분해하는 특징을 가지고 있는바 음식폐기물의 발효소멸용 미생물제재에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 온도 변화에 따른 nutrient agar 배지에서의 성장을 나타낸다.
도 2는 pH 변화에 따른 nutrient broth 배지에서의 성장을 나타낸다.
도 3은 NaCl 농도 변화에 따른 nutrient broth 배지에서의 성장을 나타낸다.
도 4는 KHNS-1 균주에 의한 starch 분해를 나타낸다.
도 5는 KHNS-1 균주에 의한 cellulose 분해를 나타낸다. 여기서 A는 CMCase 활성도 변화 그래프, B는 CMC 분해 중 CO2 발생 그래프이다.
도 6은 KHNS-1 균주에 의한 skim milk 및 lard 분해과정 중 CO2 발생(45℃)을 나타낸다. 여기서 A는 skim milk(0.5%) 분해를 통한 CO2 발생 그래프, B는 lard(0.5%) 분해를 통한 CO2 발생 그래프이다.
도 7은 KHNS-1 균주에 의한 lard의 분해 및 성장을 나타낸다.
도 8은 phosphate buffer(10㎖)에 음식혼합물 (건조중량 0.92g)을 유일탄소원으로 첨가한 액체배지(A, B) 및 고체배지(C, D)에 KHNS-1 균주를 접종하여 45℃에서 1일 배양한 후 음식물 잔류량 및 성장 비교를 나타낸 것이다.
도 9는 KHNS-1 균주에 의한 음식혼합물 분해로서, 음식혼합물이 2.5%(건조중량 0.33g) 첨가된 phosphate buffer에 KHNS-1 균주에 의한 음식물 분해 및 CO2 발생을 나타낸다.
도 2는 pH 변화에 따른 nutrient broth 배지에서의 성장을 나타낸다.
도 3은 NaCl 농도 변화에 따른 nutrient broth 배지에서의 성장을 나타낸다.
도 4는 KHNS-1 균주에 의한 starch 분해를 나타낸다.
도 5는 KHNS-1 균주에 의한 cellulose 분해를 나타낸다. 여기서 A는 CMCase 활성도 변화 그래프, B는 CMC 분해 중 CO2 발생 그래프이다.
도 6은 KHNS-1 균주에 의한 skim milk 및 lard 분해과정 중 CO2 발생(45℃)을 나타낸다. 여기서 A는 skim milk(0.5%) 분해를 통한 CO2 발생 그래프, B는 lard(0.5%) 분해를 통한 CO2 발생 그래프이다.
도 7은 KHNS-1 균주에 의한 lard의 분해 및 성장을 나타낸다.
도 8은 phosphate buffer(10㎖)에 음식혼합물 (건조중량 0.92g)을 유일탄소원으로 첨가한 액체배지(A, B) 및 고체배지(C, D)에 KHNS-1 균주를 접종하여 45℃에서 1일 배양한 후 음식물 잔류량 및 성장 비교를 나타낸 것이다.
도 9는 KHNS-1 균주에 의한 음식혼합물 분해로서, 음식혼합물이 2.5%(건조중량 0.33g) 첨가된 phosphate buffer에 KHNS-1 균주에 의한 음식물 분해 및 CO2 발생을 나타낸다.
본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 미생물 균주는 하수처리장의 활성오니로부터 성장이 빠른 균주들을 분리하고, 이들을 대상으로 고분자 유기탄소화합물에 대한 효소활성을 측정하는 방식으로 선정된 것이다. 분리된 세균들 중 음식물 분해활성 및 고분자 유기탄소화합물 분해효소 활성이 가장 높은 것은 KHNS-1 균주였다. 상기 균주에 대한 16S rRNA 염기서열 분석결과, 이 균주는 Bacillus subtilis strain CH16 16S ribosomal RNA gene, partial sequence(GenBank accession KM492825)와 100% 유사성을 갖는 것으로 분석되었다.
본 발명에 따른 KHNS-1 균주는 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12737BP로 기탁되었다. 한편, Bacillus subtilis strain CH16 균주는 닭의 성장촉진을 위한 사료첨가용 probiotic 균주로 사용하기 위해 닭의 내장에서 분리된 세균으로서, 본 발명 연구를 통해 음폐물의 분해용도로서 확보된 KHNS-1 균주와는 그 용도가 전혀 다르다고 할 수 있을 것이다.
균주의 분리 및 선별실험
본 발명 출원인인 (주)건호내츄럴시스템에서 개발 중인 가정용 음폐물처리기에 업체에서 제공하는 부양물질 1.7㎏에 증류수 300㎖를 첨가하여 1일간 교반 한 후, 용인시 하수처리장의 활성오니 500g을 2일차 및 3일차에 각각 접종하여 37~40℃에서 교반하였다. 4일차부터 매일 음식 혼합물 500g(밥 300g에 오이, 감자, 양파 각 50g씩, 생선 50g으로 총 건조 중량은 153.5g)을 첨가하며 30일간 운전한 후, 음폐물처리기에 잔류하는 퇴비를 시료로 하여 균주 분리를 시도하였다. 균주 분리는 30일간 운전한 음폐물처리기의 퇴비시료를 멸균수로 단계별로 희석한 후 0.1㎖를 nutrient agar 배지(0.5% peptone, 0.3% beef extract, 1.5% agar, pH 7.0)에 도말하여 35℃에서 배양하였다. 배양 후 1일차부터 균주의 성장 및 형태를 관찰하면서 성장이 빠른 균주를 선택하여 동일 배지에 계대배양하는 방법을 통하여 다양한 세균의 순수분리를 수행하였다.
분리된 균주들은 음식물 분해능 배지(상기 음식혼합물 3g + phosphate buffer 10㎖, KH₂PO₄ 0.01%, MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.01%, (NH4)2SO4 0.01%, pH 7.0)에 접종하여 음식물 소멸정도를 비교, 평가하였다. 또한 고분자 유기탄소화합물에 대한 효소활성을 확인하기 위하여, amylase 배지(peptone 0.05%, MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.01%, (NH4)2SO4 0.01%, NaH2PO4 0.01%, starch 2%, agar 1.5%, pH 7.0), cellulase 배지(KH₂PO₄ 0.01%, MgSO4·7H2O 0.05%, NaCl 0.05%, FeSO4·7H2O 0.001%, MnSO4·7H2O 0.001%, NH4NO3 0.03%, CMC 1%, agar 1.5%, pH 7.0), lipase 배지(tributyrin 1%, peptone 0.5%, yeast extract 0.3%, agar 1.2%, pH 7.5), protease 배지(skimmed milk 0.5%, peptone 0.6%, beef extract 0.3%, agar 1.5%, pH 7.0)에 접종하여 45℃에서 1일 배양한 후, 균 성장부위 주변에 형성되는 clear zone의 지름을 측정, 비교하여 분해활성을 평가하였다.
위에 기술된 방법을 이용하여 분리된 세균 중 KHNS-1 균주가 가장 음식물 분해활성 및 고분자 유기탄소화합물 분해효소 활성이 가장 높은 것으로 선별되었으며, 이후 모든 실험을 KHNS-1 균주를 이용하여 수행되었다.
KHNS
-1 균주의 효소 활성도 평가
KHNS-1 균주의 amylase, cellulase, protease 및 lipase 활성을 각각 starch, cellulose, skim milk, trybutyrin을 유일 탄소원으로 하는 agar 배지에 접종하여 35℃에서 1일간 배양한 후 형성되는 clear zone의 지름을 측정하여 평가하였다.
이에 더하여, KHNS-1의 amylase 및 cellulase 효소활성을 더욱 세밀하게 평가하기 위하여 액체배지를 이용한 실험을 수행하였다; amylase 활성은 starch 2%가 첨가된 phosphate buffer(MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.01%, (NH4)2SO4 0.01%, NaH2PO4 0.01%, yeast extract 0.05%, pH 7.0) 배지에 KHNS-1 균주를 접종한 후 45℃에서 배양하며 배양액 내의 전분 농도를 정량하기 위해 적절히 희석된 시료 1㎖에 iodine 시약 20㎕를 첨가하여 반응시킨 후 반응물의 청색 흡광도를 680㎚에서 측정하였다. Cellulase 활성을 측정하기 위하여 carboxymethyl cellulose(CMC) 1%를 포함하는 액체배지(yeast extract 0.05%, KH2PO4 0.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, NaCl 0.05%, FeSO4·7H2O 0.001%, MnSO4·H2O 0.001, NH4NO3 0.03%, pH 7.0)에 KHNS-1을 접종한 후 45℃에서 배양하며 일정 시간 간격으로 배양액 1㎖를 취하여 원심분리 하였다(5,000rpm, 4℃에서 20분). 상등액 25㎕와 CMC 용액 25㎕(1.0% in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 혼합하여 50℃에서 60분간 반응시킨 후 150㎕의 3,5-dinitro salicylic acid(DNS) 시약을 첨가하여 10분간 끓인 후 546㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 포도당을 사용하였고 CMCase 1 unit은 1분 동안 1μmole의 포도당을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. KHNS-1 성장에 있어서 최적 온도 및 pH 범위를 측정하기 위하여 25~55℃, pH 4~9, NaCl 농도 0~8% 조건에서 성장을 비교 분석하였다.
KHNS
-1 균주에 의한 고분자
유기탄소화합물의
완전 분해능 평가
일반적으로 Bacillus 속 세균은 탄수화물, 핵산, 단백질, 지질 등과 같은 고분자 화합물을 분해할 수 있는 체외효소를 분비하여 당이나 아미노산 같은 쉽게 사용할 수 있는 기질로 전환하는 능력이 우수한 것으로 알려져 있다(Madigan 등, 2012). 그러나 이 과정을 통해 고분자 화합물이 세균에 의해 에너지원이나 탄소원으로 이용되거나 CO2로 완전히 분해되는 것이 아니므로 고분자화합물을 유일 탄소원으로 하는 조건에서 세균의 성장이 일어나는 동시에 CO2가 최종분해산물로 발생되는지를 평가할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 starch, cellulose, trybutyrin, skim milk, 음식물 혼합물을 유일탄소원으로 하는 배지에서 KHNS-1 균주의 성장 및 CO2 발생 여부를 조사하였다. starch, cellulose, trybutyrin, skim milk, 음식물 혼합물을 유일탄소원으로 하는 배지로는 '균주의 분리 및 배양'에 기술된 배지가 사용되었으며 CO2 발생을 정량적으로 분석하기 위해 127㎖ serum bottle에 배지 20㎖를 첨가한 후 grey rubber stopper와 aluminum seal을 이용하여 완전히 밀봉한 후 45℃에서 배양하며 배양용기의 head space 내의 CO2 농도 변화를 분석하였다. CO2 농도 측정은 TCD가 장착된 gas chromatography(HP 6890, Agilent)를 이용하여 수행하였다.
실험결과 1. 온도 조건에 따른
KHNS
-1 균주의 성장
도 1에서 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주는 45℃에서 6~8 시간 배양 후 정지기 (stationary phase)에 도달하였으며 25℃, 35℃, 55℃에서는 각각 12시간, 10시간, 10시간 배양 후 최대 흡광도에 도달하였다. 지수성장기의 세균 농도 또한 45℃에서 가장 높게 관찰되었다.
KHNS-1 균주의 성장 가능 온도 범위를 타 연구에 제시된 Bacillus 속 계통의 음식물 분해세균의 온도 범위와 비교 분석하고자 하였으나 성장온도 자료를 제공한 자료는 pH나 염분 농도 자료에 비해 제한적일 뿐 아니라 성장에 대한 평가 기준이 제시되어 있지 않아 명확한 비교가 불가능하였다. 비교가 가능한 Bacillus subtilus(KFCC 11325, KCCM-10658P)는 30℃~50℃ 온도 범위에서 최상의 성장을 보이는 것으로 보고되고 있으나 KHNS-1 균주는 두 균주에 비해 성장 가능 온도 범위가 다소 좁은 것으로 관찰되었으며 최적 온도는 45℃인 것으로 분석되었다. 일반적으로 음폐물 처리기는 음폐물의 분해소멸을 촉진시키기 위해 고온 조건을 유지하고 있는데 적정 온도에서 최적 성장 및 분해능을 가지고 있는 균주는 처리기의 고온 유지를 위한 에너지 소비를 줄일 수 있다는 장점을 가지게 된다.
| 온도(℃) | ≤25 | 35 | 45 | 55 | 60 | ≥70 |
| KHNS-1 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KCTC 12737BP) |
++ | +++ | +++ | ++ | - (≥60) |
|
| KB-68 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KFCC 11325) |
+++ | +++ (30℃) |
+++ (40℃) |
+++ (50℃) |
+ | |
| AF-333 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KCCM-10658P) |
+++ | +++ (30℃) |
+++ (40℃) |
+++ (50℃) |
++ |
실험결과 2. pH 조건에 따른
KHNS
-1 균주의 성장
도 2에서 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주의 성장은 pH 7, 8에서 유도기(lag phase)가 거의 없이 가장 빠르게 일어나는 것으로 관찰되었다. pH 6에서는 약 3시간 정도, pH 5와 9에서는 약 4시간의 유도기를 거친 후 성장이 일어났으나 지수성장기에 이르기까지 소요되는 시간이나 최대 세균 농도는 pH 5~9 범위에서 전체적으로 유사하게 나타났다. 그러나 pH 4에서는 성장이 관찰되지 않았다.
KHNS-1 균주의 성장 가능 pH 범위를 타 연구에 제시된 Bacillus 속 계통의 음식물 분해세균의 pH 범위와 비교 분석하고자 하였으나 pH 자료를 제공한 자료는 성장 온도나 염분 농도 자료에 비해 극히 제한적이었다. 비교가 가능한 Bacillus licheniformis(KCCM 11560) 균주에 비해 성장 가능한 pH 범위가 넓고 성장 또한 우수한 것으로 평가된다.
| pH | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| KHNS-1 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KCTC 12737BP) |
- | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| Bacillus licheniformis (기탁번호: KCCM 11560) |
- | ++ | ++ | +++ | ++ | - | - |
실험결과 3. 염분 농도에 따른
KHNS
-1 균주의 성장
도 3에서 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주는 염분 농도 2% 범위 내에서 유도기(lag phase)가 거의 없이 성장이 빠르게 일어나는 것으로 관찰되었다. 염분농도 4%, 6%에서는 약 2-3 시간 정도의 유도기를 거친 후 성장이 일어났으나 지수성장기에 이르기까지 소요되는 시간이나 최대 세균 농도는 NaCl 농도 0~6% 범위에서 전체적으로 유사하게 나타났다. 그러나 NaCl 농도 8%에서는 최대성장이 0~6% 범위 값의 30% 이하 수준인 것으로 관찰되었다.
KHNS-1 균주의 성장 가능 염분 농도범위를 타 연구에 제시된 Bacillus 속 계통의 음식물 분해세균의 활성과 비교 분석한 자료를 표 3에 제시하였다. 우리나라 음식의 특성 때문인지 온도나 pH에 대한 연구보다는 염분도의 영향을 조사한 자료를 다수 확인할 수 있었다. 표 3에 제시된 바와 같이 KHNS-1 균주는 타 균주와 비교하여 볼 때 높은 염분 농도에서 성장을 할 수 있는 상위 그룹의 균주라는 것을 확인할 수 있다.
| NaCl 농도(%) | ≤2 | 4 | 6 | 8 | ≥10 |
| KHNS-1 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KCTC 12737BP) |
+++ | +++ | ++ | + | |
| KB-68 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KFCC 11325) |
+++ | +++ | ++ (7%) |
- | |
| AF-333 (Bacillus subtilis) (기탁번호: KCCM-10658P) |
+++ | +++ | ++ (7%) |
- | |
| Bacillus licheniformis (기탁번호: KCCM 11560) |
+++ | ++ | - | - | |
| Geobacillus thermoglucosidasius (기탁번호: KCCM 41418) |
+++ | ++ | + | - | |
| Bacillus cereus ENB-02 (기탁번호: KACC 9131P) |
+++ (3%) |
+++ (5%) |
+ | - | |
| Bacillus smithii (기탁번호: KACC 1161P) |
+++ (0%) |
++ | + | - | |
실험결과 4.
KHNS
-1 균주의 starch 분해능
도 4에서 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주의 starch 분해능은 매우 우수한 것으로 밝혀졌는데 액체배지에 1% 농도로 존재하는 starch가 분해되는데 10시간 정도 소요되었으며(45℃) 이때 starch의 분해속도는 1.23~1.54 g/h/L로 측정되었다.
실험결과 5.
KHNS
-1 균주의 cellulose 분해능
도 5에서 나타난 바와 같이, carboxymethyl cellulose(CMC) 1%가 첨가된 phosphate buffer에 KHNS-1 균주를 접종한 후 45℃에서 65시간 동안 배양액에 존재하는 CMCase의 활성도 변화 및 CMC가 분해되는 과정에서 발생되는 CO2의 량을 측정하였다. KHNS-1 균주의 CMCase 활성은 배양을 시작한 지 약 15시간 후부터 측정이 되었으며 배양 후 48시간이 지나 최고에 도달하는 것으로 분석되었다. 이 때, CMCase의 활성에 의해 생산된 glucose는 KHNS-1 균주에 의해 CO2로 완전히 분해되는 것으로 확인되었다.
실험결과 6.
KHNS
-1 균주의 skim milk 및 lard 분해능
도 6의 A에 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주가 skim milk를 유일탄소원으로 하여 성장을 하는 것으로 확인되었으나 skim milk가 CO2로 완전히 분해되는지를 확인하기 위하여 phosphate buffer 배지에 유일탄소원으로 skim milk(0.5%)를 첨가한 후 배양과정 중 발생하는 CO2를 분석한 결과 skim milk가 완전히 CO2로 분해됨을 확인하였다.
Lipase 활성을 조사하는 방법으로 tributyrin (C15H26O6)을 기질로 하는 tributyrin agar 배지법이 널리 사용되고 있다. 그러나 tributyrin은 glycerol 한 분자에 butyric acid 3 분자가 에스터 결합에 의해 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 매우 간단한 지질에 해당되기 때문에 음식폐기물에 주로 존재하는 동물성지방을 대표하는 물질로는 부족한 부분이 존재한다. 따라서 본 연구에서는 일차적으로 tributyrin agar 배지를 이용한 lipase 활성 평가 외에 KHNS-1 균주가 대표적 동물성 지방인 lard(돼지 기름)를 유일 탄소원으로 하는 액체배지에서 성장 및 CO2를 발생하는지 평가하였다.
도 6의 B 및 도 7에서 나타난 바와 같이, lipase에 의해 생산된 유기산들이 KHNS-1 균주에 의해 CO2로 완전히 분해됨을 확인하였다.
실험결과 7.
KHNS
-1 균주에 의한 음식 혼합물 분해
도 8에서 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주는 음식 혼합물을 유일 탄소원으로 하여 45℃에서 1일간 배양하였을 때 효율적으로 음식물을 분해하는 것으로 관찰되었다.
도 9의 A에 나타난 바와 같이, 다양한 고분자 유기화합물의 혼합체인 음식물을 기질로 하여 KHNS-1 균주를 45℃에서 24시간 배양할 때, 배양액 내 용존유기물의 농도(COD)와 잔류물의 무게 변화를 조사하였다. 총 건조중량 0.33g의 음식혼합물을 45℃에서 24시간 진탕한 대조구에서는 배양액으로 용출된 용존성 유기물 농도가 COD 4007.3㎎/L, 잔존물이 0.23g(건조중량) 회수되었으나, KHNS-1 균주가 접종된 시험구에서는 배양액 내 유기물 농도가 COD 2380.3㎎/L, 잔존물이 0.08㎎(건조중량) 회수되었다. 24 시간동안 KHNS-1 균주에 의한 음식혼합물 감소율은 고형물의 경우에는 65%, 용존성 유기물의 경우에는 41%로 분석되었다.
도 9의 B에 나타난 바와 같이, KHNS-1 균주에 의한 음식혼합물 분해의 최종산물이 CO2임을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 본 연구에서 분리된 KHNS-1 균주가 기존에 보고된 음식물 분해활성이 있는 세균들과 비교하여 볼 때 효소활성이 매우 우수하여 탄수화물, 지질, 단백질류 기질을 분해하여 단위체(monomer)로 신속한 전환이 가능하고 이렇게 발생한 단량체들을 이산화탄소로 완전히 분해할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 현재까지 특허 출원된 균주 중 기질을 CO2로 전환하는 자료를 제시하고 있는 특허는 극히 제한적인데(공개번호 10-2004-0009090, 10-2005-0094769), 두 특허의 경우 모두 혼합 음식폐기물을 기질로 할 때의 CO2 발생량을 제시하고 있을 뿐 탄수화물, 단백질, 지질 등 단일 기질군으로부터의 CO2 발생에 대한 자료는 제시하지 않고 있다. 그러나 음식폐기물 분해용 균주가 다양한 기질을 CO2로 전환할 수 있는 능력의 증명은 음식폐기물의 발효소멸용 미생물제재로 적용될 균주가 가져야 하는 매우 필수적인 특징이라 할 수 있다.
<110> Kun-ho Natural System Co., Ltd.
KIM, Do Youn
<120> NOVEL MICROBE STRAIN FOR DECOMPOSING FOOD WASTES
<130> 10156
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1103
<212> RNA
<213> Bacillus subtilis strain KHNS-1
<400> 1
tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60
ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc 120
agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg 180
cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 240
catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag 300
tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360
acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg 420
gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc 480
ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc 540
agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg 600
cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660
cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc 720
gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc 780
ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt 840
cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct 900
tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt 960
accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt acttgttctt ccctaacaac agagctttac 1020
gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga 1080
agattcccta ctgctgcctc ccg 1103
Claims (1)
- 음식물류 폐기물을 처리하기 위한 미생물 제제로서, Bacillus subtilis strain KHNS-1 균주(기탁번호 KCTC 12737BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
Priority Applications (1)
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| KR1020150008906A KR20160089221A (ko) | 2015-01-19 | 2015-01-19 | 음식물류 폐기물에 대한 분해능이 우수한 신규한 미생물 균주 |
Applications Claiming Priority (1)
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ID=56617111
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN109609407A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-12 | 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 | 一种用于原位污泥减量的嗜热微生物菌株及其应用 |
| KR102239963B1 (ko) * | 2020-04-02 | 2021-04-14 | 주식회사테라바이오 | 기탁번호 kctc18808p로 기탁된 고농도 유기물 발효 및 분해용 기능성 미생물 조성물 배양방법 및 이를 이용한 미생물 조성물 |
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